आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सेंसर का उपयोग Glutamine फ्लक्स इमेजिंग

Summary

यह लेख झल्लाहट का उपयोग जीवित कोशिकाओं में glutamine गतिशीलता की निगरानी करने के लिए प्रदर्शन करेंगे. आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सेंसर एक subcellular संकल्प में जैविक अणुओं के वास्तविक समय की निगरानी की अनुमति. प्रायोगिक डिजाइन, प्रयोगात्मक सेटिंग्स के लिए तकनीकी जानकारी, और बाद प्रयोगात्मक विश्लेषण के लिए विचार आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग glutamine सेंसर के लिए चर्चा की जाएगी.

Abstract

आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सेंसर एक subcellular संकल्प में जैविक अणुओं के वास्तविक समय की निगरानी की अनुमति. जैविक अणुओं के लिए इस तरह के सेंसर की एक जबरदस्त किस्म कई प्रयोगशालाओं में नियमित तौर पर उपयोग किया जाता है कि अनिवार्य उपकरण बन गया है, जिनमें से कुछ पिछले 15 साल में उपलब्ध हो गया.

आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सेंसर की रोमांचक अनुप्रयोगों में से एक सेलुलर परिवहन प्रक्रियाओं की जांच में इन सेंसरों का इस्तेमाल होता है. ऐसे कैनेटीक्स और सब्सट्रेट specificities के रूप में ट्रांसपोर्टरों के गुण परिवहन गतिविधियों के सेल प्रकार विशिष्ट विश्लेषण के लिए संभावनाओं को उपलब्ध कराने, एक सेलुलर स्तर पर जांच की जा सकती है. इस अनुच्छेद में, हम ट्रांसपोर्टर गतिशीलता एक उदाहरण के रूप में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग glutamine सेंसर का उपयोग कर देखा जा सकता है कि कैसे प्रदर्शन करेंगे. प्रायोगिक डिजाइन, प्रयोगात्मक सेटिंग्स के लिए तकनीकी जानकारी, और बाद प्रयोगात्मक विश्लेषण के लिए विचारों पर चर्चा की जाएगी.

Introduction

कारण एक सेलुलर स्तर पर transcriptome और proteome की परीक्षा की अनुमति देता है कि प्रौद्योगिकी में उल्लेखनीय प्रगति करने के लिए, यह अब जैव रसायन और मेटाबोलाइट्स और आयनों के परिणामस्वरूप प्रवाह अत्यधिक सेल प्रकार विशिष्ट हैं कि स्पष्ट हो गया है. उदाहरण के लिए, स्तनधारी जिगर में, अनुक्रमिक glutamine गिरावट और संश्लेषण उत्तरार्द्ध ^1-3 में अतिरिक्त अमोनिया जबकि खपत पूर्व सेल प्रकार में यूरिया चक्र के लिए अमोनियम खिला, क्रमशः periportal कोशिकाओं और perivenous कोशिकाओं द्वारा एक साथ किया जाता है. कुछ मामलों में, महत्वपूर्ण जैव रासायनिक विविधता भी एक एकल "सेल प्रकार" ^{4, 5} में पता चला है. ऐसे स्थानिक विशिष्टता के अलावा, मेटाबोलाइट्स और आयनों की सेलुलर स्तर (जैसे सीए ^{2 +} और ​​चक्रीय न्यूक्लियोटाइड रूप संकेतन अणुओं, उदाहरण के लिए) अत्यधिक गतिशील हैं. मेटाबोलाइट्स और आयनों के spatiotemporal पैटर्न अक्सर संकेत पारगमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. एममेटाबोलाइट्स और आयनों के सेलुलर गतिशीलता onitoring, तथापि, अद्वितीय चुनौती खड़ी. कई मामलों में सांद्रता में परिवर्तन तेजी से और क्षणिक, इस तरह के वृक्ष के समान spines ⁶ में 20 मिसे ~ भीतर decays जो सीए ^{2 +,} के रूप में संकेतन अणुओं के मामले के उदाहरण हैं. इसके अलावा, कोशिकाओं के भीतर और बीच जैव रासायनिक रास्ते की compartmentalization यह मुश्किल निष्कर्षण और कॉलम क्रोमैटोग्राफी / मास स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीक का उपयोग कर मेटाबोलाइट्स और आयनों की गतिशीलता यों के लिए बनाता है.

जैविक अणुओं के लिए आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सेंसर अब व्यापक रूप से प्रयोगकर्ता रहते थे कम और / या बंटे आणविक गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है कि उच्च spatiotemporal संकल्प करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं ⁽⁷ समीक्षा ^{की, 8).} इन आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सेंसर मोटे तौर पर दो श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है; तीव्रता के आधार पर सेंसर और ratiometic सेंसर. तीव्रता के आधार पर सेंसर आमतौर पर एक बाध्यकारी डोमेन और एक फ्लू से मिलकरorescent प्रोटीन (एफपीएस), और बाध्यकारी डोमेन के लिए बाध्य घुला हुआ पदार्थ फ्लोरोसेंट तीव्रता में परिवर्तन. Ratiometic सेंसर, दूसरे हाथ पर, अक्सर एक झल्लाहट जोड़ी के रूप में समारोह में कहा कि दो एफपीएस के बीच पालक प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) का लाभ लेने के. इन सेंसरों एक बाध्यकारी डोमेन और दो एफपीएस के मिलकर बनता है, और बाध्यकारी घुला हुआ पदार्थ दो एफपीएस के बीच झल्लाहट दक्षता में परिवर्तन लाती है. जैविक रूप से महत्वपूर्ण मेटाबोलाइट्स और आयनों के लिए सेंसर की एक बड़ी संख्या में पिछले एक दशक के ^{8, 9} में विकसित किया गया है.

ऐसे आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सेंसर द्वारा की पेशकश की रोमांचक संभावना से भी पहले से सेलुलर स्तर पर पता लगाने के लिए आसान नहीं था जो झिल्ली परिवहन प्रक्रियाओं के उच्च संकल्प विश्लेषण में उनके उपयोग है. आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सेंसर ऐसे सब्सट्रेट विशिष्टता और पीएच निर्भरता ^{10, 11} के रूप में परिवहन तंत्र के विश्लेषण की सुविधा. इसके अलावा, आनुवंशिक जोड़कर साथ संयोजन मेंआरएनएआई के पुस्तकालय मॉडल जीवों के लिए constructs ources जैसे, यह आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सेंसर का उपयोग उपन्यास परिवहन प्रक्रियाओं के लिए जीनोम चौड़ा खोज करने के लिए अब संभव है. दरअसल, कई मामलों ^{में 12, 13} में पहले से uncharacterized ट्रांसपोर्टरों की खोज करने के लिए आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सेंसर नेतृत्व का उपयोग.

हाल ही में, हमारी प्रयोगशाला glutamine के लिए झल्लाहट आधारित सेंसर की एक श्रृंखला विकसित की है. हम सेलुलर glutamine स्तरों ऐसे झल्लाहट glutamine सेंसर ¹⁰ का उपयोग करते हुए देखे जा सकते हैं कि प्रदर्शन किया है. इन सेंसरों glnH की सी टर्मिनी (चित्रा 1) में एक जीवाणु glutamine बाध्यकारी प्रोटीन glnH में डाला झल्लाहट दाता (mTFP1), और एक झल्लाहट स्वीकर्ता (वीनस) से मिलकर बनता है. इन सेंसरों की झल्लाहट दक्षता स्वीकर्ता / दाता तीव्रता अनुपात की कमी के परिणामस्वरूप, glutamine के बंधन पर कम. Glutamine परिवहन प्रक्रियाओं के ठीक विनियमन ऐसे neurotransm के रूप में जैविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण हैission ^{14, 15} और जिगर ^{1, 16, 17} में यूरिया चक्र के रखरखाव.

यहाँ हम एक व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति खुर्दबीन सेट अप का उपयोग कर, glutamine के लिए झल्लाहट सेंसर के साथ परिवहन गतिविधियों का विश्लेषण करने की पद्धति को दिखाते हैं. यहाँ दिखाए गए प्रयोगों के लक्ष्य के लिए एक एकल कक्ष में ट्रांसपोर्टर की गतिविधियों का पता लगाने के लिए और एक क्षणिक व्यक्त ट्रांसपोर्टर की सब्सट्रेट विशिष्टता की जांच करने के लिए कर रहे हैं.

Protocol

1. नमूना तैयार

नोट: कई मामलों में छिड़काव प्रयोगों एक निराशा का मुद्दा बन सकता है, जो कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण भाग को धो. पाली एल lysine साथ सभी सेल लाइनों, कोटिंग कवर कांच की सतहों के लिए (सतह को 0.01% समाधान के 1.0 ml/25 ² सेमी जोड़ने के लिए आवश्यक नहीं है, सेल संस्कृति ग्रेड पानी के साथ दो बार धोने,> 5 मिनट सेते हैं, और में सूखा जैव सुरक्षा कैबिनेट) सेल आसंजन को बढ़ाता है. इसके अलावा, इस्तेमाल किया सेल लाइन की जैव सुरक्षा स्तर (बीएसएल) के बारे में पता हो, और स्थानीय पर्यावरण स्वास्थ्य और सुरक्षा कार्यालय द्वारा अनुमोदित मानक परिचालन प्रक्रिया का पालन करें. इस प्रयोग में, Cos7 कोशिकाओं (चित्रा 4 देखें) कम होने के कारण अंतर्जात glutamine परिवहन गतिविधि के लिए इस्तेमाल किया गया.

1. Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में 70-80% confluency + 10% ब्रह्मांडीय बछड़ा सीरम और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, या तो 6 अच्छी तरह से संस्कृति में रखा बाँझ 25 मिमी कांच coverslips पर ~ पर बीज Cos7 कोशिकाओंडिश या 8 अच्छी तरह से गिलास नीचे स्लाइड. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ _2, 24 घंटा के लिए 100% नमी सेते हैं.
2. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार, DMEM 10% ब्रह्मांडीय बछड़ा सीरम (कोई एंटीबायोटिक दवाओं) के लिए मध्यम विकास एक्सचेंज. 100% नमी में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ ₂ हे / n आगे बढ़ें.
3. (सीएमवी प्रमोटर ¹⁰ के तहत FLIPQTV3.0 सेंसर ले जाने pcDNA3.1,) glutamine सेंसर और ^{10 से} 50 मिलीलीटर सीरम मुक्त मीडिया (Opti-सदस्य) mCherry टैग ASCT2 एनकोडिंग 0.4 मिलीग्राम प्लास्मिड डीएनए में से प्रत्येक में जोड़ें और धीरे मिश्रण.
4. 50 मिलीलीटर सीरम मुक्त मीडिया के लिए अभिकर्मक अभिकर्मक के 1 मिलीलीटर जोड़ें. 5 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं.
5. डीएनए (1.3 चरण) और अभिकर्मक अभिकर्मक (1.4 कदम) युक्त दो समाधान मिक्स और 20 मिनट के लिए सेते हैं.
6. धीरे कोशिकाओं के शीर्ष पर अभिकर्मक अभिकर्मक जोड़ने और चैम्बर कमाल से धीरे मिश्रण. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ _2, 100% नमी में 24 घंटे के लिए सेते हैं.
7. 24 घंटे के बाद, DMEM + 10% ब्रह्मांडीय बछड़ा सीरम के लिए माध्यम के आदान प्रदानपेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन की (सीसीएस) + 100 यूनिट.
8. कोशिकाओं 48-72 घंटे बाद अभिकर्मक imaged हैं.

2. छिड़काव प्रयोग

नोट: इस प्रयोग में इस्तेमाल Cos7 कोशिकाओं के लिए, छिड़काव मीडिया और चैम्बर आरटी पर रखा और परिवेश सीओ ₂ एकाग्रता थे. प्रयोग किया जा रहा कोशिकाओं उच्च तापमान और सीओ ₂ एकाग्रता नियंत्रण अस्तित्व के लिए, गरम खुर्दबीन मंच और / या एक पर्यावरण कक्ष की आवश्यकता हालांकि, अगर इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

1. छिड़काव बफर वायुसेना तैयार (माल की सूची देखें). , 50 मिलीलीटर सीरिंज को stopcocks अटैच stopcocks बंद तो छिड़काव समाधान के साथ उन्हें भरने. बफर के साथ पानी निकलने की टोंटी में सिर स्थान को भरने के लिए एक संक्षिप्त अवधि के लिए पानी निकलने की टोंटी खोलें.
2. एक छिड़काव पेंसिल के साथ 8 चैनल, गुरुत्वाकर्षण फ़ीड छिड़काव प्रणाली पर जाएँ, और तब चयन फंक्शन विकल्प के अंतर्गत "मैनुअल मोड" का चयन करें. छिड़काव पेंसिल के तहत एक बेकार कंटेनर रखें.
3. हाथ सेइसी संख्या दबाकर बंदरगाहों को सक्रिय करने और पानी युक्त 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग tubings भरने, और उसके बाद पोर्ट के करीब है. बंदरगाहों पानी से भर रहे हैं एक बार, छिड़काव प्रणाली के बंदरगाह 1-6 पर बफ़र्स वायुसेना युक्त सीरिंज सेट, और फिर stopcocks खुला. Buffers के साथ ट्यूबिंग में पानी की जगह फिर से बंदरगाहों खुले. प्रवाह की दर लगभग 0.8 मिलीग्राम / मिनट होना चाहिए.
4. प्रेस वापस "का चयन फंक्शन" मेनू पर जाने के लिए छिड़काव नियंत्रक पर एक बार रद्द. "संपादन कार्यक्रम" विकल्प को टॉगल, तो छिड़काव प्रोटोकॉल तालिका 1 में दर्शाए में लिखें. छिड़काव कार्यक्रम को बचाओ.
5. इनक्यूबेटर से बाहर कोशिकाओं ले. छिड़काव बफर के साथ दो बार धोने, और फिर मंच पर कक्षों की स्थापना की. चैम्बर के लिए छिड़काव प्रणाली से कनेक्ट करें. एक खुले चैम्बर प्रयोग किया जाता है, तो कक्ष से छिड़काव समाधान निकाल देता है कि एक और पंप की स्थापना की.
6. Slidebook सॉफ्टवेयर खोलें. एक नई स्लाइड प्रारंभ करें.
   नोट:निम्नलिखित प्रक्रिया Slidebook सॉफ्टवेयर के लिए विशिष्ट है, लेकिन इस तरह के MetaFluor और एनआईएस तत्व के रूप में अन्य सॉफ्टवेयर भी यहाँ वर्णित इमेजिंग के प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सिद्धांततः प्रयोगों समय पाठ्यक्रम इमेजिंग की अनुमति देता है कि किसी भी सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है, और छवि दृश्यों ऐसे ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) या फिजी के रूप में सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के बाद प्रयोगात्मक विश्लेषण किया जा सकता है (http:/ / fiji.sc / फिजी). हालांकि, स्वीकर्ता / दाता अनुपात की वास्तविक समय की निगरानी की अनुमति देता है कि सॉफ्टवेयर अत्यधिक उपयोगी है.
7. फ्लोरोसेंट खुर्दबीन मंच पर स्लाइड माउंट. उपयुक्त फिल्टर सेट का उपयोग संवेदक और ASCT-mCherry सह व्यक्त कोशिकाओं का पता "ध्यान" समारोह के तहत (माल की सूची देखें). "कैमरा" टैब पर क्लिक करके और "लाभ" के तहत स्लाइड बार फिसलने से लाभ को समायोजित. इसके अलावा, तटस्थ घनत्व फिल्टर ड्रॉप डाउन मेनू से तटस्थ घनत्व फिल्टर सेटिंग समायोजित करें. नोट: फिल्टर घन एक आंख फिल्टर शामिल नहीं है, शोर के बाद से आंख टुकड़े का उपयोग नहीं करतेT-तरंगदैर्ध्य उत्तेजना प्रकाश आँखों के लिए हानिकारक है. बजाय कोशिकाओं को खोजने के लिए कंप्यूटर स्क्रीन का प्रयोग करें.
8. कोशिकाओं की छवियों का मोल with donor ( mTFP1) _ex donor(mTFP1) _em , donor ( mTFP1) _ex acceptor(venus) _em and acceptor ( mTFP1) _ex acceptor(venus) _{em m} channels (फिल्टर सामग्री की सूची में निर्दिष्ट कर रहे हैं). "छवि पर कब्जा" क्लिक करें और फिर अधिग्रहण खिड़की में इस्तेमाल किया जा करने के लिए जा रहे हैं कि फिल्टर निर्दिष्ट. अगले फ़िल्टर सेटिंग्स बॉक्स में वांछित समय जोखिम लिखकर जोखिम समय समायोजित करने के लिए "टेस्ट" बटन पर क्लिक करें. नोट: सभी तीन चैनलों में एक ही लंबाई के लिए उजागर करने की जरूरत है. इमेजिंग मापदंडों का समायोजन करते हैं, उम्मीद झल्लाहट दक्षता परिवर्तन ले और खाते में वृद्धि गुना: झल्लाहट दक्षता प्रयोग के दौरान 2 गुना जाने की उम्मीद है, तो उदाहरण के लिए, इमेजिंग पैरामीटर समायोजित किया जाना चाहिएउस चैनल प्रयोग के दौरान संतृप्त नहीं हो जाता तो आराम की स्थिति में दाता _{पूर्व} अपनाने _{उन्हें} तीव्रता, <साधन से दर्ज किया जा सकता है कि अधिक से अधिक मूल्य का 50% होना चाहिए कि इतनी. लेबल कोशिकाओं से संकेत पृष्ठभूमि क्षेत्र में है कि अधिक से कम से कम तीन गुना अधिक होना चाहिए.
9. सॉफ्टवेयर में क्षेत्रों के उपकरण का उपयोग ब्याज की एक क्षेत्र ड्रा. वैकल्पिक रूप से, निश्चित तीव्रता से ऊपर पिक्सल का चयन करने के लिए एक सॉफ्टवेयर समारोह में इस्तेमाल किया जा सकता है, और फिर क्षेत्रों में बदल दिया. ऐसा करने के लिए, मास्क क्लिक करें - खण्ड, तो वांछित क्षेत्रों को उजागर करने के लिए बार फिसलने चाल है.
10. कब्जा प्रकार बॉक्स में "समय चूक" का चयन करें, तो अंतराल (इस प्रयोग में 10 सेकंड) और प्रयोग के लिए समय अंक निर्दिष्ट.
11. किसी भी फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के बिना एक क्षेत्र में एक क्षेत्र ड्रा. इस क्षेत्र पृष्ठभूमि घटाव के लिए प्रयोग किया जाता है. राइट खींचा क्षेत्र क्लिक करें, और फिर एक पृष्ठभूमि के रूप में सेट. नोट: कोई हैं कि आदर्श रूप में, कोशिकाओंसेंसर व्यक्त टी autofluorescence और कैमरे से पता चला पृष्ठभूमि पुष्पन दोनों के लिए खाते में पृष्ठभूमि क्षेत्र के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. ऐसी कोई कोशिकाओं, देखने के क्षेत्र में उपलब्ध हैं, तो कोशिकाओं के बिना कम से कम एक क्षेत्र पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए खाते में करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
12. विकल्प - "कार्यक्रम चलाने का चयन समारोह 'के तहत वांछित प्रोग्राम का चयन करें. बचाया कार्यक्रम (2.3 कदम देखें) के लिए टॉगल करें, और उसके बाद छिड़काव नियंत्रक पर हिट दर्ज करें. अब कार्यक्रम भरी हुई है, और किसी भी चाबी मार छिड़काव शुरू कर देंगे.
13. छिड़काव सुनिश्चित करें और इमेजिंग प्रयोग छिड़काव नियंत्रक पर एक कुंजी दबाने के रूप में एक ही समय में कब्जा विंडो में "प्रारंभ" बटन पर क्लिक करके एक ही समय में शुरू करते हैं.
    नोट: यह समाधान (इस अधिग्रहण टैब के भीतर मिला "नोट्स" समारोह का उपयोग किया जा सकता है) विमर्श किया गया जहां timepoint रिकॉर्ड करने के लिए सिफारिश की है.
14. एक ही छिड़काव प्रोटोकॉल USI प्रदर्शन करनाप्रयोगात्मक शर्त के तहत संतृप्त या अनबाउंड या तो होने की उम्मीद है कि एक संवेदक व्यक्त कोशिकाओं एनजी.
    नोट: यहाँ, प्रयोगात्मक शर्त के तहत संतृप्त है जो FLIPQTV3.0_1.5μ, एक नियंत्रण, 6 चित्र के रूप में प्रयोग किया जाता है इस तरह के नियंत्रण प्रयोगों झल्लाहट दक्षता परिवर्तन नहीं सब्सट्रेट में वास्तविक परिवर्तन की वजह से है और यह पुष्टि करने के लिए आवश्यक हैं. कारण सेलुलर पीएच के रूप में अन्य मानकों में परिवर्तन करने के लिए.

3. बाद प्रयोग विश्लेषण

1. नमूना बहाव प्रयोग के दौरान हुई है अगर जांच करते हैं. ब्याज (आरओआई) के क्षेत्रों ड्रा timepoint 0 में लिया छवि पर है, तो इमेजिंग खिड़की के शीर्ष पर फिसलने बार कदम है और कोशिकाओं प्रयोग में बाद में लिया छवियों में ROIs से बाहर गिर अगर जांच ले.
2. यदि हाँ, तो मास्क का चयन करके कोशिकाओं के आसपास मास्क बनाने, पहले से बहाव के लिए सही करने के लिए ट्रैकिंग समारोह का उपयोग करते हैं - खण्ड, तो hig के लिए कटऑफ निर्दिष्ट करता है कि लाइन स्लाइडक्षेत्रों कोशिकाओं से युक्त hlight. मास्क क्लिक करके क्षेत्रों track - कण ट्रैकिंग - मूल कण ट्रैकिंग.
3. जब आवश्यक ROIs फिर से आकर्षित और पृष्ठभूमि क्षेत्र.
4. प्रयोग के दौरान अधिक ROIs का मतलब तीव्रता निर्यात करें. सांख्यिकी क्लिक करें - निर्यात - अनुपात / timelapse डेटा.
5. सब्सट्रेट एकाग्रता की झल्लाहट दक्षता और मात्रा का ठहराव आवश्यक नहीं है, जब सब्सट्रेट की गतिशीलता का एक प्रॉक्सी के रूप में तीव्रता अनुपात (दाता _{पूर्व} अपनाने _{उन्हें,} / दाता _{पूर्व} दाता _{उन्हें)} के समय पाठ्यक्रम की साजिश. साइटोसोलिक एकाग्रता का निर्धारण करने, अधिक से अधिक और (क्रमशः सब्सट्रेट के saturating और अभाव में, यानी,) न्यूनतम अनुपात परिवर्तन, Δr _{अधिकतम} गणना - निम्न समीकरण के साथ Δratio (Δr) के गैर रेखीय प्रतिगमन द्वारा Δr _{मिनट,:}
   Δr = [एस] / (कश्मीर _डी + [एस]) एक्स (Δr मिनट) + Δr _मिनट
   जहां [एस] cytosol में सब्सट्रेट एकाग्रता है. Δr _{अधिकतम} उपयोग करना - एक दिया Δr पर सेंसर की Δr _मिनट प्राप्त मूल्यों, संतृप्ति (एस) के रूप में गणना की है
   एस = (Δr - Δr _{मिनट)} / (Δr _{मैक्स} - Δr _{मिनट)}
   आगे निम्न समीकरण का उपयोग सब्सट्रेट एकाग्रता [एस] में परिवर्तित किया जा सकता है:
   एस = [एस] / (कश्मीर _डी + [एस])
   नोट: अपनाने _{पूर्व} अपनाने _{उन्हें} चैनल की तीव्रता भी प्रयोगात्मक हालत सीधे स्वीकर्ता के प्रतिदीप्ति प्रभावित है कि क्या जांच करने के लिए साजिश रची जा चाहिए.
6. कारण तस्वीर विरंजन के लिए एक आधारभूत बहाव मनाया जाता है, एक आधारभूत सुधार करते हैं. ऐसा करने के लिए, समय के साथ दाता और स्वीकर्ता की तीव्रता (चित्रा 5A) साजिश है. तब वीं के लिए इस्तेमाल किया timepoints पहचानई आधारभूत, छिड़काव प्रणाली में देरी और विशेष सेल (चित्रा 5 ब) के परिवहन गतिविधि के अनुसार.
7. सर्वश्रेष्ठ आधारभूत वर्णन करता है कि एक polynominal फिटिंग की गणना. फिर, आधारभूत (चित्रा 5C) के लिए प्रत्येक timepoint से कच्चे तीव्रता मानक के अनुसार. सामान्यीकृत दाता और स्वीकर्ता तीव्रता से तीव्रता अनुपात (दाता _{पूर्व} अपनाने _{उन्हें,} / दाता _{पूर्व} दाता _{उन्हें)} की गणना.

Representative Results

विशिष्ट समय पाठ्यक्रम प्रयोगों चित्रा 2 में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. इन प्रयोगों में, 8 मिमी (FLIPQTV3.0_8m, चित्रा 2A और 2 बी) और 100 माइक्रोन (FlipQTV3.0_100 μ सी और डी) की समानताएं के साथ glutamine सेंसर झल्लाहट के साथ सह व्यक्त किया गया Cos7 कोशिकाओं ¹⁰ में एक अनिवार्य अमीनो एसिड एक्सचेंजर ASCT2 ^18. Glutamine का तांता दाता (mTFP1) और स्वीकर्ता (वीनस) (2A चित्रा और 2 सी) के बीच प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुपात में परिवर्तन के रूप में पाया जाता है. एक और सब्सट्रेट (आला) की उपस्थिति में glutamine के तपका भी स्पष्ट रूप से इन प्रयोगों में प्रदर्शन किया है. दोनों सेंसर के साथ, सामान्यीकृत फ्लोरोसेंट तीव्रता मनाया अनुपात परिवर्तन वास्तव में टी वजह बताते हैं कि जो सब्सट्रेट की उपस्थिति में (स्वीकर्ता तीव्रता, नीचे चित्रा 2 बी और 2 डी जाता है यानी, दाता तीव्रता ऊपर चला जाता है) आपस में बदलझल्लाहट दक्षता में परिवर्तन ओ. इन प्रयोगों से इन कोशिकाओं में glutamine सांद्रता प्रयोगात्मक शर्त के तहत बहुत गतिशील रूप से उतार चढ़ाव चलता है कि; 100 माइक्रोन सेंसर का पता लगाने रेंज से 8 मिमी संवेदक के लिए निकट संतृप्ति एकाग्रता के लिए.

ट्रांसपोर्टरों की सब्सट्रेट specificities भी इन प्रयोगों में कोशिकाओं glutamine के साथ पहले से भरी हुई थी. चित्रा 3 में प्रदर्शन सेंसर का उपयोग कर जांच की जा सकती है, और फिर विभिन्न अमीनो एसिड उन एमिनो एसिड glutamine तपका पैदा कर सकते हैं कि क्या जांच करने के लिए बाह्य perfusate जोड़ा गया था. जैसी कि उम्मीद थी, ASCT2 substrates (ala, आनंद, Cys, THR, डी सेरीन) प्रेरित glutamine तपका (छवि 3 ए), गैर सब्सट्रेट अमीनो एसिड (प्रो, उनकी, लिस) नहीं किया था जबकि (छवि 3 बी), के साथ corroborating पिछले अध्ययनों ^18. आमतौर पर, सब्सट्रेट विशिष्टता प्रतिस्पर्धा सब्सट्रेट के साथ मिश्रित एक रेडियो आइसोटोप लेबल सब्सट्रेट का उपयोग प्रतियोगिता assays से मापा जाता है, जो काफी श्रमसाध्य है और समान रूप से अध्ययन किया जा ट्रांसपोर्टर व्यक्त कर रहे हैं कि कोशिकाओं की आबादी की आवश्यकता है. यहाँ उदाहरण ऑप्टिकल इमेजिंग एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान करता है.

कोई झल्लाहट दक्षता परिवर्तन सब्सट्रेट के अलावा पर मनाया जाता है, कई कारणों पर विचार किया जा सकता है. एक संभावित कारण यह परीक्षण किया जा रहा सब्सट्रेट और / या कोशिकाओं में एकाग्रता बनाए रखने कि एंजाइमों के उच्च गतिविधियों के लिए कम तेज क्षमता है. इस सेल लाइन स्पष्ट रूप से मीडिया में विकसित कर सकते हैं, भले ही उदाहरण के लिए, glutamine एकाग्रता परिवर्तन, परीक्षण किया शर्त के तहत ASCT2 ट्रांसपोर्टर व्यक्त नहीं करते कि Cos7 कोशिकाओं में कम से कम था मुख्य नाइट्रोजन स्रोत (चित्रा 4) में जो glutamine में. सेंसर की आत्मीयता intracellular एकाग्रता की तुलना में बहुत अधिक या बहुत कम या तो है इसके अलावा, अगर सेंसर प्रोटीन का सबसे क्रमशः अनिवार्यता से बाउंड या अनबाउंड रहेगा; इसलिए कोई झल्लाहट दक्षता परिवर्तन चाहते हो जाएगाetected.

चित्रा 1. एक झल्लाहट glutamine सेंसर का विन्यास. (ए) ओपन (सियान) और glutamine ई. कोलाई से प्रोटीन बंधन, glnH की (पीला) रचना बंद हुआ. mTFP1 डाला जाता है जहां स्थिति मैजेंटा में चिह्नित है. FLIPQTV_3.0 सेंसर (बी) योजनाबद्ध अभ्यावेदन.

चित्रा 2. FLIPQ-TV3.0_8m और 100μ सेंसर का उपयोग में विवो glutamine माप. (ए) Cos7 कोशिकाओं की venus/mTFP1 अनुपात FLIPQ-TV3.0_8m सेंसर और ASCT2-mCherry सह व्यक्त. mCherry टैग परिवहन व्यक्त कोशिकाओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया थाएर mTFP1 या वीनस उत्सर्जन चैनलों हस्तक्षेप किए बिना. कोशिकाओं HEPES बफर हांक बफर (पीएच 7.35) के साथ perfused थे. बाह्य glutamine (लाल) और alanine (नीला) छिड़काव मीडिया में जोड़ा गया था जब timepoints ग्राफ ऊपर बक्से के रूप में संकेत कर रहे हैं. ठोस और धराशायी लाइनों एक ही प्रयोग में मापा दो व्यक्ति की कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं. (बी) दाता (mTFP1) और (ए) में दिखाया गया है प्रयोग में स्वीकर्ता (वीनस) चैनलों की तीव्रता. मानों photobleaching और आधारभूत की सामान्यीकृत के लिए सही थे. (सी) और (घ) एक समान (ए) के रूप में प्रयोग और (बी), FLIPQ-TV3.0_100μ सेंसर व्यक्त Cos7 कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन किया. ⁽¹⁰ से संशोधित चित्रा).

सेलुलर glutamine टी के चित्रा 3. उन्मूलनबाहरी एमिनो एसिड की मौजूदगी में ASCT2 ट्रांसपोर्टर hrough, FLIPQ-TV3.0_8m सेंसर का उपयोग कल्पना. (ए) साइटोसोलिक glutamine कोशिकी आला, आनंद, Cys, THR, और डी सेवाओं के अलावा द्वारा निर्यात किया जाता है. प्रो, लिस, उनकी (ब्लैक बॉक्स) की बाह्य glutamine (लाल बॉक्स) या अन्य अमीनो एसिड (नीले बॉक्स) छिड़काव मीडिया के लिए जोड़ा गया था जब timepoints ग्राफ ऊपर बक्से के रूप में संकेत कर रहे हैं. (बी) के अलावा साइटोसोलिक glutamine एकाग्रता में परिवर्तन नहीं करता , आला (नीले बॉक्स) के अलावा glutamine के निर्यात को बढ़ावा देता है जबकि. ठोस और धराशायी लाइनों एक ही प्रयोग में मापा दो व्यक्ति की कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं. सभी अमीनो एसिड 5 मिमी बाहरी सांद्रता में जोड़ा गया था. (चित्रा मूल रूप से ¹⁰ में प्रकाशित हुआ था).

चित्रा 4. Cos7 कोशिकाओं की venus/mTFP1 अनुपात ईFLIPQ-TV3.0_8m सेंसर (ए) और 100μ संवेदक (बी) xpressing. कोशिकाओं HEPES बफर हांक बफर के साथ perfused थे. बाह्य glutamine (5 मिमी) छिड़काव मीडिया में जोड़ा गया था जब timepoints ग्राफ ऊपर लाल बक्से के रूप में संकेत कर रहे हैं. ठोस और धराशायी लाइनों एक ही प्रयोग में मापा दो व्यक्ति की कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं.

चित्रा 5. Photobleaching के लिए संशोधन. (ए) चित्रा 2A और 2C में प्रतिनिधित्व दो कक्षों से कच्चे तीव्रता. (बी) baselines की गणना के लिए चयन किया गया था कि datapoints. Polynominal फिटिंग घटता चित्रा में दिखाया गया. ए में दिखाया चैनलों (सी) तीव्रता, सामान्यीकृत इस आंकड़े में इस्तेमाल डाटासेट आईडीई है बी में गणना की आधारभूत खिलाफचित्रा 2A और -2 सी में दिखाए गए एक के ntical.

चित्रा 6. FLIPQ-TV3.0_1.5m सेंसर का उपयोग में विवो glutamine माप. (ए) Cos7 कोशिकाओं की venus/mTFP1 अनुपात FLIPQ-TV3.0_1.5m सेंसर और ASCT2-mCherry सह व्यक्त. mCherry टैग mTFP1 या वीनस उत्सर्जन चैनलों हस्तक्षेप किए बिना ट्रांसपोर्टर व्यक्त कोशिकाओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. कोशिकाओं HEPES बफर हांक बफर (पीएच 7.35) के साथ perfused थे. बाह्य glutamine (लाल) और alanine (नीला) छिड़काव मीडिया में जोड़ा गया था जब timepoints ग्राफ ऊपर बक्से के रूप में संकेत कर रहे हैं. ठोस और धराशायी लाइनों एक ही प्रयोग में मापा दो व्यक्ति की कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं. (बी) दाता की तीव्रता (mTFP1) और स्वीकर्ता (वीनस) चैनल(ए) में दिखाया गया है प्रयोग में. मानों photobleaching और आधारभूत की सामान्यीकृत के लिए सही थे.

समय (मिनट)

समाधान एक

समाधान बी

समाधान सी

समाधान डी

समाधान ई

समाधान एफ

0

पर वाल्व

2

वाल्व बंद

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4

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30

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34

वाल्व बंद

.. समाधान एक इस प्रयोग में इस्तेमाल छिड़काव प्रोटोकॉल की तालिका 1 उदाहरण:. 9.7 जी हांक नमक (H1387), 0.35 ग्राम NaHCO _3, 1 एल पीएच के लिए 5.96 जी HEPES NaOH समाधान बी के साथ 7.35 को समायोजित: समाधान ए + 0.04 मिमी Gln समाधान सी:.. समाधान ए + 0.2 मिमी Gln Solutआयन डी:. समाधान ए + 1 मिमी Gln समाधान ई:. समाधान ए + 5 मिमी Gln समाधान एफ: समाधान ए + 5 मिमी Ala.

Discussion

इमेजिंग प्रयोगों की सफलता के कुछ महत्वपूर्ण कारकों पर निर्भर करता है. इन कारकों में से एक के ऊपर चर्चा के रूप में इस्तेमाल सेंसर की समानता है. ब्याज की subcellular डिब्बे में सब्सट्रेट के पूर्ण एकाग्रता, हालांकि, कई बार अज्ञात है. इसलिए हम वांछित प्रयोगात्मक शर्त के तहत सबसे अच्छा काम करता है खोजने के लिए कंपित समानताएं के साथ कई सेंसर कोशिश की सिफारिश. उदाहरण के लिए, हमारे मामले में हम 1.5μ साथ glutamine सेंसर के साथ Cos7 कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट, 100μ, 2m, और 8 (3 चित्र और डेटा नहीं दिखाया गया है).

एक अन्य महत्वपूर्ण कारक सेंसर प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर है. एक अल्पकालिक घटना (जैसे, एकल कार्रवाई संभावित) एक उच्च अभिव्यक्ति के स्तर आवश्यक ¹⁹ बन सकता मनाया जाने की जरूरत है जब पता लगाने के लिए आवश्यक अभिव्यक्ति के स्तर, उदाहरण के लिए, प्रयोगों, के बीच होती है. इसलिए, ज्यादातर मामलों में, अपेक्षित स्तर empiricall होने की जरूरतY निर्धारित की. लक्ष्य सेल में बहुत कम एकाग्रता में मौजूद है, कमी को लक्षित करने के कारण अंतर्जात प्रक्रियाओं की गड़बड़ी एक मुद्दा ²⁰ बन सकता है. ऐसी संभावना का आकलन करने के लिए एक स्वतंत्र परख, यदि उपलब्ध हो, इसलिए वांछनीय है. इस लेख में दिखाया प्रयोगों में, सीएमवी प्रमोटर द्वारा संचालित प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए पर्याप्त हो पाया था. ज्यादा कमजोर गतिविधियों के साथ प्रमोटरों इस्तेमाल किया जाना चाहिए जहां स्थितियों में, संकेत तीव्रता में वृद्धि करने के लिए समायोजन आवश्यक हो सकता है. उदाहरण के लिए, प्रदर्शन के दौरान संकेत तीव्रता और तस्वीर विरंजन के बीच समझौता पर पहुंच जाने की जरूरत है. अब जोखिम समय के अलावा, इस तरह के fluorophores की चमक, सेंसर, binning की अधिक से अधिक तीव्रता परिवर्तन, और सीसीडी कैमरे की संवेदनशीलता के रूप में जैसे कारकों संकेत तीव्रता बढ़ाने के लिए बदला जा सकता है.

ऊपर दो मापदंड की संभावना है, भले ही कोई अनुपात परिवर्तन प्रयोगात्मक शर्त के तहत मनाया जाता है जबमुलाकात हो, यह दिया metabolite या आयन के लिए सेलुलर homeostasis (परिणाम अनुभाग देखें) परिवहन गतिविधि मुखौटा काफी मजबूत है कि संभव है. ऐसे मामलों में, विभिन्न जैव रासायनिक गतिविधियों के साथ सेल लाइनों ट्रांसपोर्टर गतिविधियों ^{10, 21} का पता लगाने के लिए एक पृष्ठभूमि के रूप में आवश्यक हो सकता है.

इन सेंसरों एक निष्कर्षण आधारित विधियों की तुलना में ज्यादा spatiotemporal संकल्प पर सब्सट्रेट की एकाग्रता गतिशीलता की निगरानी करने की अनुमति है, जबकि पूर्ण एकाग्रता के निर्धारण के आगे प्रयोगात्मक कदम और विचार की आवश्यकता है. आमतौर पर, सब्सट्रेट एकाग्रता सेल में व्यक्त की है जब आम तौर पर शुद्ध सेंसर प्रोटीन titrating द्वारा गणना सेंसर की आत्मीयता,, अपरिवर्तित है कि इस धारणा पर गणना की है. एकाग्रता निम्नलिखित एकल बंधन इज़ोटेर्म उपयोग कर की गणना कर रहा है,

[एस] = कश्मीर _डी एक्स (आर - आर _{मिनट)} / (नि. </ उन्हें> _{मैक्स} - आर)

[एस] कश्मीर _डी विट्रो में निर्धारित हदबंदी स्थिर है, सब्सट्रेट एकाग्रता है, अनुसंधान के लिए एक दिया timepoint में मनाया स्वीकर्ता / दाता अनुपात है, सेंसर एपीओ रूप में कर रहे हैं जब _मिनट स्वीकर्ता / दाता अनुपात अनुसंधान, और आर _{अधिकतम} सभी सेंसर सब्सट्रेट करने के लिए बाध्य कर रहे हैं जब स्वीकर्ता / दाता अनुपात. आर _मिनट और आर _{अधिकतम} इस तरह के सेंसर की एकाग्रता, प्रयोग इमेजिंग सेटिंग्स और सेलुलर milleu की रचना, और इसलिए बगल में मापा जा करने की आवश्यकता के रूप में मानकों से प्रभावित हैं है . intracellular सब्सट्रेट एकाग्रता के संशोधन आवश्यक हो जाता है की अनुमति देता है कि आर _मिनट और आर _{अधिकतम} मूल्यों, प्रयोगात्मक शर्तों का निर्धारण करने के लिए. उदाहरण के लिए, चयनात्मक ionophores ²² या ऐसी आपदाओं के रूप में एक perforating अभिकर्मक (जैसे, सीए ^{2 +} के लिए ionomycin)gitonin ²³ बाहरी एकाग्रता के साथ intracellular सब्सट्रेट एकाग्रता संतुलित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शन प्रयोगों के प्रकार में सीमाओं में से एक कम throughput है; विश्लेषण कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत छोटे (<10) की संख्या में एक metabolite का विश्लेषण करने पर ही सीमित है. तकनीकी विकास के ऐसे सीमाओं को पार करने के लिए, हालांकि, किए जा रहे हैं. उदाहरण के लिए, स्वचालित, उच्च सामग्री स्क्रीनिंग में अग्रिम के साथ, यह छोटा सा अणु या आरएनएआई पुस्तकालय के साथ संयोजन में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सेंसर का उपयोग करना संभव है; एक biosensor व्यक्त कोशिकाओं एक उच्च throughput प्रारूप (जैसे, 96 - या 384 अच्छी तरह) में उगाया जा सकता है, तो व्यक्तिगत कुओं siRNA या रसायनों के साथ या तो इलाज और imaged किया जा सकता है. इस तरह के प्रयोगों biosensor ^{24 25} से देखा जा सकता है कि जैविक प्रक्रिया को बाधित कि siRNA निर्माणों या रसायन की पहचान की अनुमति. एक और रोमांचक हाल अग्रिम incluडेस एक सेलुलर स्तर ²⁶ पर झल्लाहट दक्षता परिवर्तन की उच्च throughput का पता लगाने की अनुमति देता है जो cytometer एक समय हल microfluidic प्रवाह का विकास. इस तरह की तकनीकी प्रगति नई दवा उम्मीदवारों और जैविक प्रक्रियाओं में नए घटकों की खोजों सहायता करेगा.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted fluorescent microscope	Olympus	IX81F-3-5	An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also be appropriate.
Excitation filter (mTFP1)	Omega Optical	3RD450-460	Band width 450-460 nm
Excitation filter (Venus)	Chroma	ET500/20	Band width 490-510 nm
Emission filter (mTFP1)	Chroma	HQ495/30m	Band width 475-505 nm
Emission filter (Venus)	Chroma	ET535/30m	Band width 520-550 nm
Dichroic mirror (FRET channels)	Chroma	470dcxr	Long pass, 470 nm cut off
Dichroic mirror (YFP channel)	Chroma	89002bs	Passes 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm
mCherry filter set	Chroma	49008	Excitation 540-580 nm, long pass dichroic with 585 nm cut off, emission filter 595-695 nm
Light source	Olympus	U-LH100L-3-5	LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended
CCD camera	Qimaging	Rolera-MGi EMCCD
Apochromatic fluorescence objective	Olympus
Perfusion system, ValveBank II	AutoMate Scientific	[01-08]	Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work
Laminar-flow chambers	C&L Instruments	VC-MPC-TW	Other larminar-flow chambers would also work.
Chambered slide	Lab-Tek	154534	For open-chamber experiments
Perfusion pump	Thermo Scientific	74-046-12131	For open-chamber experiments
Software supporting ratiometric measurements	Intellegenent Imaging Innovation	Slidebook 5.5
Laminar flow biosafety cabinet	ESCO	LA-3A2
Isotemp CO2 Incubator	Thermo Scientific	13-255-25
Dulbecco's MEM (DMEM)	Hyclone	SH30243.01
Cosmic calf serum	Hyclone	SH3008703
Penicillin/streptomycin	Hyclone	SV30010
Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I)	Invitrogen	31985	Used with Lipofectamine 2000
Poly-L-Lysine solution	Sigma	P4707
25 mm circular glass cover slips	Thermo Scientific	12-545-102	In case VC-MPC-TW is used
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668027	Other transfection reagents can also be used.
Solution A (Hank's buffer)			9.7 g HANK salt (Sigma H1387), 0.35 g NaHCO3, 5.96 g HEPES to 1 L, pH adjusted to 7.35 with NaOH
Solution B			Solution A + 0.04 mM Gln
Solution C			Solution A + 0.2 mM Gln
Solution D			Solution A + 1 mM Gln
Solution E			Solution A + 5 mM Gln
Solution F			Solution A + 5 mM Ala