Summary
מאמר זה ידגים כיצד לעקוב אחר דינמיקת גלוטמין בתאים חיים באמצעות סריג. חיישני מקודדים גנטי מאפשרים ניטור בזמן אמת של מולקולות ביולוגיות ברזולוציה subcellular. עיצוב ניסיוני, פרטים טכניים של ההגדרות הניסיוניות, ושיקולים לניתוחים שלאחר ניסוי יידונו לחיישני גלוטמין מקודד גנטי.
Abstract
חיישני מקודדים גנטי מאפשרים ניטור בזמן אמת של מולקולות ביולוגיות ברזולוציה subcellular. מגוון עצום של חיישנים כאלה למולקולות ביולוגיות הפך זמין בשנים האחרונות 15, שחלקם הפך לכלי חיוני המשמשים באופן שיגרתי במעבדות רבות.
אחד היישומים המרגשים של חיישני מקודדים גנטי הוא השימוש בחיישנים אלה בחקירת תהליכי הובלה תאיות. מאפיינים של מובילים כגון קינטיקה וספציפיות מצע יכולים להיחקר ברמה תאית, המספקים אפשרויות לניתוחי תאים מסוג מסוימים של פעילות הובלה. במאמר זה, נדגים כיצד ניתן לצפות דינמיקת טרנספורטר באמצעות חיישן גלוטמין מקודד גנטי לדוגמא ירושלים. עיצוב ניסיוני, פרטים טכניים של ההגדרות הניסיוניות, ושיקולים לניתוחים שלאחר ניסוי יידונו.
Introduction
בשל התקדמות מרשימה בטכנולוגיות המאפשרת בדיקה של transcriptome וproteome ברמה תאית, זה הפך כעת ברור כי ביוכימיה והשטף של מטבוליטים ויונים וכתוצאה מכך הם מאוד תאים מסוג ספציפי. לדוגמא, בכבד של היונקים, השפלה גלוטמין רציפה וסינתזה מתבצעות בו זמנית על ידי תאי periportal ותאי perivenous בהתאמה, האכלת אמוניום למעגל האוריאה בסוג התא לשעבר תוך צריכת אמוניה עודפת ב1-3 האחרון. במקרים מסוימים, את ההטרוגניות ביוכימיים משמעותית הוא זוהה גם ב" סוג תא "יחיד 4, 5. בנוסף לסגולי מרחבית כגון, הרמות תאיות של מטבוליטים ויונים הן מאוד דינמיות (למשל, מולקולות איתות כגון Ca 2 + ונוקלאוטידים מחזוריים). דפוסי spatiotemporal של מטבוליטים ויונים לעתים קרובות משחקים תפקיד קריטי בהעברת אותות. Monitoring דינמיקה הסלולר של מטבוליטים ויונים, לעומת זאת, מהווה אתגר ייחודי. במקרים רבים השינוי בריכוזים הם מהירים וחולפים, שהודגם על ידי המקרה של מולקולות איתות כגון Ca 2 +, אשר דועך בתוך ~ 20 אלפיות שניים בקוצים הדנדריטים 6. בנוסף, מידור של מסלולים ביוכימיים בתוך ובין התאים עושה את זה קשה לכמת את הדינמיקה של מטבוליטים ויונים באמצעות מיצוי וכרומטוגרפיה עמודה / טכניקות ספקטרומטריית מסה.
חיישני מקודד גנטי למולקולות ביולוגיות המשמשים כיום באופן נרחב בשל הרזולוציה spatiotemporal הגבוהה המאפשרת הנסיין ללמוד דינמיקה קצרת מועד ו / או ממודרת מולקולרית (הנסקרת ב 7, 8). בערך ניתן לחלק את חיישני מקודדים גנטי אלה לשתי קטגוריות; חיישנים מבוססי עוצמה וחיישני ratiometic. חיישנים מבוססי עוצמה בדרך כלל מורכבים של תחום מחייב ושפעתחלבון orescent (FPS), והמומס מחייב לתחום המחייב משנים את עוצמת הניאון. חיישני Ratiometic, לעומת זאת, מנצלים לעתים קרובות העברת פוסטר התהודה אנרגיה (סריג) בין שני FPS המתפקדים כזוג סריג. חיישנים אלה כוללים תחום מחייב ושתי תמונות בשניה, והמומס המחייב גורם שינוי בסריג יעילות בין שתי תמונות בשניה. מספר גדול של חיישנים למטבוליטים ויונים חשובים מבחינה ביולוגית פותחו בעשור האחרון 8, 9.
אחת האפשרות מרגשת המוצע על ידי חיישני מקודדים גנטי כזה הוא השימוש שלהם בניתוח ברזולוציה הגבוהה של תהליכי הובלת קרום, שלא היה קל בעבר כדי לזהות ברמה התאית. חיישני מקודדים גנטי להקל על הניתוח של מנגנוני הובלה כגון סגוליות מצע וpH תלות 10, 11. יתר על כן, בשילוב עם מיל הגנטיources כגון הספרייה של RNAi בונה לאורגניזמים מודל, ניתן כיום לבצע חיפושי הגנום לתהליכי הובלת רומן באמצעות חיישנים מקודדים גנטי. ואכן, שימוש בעופרת חיישן מקודד גנטי לגילוי של מובילי uncharacterized בעבר במקרים רבים 12, 13.
לאחרונה, המעבדה שלנו פיתחה סדרה של חיישן מבוסס סריג לגלוטמין. אנחנו הוכיחו כי רמות גלוטמין הסלולרי ניתן דמיינו באמצעות חיישני גלוטמין סריג כזה 10. חיישנים אלה כוללים תורם סריג (mTFP1) מוכנס לתוך חלבון גלוטמין מחייב חיידקי glnH, וacceptor סריג (ונוס) בC-Termini של glnH (איור 1). סריג יעילות של חיישנים אלה להקטין על הכריכה של גלוטמין, וכתוצאה מכך הירידה של יחס עוצמת acceptor / תורם. ויסות עדינה של תהליכי הובלת גלוטמין היא חשובה בתהליכים ביולוגיים כגון neurotransm14 ission, 15 והתחזוקה של מחזור אוריאה בכבד 1, 16, 17.
כאן אנו מראים את המתודולוגיה של ניתוח פעילות תחבורה עם חיישני סריג לגלוטמין, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב בתחום ההגדרה. המטרה של ניסויים המוצגים כאן הן לזהות פעילויות טרנספורטר בתא בודד ולבחון את הספציפיות מצע של טרנספורטר הביע transiently.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. לדוגמא הכנה
הערה: במקרים רבים ניסויי זלוף לשטוף את חלק משמעותי של תאים, מה שיכול להיות בעיה מתסכלת. אמנם לא הכרחי עבור כל שורות תאים, משטחי זכוכית כיסוי ציפוי עם פולי-L-ליזין (להוסיף 1.0 ml/25 2 סנטימטר של פתרון 0.01% על פני השטח, דגירה> 5 דקות, לשטוף פעמיים עם מים כיתה תרבית תאים, ויבשים ב ארון הבטיחות הביולוגי) משפר את הידבקות תא. כמו כן, להיות מודע לרמת הבטיחות הביולוגית (מנהלת הליגה) של הקו הסלולרי בשימוש, ופעל על פי נוהל העבודה הרגיל שאושר על ידי משרד בריאות ובטיחות הסביבתי המקומי. בניסוי זה, תאי cos7 שימשו עקב פעילות תחבורת גלוטמין אנדוגני נמוכה (ראה איור 4).
- תאי הזרע cos7 ב ~ confluency 70-80% בנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) + 10% נסיוב עגל קוסמי ו100 U / ml פניצילין / סטרפטומיצין, או על coverslips זכוכית סטרילית 25 מ"מ מונח בתרבות 6 היטבצלחת או שקופיות זכוכית תחתונה 8 היטב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, לחות 100% ל24 שעות.
- להחליף את מצע הגידול לDMEM +10% בסרום קוסמי עגל (ללא אנטיביוטיקה), על פי הפרוטוקול של היצרן. לגדול O / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בלחות 100%.
- הוספת 0.4 מ"ג כל אחת של ה-DNA פלסמיד קידוד חיישן גלוטמין (pcDNA3.1, נשא חיישן FLIPQTV3.0 תחת CMV אמרגן 10) וASCT2 mCherry מתויג 10-50 סרום ללא מדיה מיליליטר (Opti-ממ) ומערבבים בעדינות.
- הוסף 1 מיליליטר של מגיב transfection 50 מיליליטר סרום ללא מדיה. לדגור על RT במשך 5 דקות.
- מערבבים את שני פתרונות המכילים DNA (שלב 1.3) ומגיב transfection (שלב 1.4) ו דגירה עבור 20 דקות.
- בעדינות להוסיף את מגיב transfection על גבי התאים ומערבבים בעדינות על ידי נדנדה הקאמרית. דגירה של 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, לחות 100%.
- לאחר 24 שעות, להחליף הבינוני עד DMEM + 10% עגל סרום קוסמישל פניצילין / סטרפטומיצין (CCS) + 100 יחידה.
- תאים הם צילמו 48-72 לאחר transfection שעה.
2. ניסוי זלוף
הערה: לתאי cos7 השתמשו בניסוי זה, תקשורת זלוף והקאמרי הוחזקו על RT וסביבת CO 2 ריכוז. עם זאת, יש להשתמש אם התאים בשימוש דורשים טמפרטורה גבוהה יותר ו-CO 2 שליטת ריכוז להישרדות, במה מיקרוסקופ מחוממת ו / או תא סביבתי.
- הכן AF חיץ זלוף (ראה רשימה של חומרים). צרף ברזים למיניהם ל50 מיליליטר מזרקים, לסגור את הברזים למינים ולאחר מכן למלא אותם עם פתרונות זלוף. פתח את ברזלים לתקופה קצרה כדי למלא את החלל בראש בברזלים עם למאגר.
- לעבור על 8 ערוצים, מערכת זלוף הכבידה להאכיל עם עיפרון זלוף, ולאחר מכן בחר באפשרות "מצב ידני" תחת אפשרות בחירת פונקציה. הנח מיכל פסולת בעיפרון זלוף.
- באופן ידנילהפעיל את הנמלים על ידי לחיצה על המספרים המתאימים ולמלא את tubings באמצעות 10 מזרק מיליליטר המכיל מים, ולאחר מכן לסגור את הנמל. ברגע שהיציאות מלאות במים, לקבוע את המזרקים המכילים מאגרי AF ביציאה 1-6 של מערכת זלוף, ולאחר מכן פתח את הברזים למיניהם. לפתוח את היציאות שוב כדי להחליף את המים בצינורות עם החוצצים. קצב הזרימה צריך להיות סביב 0.8 מיליליטר / דקה.
- לחץ על ביטול פעם אחת בבקר זלוף לחזור לתפריט "בחר פונקציה". לעבור לאפשרות "תכנית ערוך", ולאחר מכן להקליד את פרוטוקול זלוף מפורט בטבלה 1. שמרו את תכנית זלוף.
- קח את התאים מחוץ לחממה. שטוף פעמיים עם חיץ זלוף, ולאחר מכן קבע את התאים על הבמה. חבר את מערכת זלוף לתא. אם נעשה שימוש בתא פתוח, הוקם משאבה נוספת שמסירה את פתרון זלוף מהחדר.
- פתח את תוכנת Slidebook. התחל שקופית חדשה.
הערה:ההליך הבא הוא ספציפי לתוכנת Slidebook, אלא גם תוכנות אחרות כגון MetaFluor וNis-Element יכולות לשמש לסוג של הדמיה שתוארה כאן. באופן תיאורטי ניתן לבצע ניסויים באמצעות כל תוכנה המאפשרת הדמיה בזמן כמובן, וניתן לנתח רצפי התמונה שלאחר ניסוי באמצעות תוכנה כגון ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) או פיג'י (http:/ / Fiji.sc / פיג'י). עם זאת, תוכנה המאפשרת ניטור של יחס acceptor / תורם בזמן אמת היא שימושית מאוד. - הר השקופיות על הבמה מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מצא תאי שיתוף מבטא את החיישן וASCT-mCherry באמצעות מערכות סינון מתאימות (ראה רשימה של חומרים) תחת פונקצית "פוקוס". התאם רווח על ידי לחיצה על לשונית "מצלמה" ומחליק את פס השקף תחת "רווח". כמו כן, להתאים את הגדרת מסנן צפיפות הניטרלית מתפריט הנפתח מסנן צפיפות ניטראלי. הערה: אם קוביית המסנן אינה כוללת מסנן עין, אין להשתמש בחלקי העין מאז שוראור עירור T-גל מזיק לעיניים. השתמש במסך המחשב כדי למצוא את התאים במקום.
- לרכוש תמונות של תאים with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (מסננים שצוינו ברשימה של חומרים). לחץ על "לכידת תמונה", ולאחר מכן בחלון הרכישה, לציין את המסננים שהולכים להיות בשימוש. לחץ על לחצן "בדיקה" כדי להתאים את זמן חשיפה על ידי הקלדת זמן חשיפה הרצויה בתיבה ליד הגדרות מסננים. הערה: כל שלושה הערוצים צריכים להיות חשופים לאותו האורך. בעת כוונון הפרמטרים ההדמיה, לקחת את שינוי סריג יעילות הצפוי ולקפל להגדיל בחשבון: לדוגמא, אם את יעילות סריג צפויה לעלות פי 2 במהלך הניסוי, צריכים להיות מותאמים פרמטרים הדמיהכך שעוצמתם Acceptor לשעבר תורם במצב המנוחה צריכה להיות <50% מהערך המקסימאלי שניתן להקליט על ידי המכשיר, כך שהערוץ שאינו הופך להיות רווי במהלך הניסוי. אות מהתאים שכותרתו צריכה להיות לפחות גבוהה יותר פי שלוש מזה שבאזור הרקע.
- צייר אזור של עניין באמצעות כלי אזורים בתוכנה. לחלופין, ניתן להשתמש בתוכנת פונקציה כדי לבחור פיקסלים מעל עוצמה מסוימת, ולאחר מכן הוסבה לאזורים. כדי לעשות זאת, לחץ על מסיכה - מגזרי, ואז להעביר את סרגל הגלילה כדי להדגיש את האזורים הרצויים.
- בחר באפשרות "זמן לשגות" בתיבת הסוג ללכוד, ולאחר מכן לציין את המרווח (10 שניות בניסוי הזה) ונקודות זמן לניסוי.
- צייר אזור באזור ללא כל תאי ניאון. אזור זה משמש לחיסור רקע. לחץ לחיצה ימנית באזור נמשך, ולאחר מכן להגדיר אותו כרקע. הערה: באופן אידיאלי, תאים שאיןיש להשתמש לא מבטאים את החיישנים כמו זו של אזור הרקע לחשבון עבור שני autofluorescence ותפרחת הרקע זוהתה על ידי המצלמה. אם אין תאים כאלה זמינים בשדה ראיה, יש להשתמש לפחות באזור ללא תאים כדי להסביר את הקרינה הרקע.
- בחר את התכנית הרצויה תחת "בחר פונקציה - הפעלת תוכניות" אפשרות. לעבור לתכנית הצילה (ראה שלב 2.3), ולאחר מכן פגע ENTER בבקר זלוף. עכשיו התכנית נטענת, ולהכות על מקש כלשהו יפעיל את זלוף.
- ודא זלוף וניסוי ההדמיה להתחיל באותו הזמן על ידי לחיצה על כפתור "התחל" בחלון הלכידה באותו הזמן כמו לחיצה על מקש בבקר זלוף.
הערה: מומלץ להקליט timepoint בי הפתרונות הוחלפו (זה יכול להיעשות באמצעות "אורים" פונקציה, נמצאים בתוך כרטיסיית הרכישה). - לבצע את אותה USI פרוטוקול זלוףng תאים לבטא חיישן שצפוי להיות או רווי או לא מאוגד תחת תנאי הניסוי.
הערה: כאן, FLIPQTV3.0_1.5μ, שהוא רווי בתנאי הניסוי, משמש כביקורת, איור 6 ניסויי שליטה כזו נחוצים כדי לוודא ששינוי סריג יעילות הוא כתוצאה מהשינוי בפועל במצע ולא. כתוצאה מהשינוי בפרמטרים אחרים כגון pH הסלולרי.
3. ניתוח שלאחר ניסוי
- בדוק אם להיסחף מדגם אירע במהלך הניסוי. צייר אזורים של העניין (ROI) זה על התמונה שצולמה בtimepoint 0, ולאחר מכן להעביר את סרגל הגלילה בחלק העליון של חלון ההדמיה ולבדוק אם התאים נפולת של ROIs בתמונות שצולמו מאוחר יותר בניסוי.
- אם כן, אז להשתמש בפונקצית המעקב כדי לתקן את הסחף על ידי ראשון, יצירת מסכות סביב התאים על ידי בחירת מסכה - מגזרי, ולאחר מכן להחליק את השורה שמציינת את הפסקת לגדולותhlight האזורים המכילים תאים. עקוב אחר האזורים על ידי לחיצה מסכה - מעקב אחר חלקיקים - מעקב אחר חלקיקי יסוד.
- מחדש לצייר ROIs ואזור רקע בעת צורך.
- לייצא את העצמה הממוצעת של ROIs במהלך הניסוי. לחץ סטטיסטיקה - יצוא - נתוני היחס / timelapse.
- כאשר סריג יעילות וכימות של ריכוז מצע אינה הכרחיים, עלילה כמובן יחס העצמה (Acceptor לשעבר תורם, / em התורם לשעבר תורם) כשלוח של הדינמיקה של המצע הזמן. כדי לקבוע את ריכוז cytosolic, לחשב את מקסימלי ומינימאלי שינוי יחס (כלומר, שבירווה והעדר המצע, בהתאמה), Δr מקסימום - דקות Δr, על ידי רגרסיה לא לינארית של Δratio (Δr) עם המשוואה הבאה:
x Δr = [S] / (d + K [S]) (Δr
שבו [S] הוא ריכוז המצע בcytosol. שימוש Δr מקסימום - ערכי Δr דקות הושגו, הרוויה (S) של החיישן בΔr נתון מחושב כ
S = (Δr - Δr דקות) / (Δr מקסימום - דקות Δr)
S נוסף ניתן להמיר את ריכוז המצע [S] באמצעות המשוואה הבאה:
S = [S] / (d + K [S])
הערה: עוצמת ערוץ em Acceptor לשעבר Acceptor צריכה להיות גם זמם לבחון אם תנאי הניסוי השפיעו על הקרינה של acceptor ישירות. - כאשר להיסחף בסיסי בשל צילום הלבנה הוא ציין, לבצע תיקון בסיס. כדי לעשות זאת, עלילה העוצמות של תורם acceptor לאורך זמן (איור 5 א). ואז לזהות את הנקודות הזמן משמש להבסיס דואר, על פי העיכוב במערכת זלוף ופעילות ההובלה של תא המסוים (איור 5).
- חישוב הולם polynominal שמגדירה את נקודת ההתחלה. לאחר מכן, לנרמל את עוצמת הגלם מtimepoint לבסיס (איור 5 ג). לחשב את יחס העצמה (Acceptor לשעבר תורם, / em התורם לשעבר תורם) מעוצמות תורם acceptor המנורמלת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניסויים בזמן קורס טיפוסיים מיוצגים באיור 2. בניסויים אלו, סריג חיישני גלוטמין עם זיקות של 8 מ"מ (FLIPQTV3.0_8m, איור 2 א ו -2) ו100 מיקרומטר (FlipQTV3.0_100 μ C ו-D) היו שיתוף הביע עם ASCT2 חובה מחליף חומצת אמין 18 בתאי cos7 10. זרם של גלוטמין הוא זוהה כשינוי ביחסי עוצמת הקרינה בין התורם (mTFP1) וacceptor (ונוס) (איור 2 א ו 2 ג). בזרימת של גלוטמין בנוכחות מצע אחר (עלא) הוא הוכיח גם באופן ברור בניסויים אלה. עם שני החיישנים, עוצמות ניאון מנורמלות לשנות הדדית (כלומר, עוצמת התורם עולה כעוצמת acceptor יורדת, איור 2 ו 2 ד) בנוכחותו של מצע, אשר מצביעות על כך ששינוי היחס שנצפה הוא אכן לא בשלo השינוי בסריג יעילות. ניסויים אלה מראים כי ריכוזי גלוטמין בתאים אלה משתנים באופן דינמי מאוד תחת תנאי הניסוי; מהטווח הגילוי של 100 חיישן מיקרומטר לריכוז קרוב לרוויה במשך 8 חיישן מ"מ.
ספציפיות מצע של מובילים גם ניתן לבחון באמצעות חיישנים, הפגינו באיור 3. בניסויים אלו התאים היו טעונים מראש עם גלוטמין, ולאחר מכן חומצות אמינו שונות נוספו לperfusate תאי לבחון האם חומצות אמינו אלה יכולים לגרום לזרימת גלוטמין. כצפוי, מצעי ASCT2 (עלא, Ser, Cys, Thr, D-סרין) בזרימת מושרה גלוטמין (איור 3), ואילו חומצות אמינו שאינו מצע (Pro,, ליס) לא עשו זאת (איור 3), המאמת עם מחקרים קודמים 18. בדרך כלל, סגוליות מצע נמדד במבחני תחרות באמצעות מצע שכותרתו איזוטופ רדיו מעורבב עם מצע מתחרה, שהוא די מייגע ודורש אוכלוסייה של תאים ששווים המבטאת את טרנספורטר כדי להיחקר. הדמיה אופטית שהודגמה כאן מציעה גישה חלופית.
כאשר אין שינויי סריג יעילות הם נצפו על תוספת של המצע, מכמה סיבות יכולה להיחשב. סיבה אפשרית אחת היא יכולת הספיגה הנמוכה עבור המצע שנבדק ו / או פעילות גבוהה של אנזימים השומרים על הריכוז בתאים. לדוגמא, שינוי ריכוז גלוטמין היה מינימאלי בתאי cos7 שאינו מבטאים טרנספורטר ASCT2 בתנאי שנבדק, למרות שאת שורות התאים יכולים לגדול בתקשורת באופן ברור שבגלוטמין במקור החנקן העיקרי (איור 4). בנוסף, אם הזיקה של החיישן היא גם גבוהה מדי או נמוכה מדי בהשוואה לריכוז תאית, רוב חלבוני החיישן יישאר constitutively מאוגד או לא מאוגד, בהתאמה; ולכן אין שינוי סריג יעילות יהיה דetected.
איור 1. תצורה של חיישן גלוטמין סריג. הפתוח (ציאן) (א) וסגרה קונפורמציה (צהובה) של glnH, גלוטמין חלבון מחייב מE.coli. המצב שבו mTFP1 מוכנס מסומן בצבע מגנטה. ייצוגי סכמטי (B) של חיישני FLIPQTV_3.0.
איור 2. במדידות vivo גלוטמין באמצעות FLIPQ-TV3.0_8m וחיישנים 100μ. (א) יחס venus/mTFP1 של תאי cos7 שיתוף להביע חיישן FLIPQ-TV3.0_8m וASCT2-mCherry. mCherry תג שימש לזיהוי התאים המבטאים את התחבורהאה בלי להתערב ערוצי פליטת mTFP1 או ונוס. התאים היו perfused עם החיץ של האנק HEPES שנאגר (pH 7.35). נקודתי זמן כאשר גלוטמין תאי (אדום) ואלנין (כחול) התווסף לתקשורת זלוף הם ציינו תיבות מעל הגרף. קווים מלאים ומקווקוים מייצגים את שני תאים בודדים שנמדדו באותו הניסוי. (ב ') בעוצמות של תורם (mTFP1) וacceptor ערוצים (ונוס) בניסוי שמוצג ב( א'). הערכים תוקנו לphotobleaching ומנורמל לתחילת המחקר. (ג) ו (ד ') ניסוי דומה כמו ב( א) ו (ב), הופיע עם תאי cos7 מבטאים את חיישן FLIPQ-TV3.0_100μ. (איור שונה מ10).
איור 3. ביעור לא גלוטמין הסלולריhrough טרנספורטר ASCT2 בנוכחות חומצות אמינו חיצוניים, דמיינו באמצעות חיישן FLIPQ-TV3.0_8m. () גלוטמין Cytosolic מיוצא על ידי התוספת של עלא תאי, Ser, Cys, Thr, ו-D-ser. תוספת נקודתי זמן כאשר גלוטמין תאי (תיבות אדומות) או חומצות אמינו אחרות (קופסות כחולות) נוספו לתקשורת זלוף הם ציינו תיבות מעל הגרף. (B) של Pro, יס, (קופסות השחורות) שלו אינה משנה את ריכוז גלוטמין cytosolic , ואילו התוספת של עלא (תיבות כחולות) מקדמת את היצוא של גלוטמין. קווים מלאים ומקווקוים מייצגים את שני תאים בודדים שנמדדו באותו הניסוי. כל חומצות אמינו נוספו ב5 ריכוזים חיצוניים מ"מ. (איור פורסם במקור ב10).
דואר איור 4. יחס venus/mTFP1 של תאי cos7xpressing חיישן FLIPQ-TV3.0_8m () וחיישן 100μ (ב '). התאים היו perfused עם החיץ של האנק HEPES שנאגר. נקודתי זמן כאשר גלוטמין תאי (5 מ"מ) התווסף לתקשורת זלוף הם ציינו תיבות אדומות מעל הגרף. קווים מלאים ומקווקוים מייצגים את שני תאים בודדים שנמדדו באותו הניסוי.
איור 5. תיקון לphotobleaching. () עוצמות גלם משני תאים מיוצגים באיור 2 א ו 2 ג. (B) Datapoints שנבחרו לחישוב ערכי הבסיס. קימורים הולם Polynominal מוצגים באיור. (C) עוצמות של ערוצים שמוצגים ב, מנורמל נגד הבסיס מחושב בB. בסיס הנתונים המשמשים בנתון זה הוא IDEntical לזה שמוצג באיור 2 א ו 2 ג.
איור 6. במדידות vivo גלוטמין באמצעות חיישן FLIPQ-TV3.0_1.5m. (א) יחס venus/mTFP1 של תאי cos7 שיתוף להביע חיישן FLIPQ-TV3.0_1.5m וASCT2-mCherry. תג mCherry שימש לזיהוי התאים המבטאים את טרנספורטר בלי להתערב ערוצי פליטת mTFP1 או ונוס. התאים היו perfused עם החיץ של האנק HEPES שנאגר (pH 7.35). נקודתי זמן כאשר גלוטמין תאי (אדום) ואלנין (כחול) התווסף לתקשורת זלוף הם ציינו תיבות מעל הגרף. קווים מלאים ומקווקוים מייצגים את שני תאים בודדים שנמדדו באותו הניסוי. (ב ') בעוצמות של תורם (mTFP1) וacceptor ערוצים (ונוס)בניסוי שמוצג ב( א '). הערכים תוקנו לphotobleaching ומנורמל לתחילת המחקר.
| זמן (דקות) | פתרון | פתרון ב ' | הפתרון C | הפתרון D | פתרון E | הפתרון F | |||||||
| 0 | שסתום על | ||||||||||||
| 2 | שסתום את | שסתום על | |||||||||||
| 4 | שסתום על | שסתום את | |||||||||||
| 6 | שסתום את | שסתום על | |||||||||||
| 8 | שסתום על | שסתום את | 10 | שסתום את | שסתום על | ||||||||
| 12 | שסתום על | שסתום את | |||||||||||
| 14 | שסתום את | שסתום על | |||||||||||
| 16 | שסתום על | שסתום את | |||||||||||
| 18 | שסתום את | שסתום על | |||||||||||
| 20 | שסתום על | שסתום את | |||||||||||
| 22 | שסתום את | שסתום על | |||||||||||
| 24 | שסתום על | שסתום את | 26 | שסתום את | שסתום על | ||||||||
| 28 | שסתום על | שסתום את | |||||||||||
| 30 | שסתום את | שסתום על | |||||||||||
| 32 | שסתום על | שסתום את | |||||||||||
| 34 | שסתום את |
. טבלה 1 דוגמא לפרוטוקול זלוף השתמש בניסוי זה פתרון:. מלח 9.7 גרם האנק (H1387), 0.35 גרם NaHCO 3, 5.96 HEPES גרם ל-pH 1 ליטר מותאם ל7.35 עם NaOH פתרון ב ':. פתרון + 0.04 מ"מ Gln הפתרון C:.. פתרון + 0.2 מ"מ Gln solutיון D:. פתרון + 1 מ"מ Gln פתרון E:. פתרון + 5 מ"מ Gln הפתרון F: פתרון + 5 מ"מ אלבמה
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההצלחה של ניסויי הדמיה תלויה בגורמים קריטיים כמה. אחד הגורמים הללו הוא הזיקה של חיישנים המשמשת, כפי שפורט לעיל. ריכוז מוחלט של המצע בתא subcellular של עניין, עם זאת, הוא לעתים קרובות לא ידוע. לכן אנו ממליצים לנסות חיישנים מרובים עם זיקות מעד למצוא אחד שפועל תחת תנאי ניסוי הרצויים הטוב ביותר. לדוגמא, במקרה שלנו אנחנו transfected תאי cos7 עם חיישני גלוטמין עם 1.5μ, 100μ, 2 מ ', ו8m (איור 3 ומידע לא מוצגים).
גורם חשוב נוסף הוא רמת הביטוי של חלבוני חיישן. רמת הביטוי הנדרש לזיהוי משתנה בין, ניסויים, לדוגמא, כאשר אירוע קצר מועד (למשל פוטנציאל פעולה יחיד,) צריכה להיות שנצפה רמת ביטוי גבוהה יותר יכולה להיות 19 צורך. לכן, ברוב המקרים, לרמה הנדרשת צריכה להיות empirically נקבע. אם היעד קיים בריכוז נמוך מאוד בתא, הפרעות של תהליכי אנדוגני בשל למקד דלדול יכולות להיות בעיה 20. Assay עצמאי להעריך אפשרות כזו, אם קיימת, ולכן רצוי. בניסויים שמוצגים במאמר זה, ביטוי חלבון מונע על ידי אמרגן CMV נמצא להיות מספק. במצבים שבם יזמים עם פעילויות הרבה יותר חלשות צריכים להיות בשימוש, התאמות כדי להגדיל את עוצמות האות עשויות להיות נחוצות. לדוגמא, פשרה בין עוצמת האות וצילום הלבנה במהלך החשיפה צריכה להגיע. בנוסף לזמן חשיפה ארוך יותר, ניתן לשנות גורמים כדוגמת הבהירות של fluorophores, השינוי בעוצמה מקסימאלי של החיישן, binning, והרגישויות של מצלמת CCD כדי לשפר את עוצמת האות.
כאשר לא חלה שינוי יחס הוא ציין תחת תנאי הניסוי למרות ששני הקריטריונים הנ"ל צפוייםלהיות נפגש, זה אפשרי, כי הומאוסטזיס הסלולרי למטבוליט או יון שניתן הוא חזק מספיק כדי להסוות את פעילות התחבורה (ראה סעיף התוצאה). במקרים כאלה, שורות תאים עם פעילויות ביוכימיות שונות ייתכן שתידרשנה כרקע כדי לזהות פעולות טרנספורטר 10, 21.
בעוד חיישנים אלה יאפשר אחד כדי לעקוב אחר דינמיקת ריכוז של המצע ברזולוציה spatiotemporal גבוהה הרבה יותר מהשיטות המבוסס על מיצוי, קביעת הריכוז מוחלט דורשת עוד צעדים ושיקולים ניסיוניים. בדרך כלל, ריכוז מצע מחושב בהנחה שהזיקה של החיישן, מחושבת בדרך כלל על ידי titrating חלבון חיישן מטוהר, היא ללא שינוי כאשר באו לידי ביטוי בתא. הריכוז מחושב באמצעות איזותרמה הקישור היחיד הבא,
[S] = x ד K (r - r דקות) / (r </ Em> מקסימום - r)
[S] הוא ריכוז המצע, ד K הוא הניתוק קבוע שנקבע במבחנה, r הוא יחס acceptor / התורם נצפה בtimepoint נתון, r דקות היא יחס acceptor / תורם כאשר חיישנים הם בצורת apo, ומקסימום r הוא יחס acceptor / תורם כאשר כל החיישנים חייבים המצע. דקות R ומקסימום r מושפעים מפרמטרים כגון ריכוז של חיישנים, הגדרות הדמיה המשמשות ואת ההרכב של milleu הסלולרי, ולכן צריך להימדד באתר . כדי לקבוע דקות r וערכי מקסימום r, תנאי ניסוי המאפשר שינוי של ריכוז מצע תאיים הופך להכרחי. לדוגמא, יונופורים סלקטיבית (למשל, ionomycin לCa 2 +) 22 או מגיב ניקוב כגון דיgitonin 23 יכול לשמש כדי לאזן ריכוז מצע תאיים עם הריכוז החיצוני.
אחת המגבלות בסוג של ניסויים הוכיחו בפרוטוקול זה הוא התפוקה הנמוכה; הניתוח מוגבל בניתוח מטבוליט אחד במספר (<10) קטן יחסית של תאים. התקדמות טכנולוגית נעשות, עם זאת, כדי להתגבר על מגבלות כאלה. לדוגמא, עם ההתקדמות באוטומטית, גבוה הקרנת תוכן, ניתן כיום להשתמש בחיישני מקודדים גנטי בשילובים עם מולקולה קטנה או ספריית RNAi; תאים המבטאים biosensor ניתן לגדל בפורמט תפוקה גבוהה (למשל, 96 - או 384 גם), ואז ניתן לטפל בבארות בודדות עם או siRNA או כימיקלים וצלמו. ניסויים כאלה לאפשר זיהוי של מבני siRNA או כימיקלים המשבשים את התהליך הביולוגי שיכול להיות שנצפה על ידי biosensor 24 25. אחר inclu מראש האחרון המרגשdes הפיתוח של זרימת זמן נפתר microfluidic cytometer, המאפשרת זיהוי תפוקה גבוהה של שינוי סריג יעילות ברמה תאית 26. התקדמות טכנית כגון תסייע תגליות של מועמדי תרופה חדשים ורכיבים חדשים בתהליכים ביולוגיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH 1R21NS064412, NSF מענק 1,052,048 וJeffress זיכרון אמון מענק J-908.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted fluorescent microscope | Olympus | IX81F-3-5 | An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also be appropriate. |
| Excitation filter (mTFP1) | Omega Optical | 3RD450-460 | Band width 450-460 nm |
| Excitation filter (Venus) | Chroma | ET500/20 | Band width 490-510 nm |
| Emission filter (mTFP1) | Chroma | HQ495/30m | Band width 475-505 nm |
| Emission filter (Venus) | Chroma | ET535/30m | Band width 520-550 nm |
| Dichroic mirror (FRET channels) | Chroma | 470dcxr | Long pass, 470 nm cut off |
| Dichroic mirror (YFP channel) | Chroma | 89002bs | Passes 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm |
| mCherry filter set | Chroma | 49008 | Excitation 540-580 nm, long pass dichroic with 585 nm cut off, emission filter 595-695 nm |
| Light source | Olympus | U-LH100L-3-5 | LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended |
| CCD camera | Qimaging | Rolera-MGi EMCCD | |
| Apochromatic fluorescence objective | Olympus | ||
| Perfusion system, ValveBank II | AutoMate Scientific | [01-08] | Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work |
| Laminar-flow chambers | C&L Instruments | VC-MPC-TW | Other larminar-flow chambers would also work. |
| Chambered slide | Lab-Tek | 154534 | For open-chamber experiments |
| Perfusion pump | Thermo Scientific | 74-046-12131 | For open-chamber experiments |
| Software supporting ratiometric measurements | Intellegenent Imaging Innovation | Slidebook 5.5 | |
| Laminar flow biosafety cabinet | ESCO | LA-3A2 | |
| Isotemp CO2 Incubator | Thermo Scientific | 13-255-25 | |
| Dulbecco's MEM (DMEM) | Hyclone | SH30243.01 | |
| Cosmic calf serum | Hyclone | SH3008703 | |
| Penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I) | Invitrogen | 31985 | Used with Lipofectamine 2000 |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma | P4707 | |
| 25 mm circular glass cover slips | Thermo Scientific | 12-545-102 | In case VC-MPC-TW is used |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | Other transfection reagents can also be used. |
| Solution A (Hank's buffer) | 9.7 g HANK salt (Sigma H1387), 0.35 g NaHCO3, 5.96 g HEPES to 1 L, pH adjusted to 7.35 with NaOH | ||
| Solution B | Solution A + 0.04 mM Gln | ||
| Solution C | Solution A + 0.2 mM Gln | ||
| Solution D | Solution A + 1 mM Gln | ||
| Solution E | Solution A + 5 mM Gln | ||
| Solution F | Solution A + 5 mM Ala |
References
- Haussinger, D. Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle. Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).
- Haussinger, D.
- Watford, M., Chellaraj, V., Ismat, A., Brown, P., Raman, P.
- Mustroph, A., et al. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 18843-18848 (2009).
- Sasagawa, Y., et al. Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity. Genome Biol. 14, R31 (2013).
- Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. The life cycle of Ca(2+) ions in dendritic spines. Neuron. 33, 439-452 (2002).
- Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative imaging with fluorescent biosensors. Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).
- Newman, R. H., Fosbrink, M. D., Zhang, J. Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells. Chemical reviews. , 111-3666 (2011).
- Okumoto, S. Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors. Curr Opin Biotech. 21, 45-54 (2010).
- Gruenwald, K., et al. Visualization of glutamine transporter activities in living cells using genetically encoded glutamine sensors. PLoS One. 7, e38591 (2012).
- Chaudhuri, B., et al. Protonophore- and pH-insensitive glucose and sucrose accumulation detected by FRET nanosensors in Arabidopsis root tips. Plant Journal. 56, 948-962 (2008).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
- Jiang, D. W., Zhao, L. L., Clapham, D. E. Genome-Wide RNAi Screen Identifies Letm1 as a Mitochondrial Ca2+/H+ Antiporter. Science. , 326-147 (2009).
- Barnett, N. L., Pow, D. V., Robinson, S. R. Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light. Glia. 30, 64-73 (2000).
- Rothstein, J. D., Tabakoff, B. Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition. J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).
- Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. X. Differential regulation of amino acid transporter SNAT3 by insulin in hepatocytes. J Biol Chem. 280, 26055-26062 (2005).
- Palmada, M., Speil, A., Jeyaraj, S., Bohmer, C., Lang, F. The serine/threonine kinases SGK1, 3 and PKB stimulate the amino acid transporter ASCT2. Biochem Bioph Res Co. 331, 272-277 (2005).
- Bröer, A., et al. The astroglial ASCT2 amino acid transporter as a mediator of glutamine efflux. J Neurochem. 73, 2184-2194 (1999).
- Wallace, D. J., et al. Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor. Nature. 5, 797-804 (2008).
- Haugh, J. M. Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring. Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).
- San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PLoS One. 8, e57712 (2013).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
- Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).
- Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening. PLoS One. 6, e20114 (2011).
- Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter. Science. 326, 144-147 (2009).
- Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells. J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).
