Summary
Este artigo irá demonstrar como monitorar a dinâmica de glutamina em células vivas usando FRET. Sensores geneticamente codificados permitir o monitoramento em tempo real de moléculas biológicas em uma resolução subcelular. O delineamento experimental, os detalhes técnicos das configurações experimentais, e considerações para análises pós-experimentais serão discutidos para sensores de glutamina codificados geneticamente.
Abstract
Sensores geneticamente codificados permitir o monitoramento em tempo real de moléculas biológicas em uma resolução subcelular. Uma enorme variedade de tais sensores para moléculas biológicas tornou-se disponível nos últimos 15 anos, algumas das quais se tornaram ferramentas indispensáveis, que são utilizados rotineiramente em muitos laboratórios.
Uma das aplicações interessantes de sensores geneticamente codificados é a utilização destes sensores para investigar os processos de transporte celular. Propriedades de transportadores, tais como a cinética e especificidades de substrato pode ser investigada a um nível celular, oferecendo possibilidades para análises específicas do tipo de célula de actividades de transporte. Neste artigo, vamos demonstrar como a dinâmica do transportador pode ser observado usando sensor de glutamina geneticamente codificado como um exemplo. O delineamento experimental, os detalhes técnicos das configurações experimentais, e considerações para análises pós-experimentais serão discutidos.
Introduction
Devido ao notável progresso em tecnologias que permite o exame do transcriptoma e proteoma em um nível celular, que agora se tornou claro que a bioquímica eo fluxo resultante de metabólitos e íons são altamente celular do tipo específico. Por exemplo, no fígado dos mamíferos, a degradação da glutamina sequencial e síntese são realizadas simultaneamente por células periportais e células perivenosa respectivamente, alimentando de amónio para o ciclo da ureia no primeiro tipo de células, consumindo o excesso de amoníaco no último 1-3. Em alguns casos, a heterogeneidade bioquímica significativa é detectada até mesmo num único "tipo de célula" 4, 5. Em adição a esta especificidade espacial, os níveis de metabolitos celulares e iões são altamente dinâmico (por exemplo, moléculas de sinalização, tais como Ca 2 + e os nucleótidos cíclicos). Os padrões espaço-temporais de metabólitos e íons muitas vezes desempenham papéis críticos na transdução de sinal. MCOMPANHAMENTO dinâmica celular de metabólitos e íons, no entanto, representam desafio único. Em muitos casos, a alteração nas concentrações são rápida e transiente, exemplificada pelo caso de as moléculas de sinalização, tais como Ca 2 +, que se decompõe no ~ 20 ms em espinhas dendríticas 6. Além disso, a compartimentação das vias bioquímicas dentro e entre as células, torna difícil de quantificar a dinâmica de metabolitos e iões utilizando extracção e cromatografia em coluna / técnicas de espectrometria de massa.
Sensores codificados geneticamente para moléculas biológicas são agora amplamente utilizados, devido à alta resolução espaço-temporal que permite ao pesquisador a estudar a dinâmica molecular de curta duração e / ou compartimentada (revisada em 7, 8). Estes sensores codificados geneticamente podem ser divididos em duas categorias; Os sensores baseados em intensidade e sensores ratiometic. Os sensores baseados intensidade consistem tipicamente de um domínio de ligação e um gripeproteína orescent (PQ), e a ligação ao domínio de ligação ao soluto muda a intensidade de fluorescência. Sensores Ratiometic, por outro lado, muitas vezes, beneficiar de Transferência de Energia de Ressonância Foster (FRET) entre dois PQ que funcionam como um par de FRET. Estes sensores consistem de um domínio de ligação e dois PQ, e a ligação de soluto induz a alteração na eficiência da TERF entre as duas PQ. Um grande número de sensores para os metabolitos e os iões biologicamente importantes foram desenvolvidos na década passada 8, 9.
Um dos excitante possibilidade oferecida por tais sensores geneticamente codificados é a sua utilização na análise de alta-resolução dos processos de transporte de membrana, o que anteriormente não foi fácil de detectar, ao nível celular. Sensores geneticamente codificados facilitar a análise dos mecanismos de transporte, como a especificidade de substrato e dependência do pH 10, 11. Além disso, em combinação com os res genéticosONTES como a biblioteca de RNAi constrói para organismos modelo, agora é possível realizar pesquisas do genoma para processos de transporte inovadoras utilizando sensores codificados geneticamente. Com efeito, a utilização de microrganismos geneticamente codificado sensor de chumbo para a descoberta de transportadores anteriormente não caracterizadas em vários casos, 12, 13.
Recentemente, o nosso laboratório tem desenvolvido uma série de sensores baseados em FRET para a glutamina. Demonstrámos que os níveis de glutamina celular pode ser visualizada utilizando tais sensores FRET glutamina 10. Estes sensores consistem de um dador FRET (mTFP1) inserido numa proteína de ligação a glutamina bacteriana glnH, e um aceitador FRET (Vénus) na extremidade C-terminais de glnH (Figura 1). FRET eficiência destes sensores diminuir após a ligação de glutamina, o que resulta na diminuição da relação da intensidade de aceitador / dador. Boa regulação de processos de transporte de glutamina é importante nos processos biológicos, tais como neurotransmissão 14, 15 e a manutenção do ciclo da ureia no fígado 1, 16, 17.
Aqui nós mostramos a metodologia de análise de actividades de transporte com sensores Fret para glutamina, usando uma grande-campo microscópio de fluorescência set-up. O objectivo das experiências mostradas aqui são para detectar actividades de transportador numa única célula e para examinar a especificidade do substrato de um transportador transitoriamente expressa.
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Protocol
1. Exemplo de Preparação
Nota: Em muitos casos, experimentos de perfusão lavar uma parte significativa de células, o que pode se tornar um problema frustrante. Embora não seja necessário para todas as linhas celulares, as superfícies de vidro com tampa de revestimento de poli-L-Lisina (adicionar 1,0 ml/25 cm2 de solução de 0,01% para a superfície, incubar> 5 min, lavar duas vezes com água de grau de cultura de células, e seco em a cabine de segurança biológica) aumenta a adesão celular. Além disso, estar ciente do nível de biossegurança (BSL) da linha celular utilizada, e siga o procedimento operacional padrão aprovado pelo escritório local de saúde e segurança ambiental. Neste experimento, as células COS 7 foram utilizadas devido à baixa atividade de transporte de glutamina endógena (veja a Figura 4).
- As células COS7 semente em ~ 70-80% de confluência em Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) + 10% de soro de vitelo cósmica e 100 U / ml de penicilina / estreptomicina, ou em lamelas de vidro estéreis 25 milímetros colocadas na cultura de 6 poçosprato ou 8 poços lâminas com fundo de vidro. Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2, com 100% de humidade durante 24 horas.
- Trocar o meio de crescimento para DMEM +10% de soro de vitelo cósmica (sem antibióticos), de acordo com o protocolo do fabricante. Grow O / N a 37 ° C, 5% de CO 2 a 100% de humidade.
- Adicionar 0,4 mg de cada ADN de plasmídeo que codifica o sensor de glutamina (pcDNA3.1, carregando o sensor FLIPQTV3.0 sob promotor de CMV 10) e o ASCT2 mCherry marcado com 10 a 50 ml de meio isento de soro (meio OPTI-MEM) e misturar suavemente.
- Adicionar 1 ml de reagente de transfecção de 50 ml de meio isento de soro. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
- Misturar as duas soluções contendo ADN (passo 1.3) e reagente de transfecção (passo 1.4) e incubar durante 20 min.
- Adicionar cuidadosamente o reagente de transfecção em cima das células e misturar gentilmente pelo balanço da câmara. Incubar durante 24 horas a 37 ° C, 5% de CO 2, com 100% de humidade.
- Após 24 horas, trocar o meio de DMEM + 10% Cosmic Calf Serum(CCS) + 100 unidades de penicilina / estreptomicina.
- As células são fotografadas 48-72 horas pós-transfecção.
2. Experiment Perfusão
Nota: Para as células COS7 utilizadas nesta experiência, e os meios de perfusão foram câmara mantida a temperatura ambiente e ambiente concentração de CO 2. No entanto, se as células a ser utilizadas requerem temperatura mais elevada e de CO 2 de controlo de concentração para a sobrevivência, estágio de microscópio aquecida e / ou uma câmara ambiental deve ser usado.
- Prepare perfusão AF tampão (Veja a lista de materiais). Anexar torneiras a 50 ml seringas, feche as torneiras depois preenchê-los com as soluções para perfusão. Abrir a torneira de passagem, por um breve período de preencher o espaço de cabeça na torneira com o tampão.
- Ligue a 8 canais, sistema de perfusão de alimentação por gravidade com um lápis de perfusão, e em seguida, selecione "Modo Manual" em Selecione a opção de função. Coloque um recipiente de resíduos sob o lápis de perfusão.
- Manualmenteativar as portas, pressionando os números correspondentes e encher os tubos com 10 ml seringa contendo água e feche a porta. Uma vez que os portos estão cheios de água, definir as seringas contendo buffers AF na porta 1-6 de sistema de perfusão e, em seguida, abra as torneiras. Abrir as portas novamente para substituir a água na tubagem, com os tampões. O caudal deve ser de cerca de 0,8 ml / min.
- Imprensa cancelar uma vez no controlador de perfusão para voltar ao menu "Select Function". Alternar a opção "Edit Program", em seguida, digite o protocolo de perfusão indicado na Tabela 1. Salve o programa de perfusão.
- Tome as células fora da incubadora. Lavar duas vezes com o tampão de perfusão, e em seguida, defina as células no palco. Ligue o sistema de perfusão para a câmara. Se uma câmara aberta é usada, configurar outra bomba que remove a solução de perfusão da câmara.
- Abra o software Slidebook. Iniciar um novo slide.
Nota: Oprocedimento seguinte é específico para o software Slidebook, mas o outro software, como MetaFluor e Nis-elemento também pode ser utilizado para o tipo de imagem descrito aqui. Teoricamente experimentos podem ser realizados utilizando qualquer software que permite imagens curso de tempo, e as sequências de imagens podem ser analisados pós-experimentalmente usando softwares como o ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) ou Fiji (http:/ / fiji.sc / Fiji). No entanto, o software que permite o acompanhamento em tempo real da relação doador / receptor é altamente útil. - Montar o slide para o palco microscópio fluorescente. Encontrar as células co-expressando o sensor e ASCT-mCherry utilizando filtros adequados (veja a lista de materiais), sob a função "FOCUS". Ajuste o ganho clicando na guia "Câmara" e deslizar a barra deslizante em "ganho". Além disso, ajustar a configuração de filtro de densidade neutra a partir do menu drop-down filtro de densidade neutra. Nota: Se o cubo de filtro não inclui um filtro de olho, não use os pedaços de olho desde shorT-comprimento de onda de luz de excitação é prejudicial para os olhos. Use a tela do computador para encontrar as células em seu lugar.
- Adquirir imagens de células with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (Filtros são especificados na Lista de Material). Clique em "Captura de Imagem" e, em seguida, na janela de aquisição, especificar os filtros que vão ser usados. Clique no botão "TEST" para ajustar o tempo de exposição, digitando o tempo de exposição desejado na caixa ao lado das configurações do filtro. Nota: Todos os três canais necessitam de ser exposto durante o mesmo período. Ao ajustar os parâmetros de imagem, pegue a variação da eficiência FRET esperado e dobre aumentar em conta: por exemplo, se a eficiência FRET está prevista para ir até 2 vezes durante o experimento, os parâmetros de imagem deve ser ajustadade modo que a intensidade do Dador Aceitador ex in no estado de repouso deve ser <50% do valor máximo que pode ser gravada pelo instrumento, de modo que o canal se torne não saturado durante a experiência. Sinal a partir das células marcadas devem ser, pelo menos, três vezes mais elevada do que na região do fundo.
- Desenhe uma região de interesse utilizando a ferramenta regiões do software. Alternativamente, uma função de software para seleccionar os pixels acima determinada intensidade pode ser utilizado, e, em seguida, convertido em regiões. Para fazer isso, clique em Mask - Segmento, em seguida, mova a barra deslizante para destacar as áreas desejadas.
- Selecione "lapso de tempo" na caixa tipo de captura, em seguida, especificar o intervalo (10 seg neste experimento) e pontos de tempo para o experimento.
- Desenhe uma região em uma área sem quaisquer células fluorescentes. Esta área é usado para subtracção do fundo. Botão direito do mouse na região traçada, em seguida, configurá-lo como um fundo. Nota: Idealmente, as células que não estãot expressando os sensores devem ser utilizados como a região de fundo para ter em conta tanto a autofluorescência e a fluorescência de fundo detectado pela câmara. Na ausência de tais células estão disponíveis no campo de visão, pelo menos, uma região sem as células devem ser usados para explicar a fluorescência de fundo.
- Selecione o programa desejado em "Select Function - executar programas" opção. Alternar para o programa salva (veja o passo 2.3), e em seguida pressione ENTER no controlador de perfusão. Agora o programa é carregado, e bater qualquer tecla irá iniciar a perfusão.
- Certifique-se de perfusão e da experiência de imagem começar ao mesmo tempo, clicando no botão "Iniciar" na janela de captura ao mesmo tempo que pressionar uma tecla no controlador de perfusão.
Nota: Recomenda-se a registrar o ponto no tempo em que as soluções foram trocadas (o que pode ser feito usando o "notas" de função, encontrados dentro do guia de aquisição). - Execute o mesmo protocolo de perfusão using células que expressam um sensor que está prevista para ser saturados ou não ligada sob a condição experimental.
Nota: Aqui, FLIPQTV3.0_1.5μ, que é saturado com a condição experimental, é usado como um controlo, a Figura 6 Tais experiências de controlo são necessários para confirmar que a variação da eficiência de TERF é devido à alteração real no substrato e não. devido à mudança de outros parâmetros tais como pH celular.
3. Análise pós-experimento
- Examine se a amostra deriva ocorreu durante o experimento. Desenhe regiões de interesse (ROI) é sobre a imagem tirada em timepoint 0, em seguida, mova a barra deslizante na parte superior da janela de imagem e verifique se as células saem das ROIs em imagens tiradas no final do experimento.
- Se sim, então use a função de rastreamento para corrigir a deriva, em primeiro lugar, a criação de máscaras em torno das células selecionando Mask - Segmento, em seguida, deslize a linha que especifica o ponto de corte para highlight as regiões que contêm as células. Acompanhe as regiões clicando Mask - rastreamento de partículas - rastreamento de partículas Basic.
- Re-desenhar o ROI e região fundo quando necessário.
- Exportar a intensidade média das ROI ao longo do curso da experiência. Clique Estatísticas - Exportação - Dados Razão / timelapse.
- Quando a eficiência de FRET e quantificação da concentração do substrato não é necessário, traçar o curso de tempo da relação da intensidade (ex Dador Aceitador in, / Doadores Doadores ex in) como um proxy de a dinâmica do substrato. Para determinar a concentração citosólica, calcular o máximo e o mínimo de alterações proporção (isto é, na ausência de saturação e do substrato, respectivamente), Δr max - Δr min, por meio de regressão não-linear de Δratio (Δr) com a seguinte equação:
Δr = [S] / (K d + [S]) x (Δr
onde [S] é a concentração do substrato no citosol. Usando os Δr max - mínimo de valores obtidos Δr, saturação (S) do sensor a uma dada Δr é calculado como
S = (Δr - Δr min) / (Δr max - min Δr)
S podem ainda ser convertidos em concentração de substrato [S] usando a seguinte equação:
S = [S] / (K d + [S])
Nota: a intensidade da Acceptor ex Acceptor canal los deve ser também conspiraram para examinar se a condição experimental influenciado a fluorescência do receptor diretamente. - Quando um desvio da linha de base devido ao foto-branqueamento é observada, realizar uma correção de linha de base. Para fazer isso, traçar as intensidades de doador e receptor ao longo do tempo (Figura 5A). Em seguida, identificar os pontos temporais utilizadas para poe linha de base, de acordo com o atraso no sistema de perfusão e a actividade de transporte da célula em particular (Figura 5B).
- Calcule um encaixe de polinômio que melhor descreve a linha de base. Em seguida, normalizar a intensidade em bruto de cada ponto de tempo para a linha de base (Figura 5C). Calcular a relação de intensidade (Donor ex Acceptor em, / Donor ex Donor em) do doador e receptor intensidades normalizadas.
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Representative Results
Experiências típicas de curso-tempo estão representados na Figura 2. Nestas experiências, FRET sensores de glutamina com afinidades de 8 mM (FLIPQTV3.0_8m, Figura 2A e 2B) e 100 uM (FlipQTV3.0_100 μ C e D) foram co-expressos com uma aplicabilidade ASCT2 permutador de aminoácido 18 em células COS7 10. Influxo de glutamina é detectado como uma alteração em razões de intensidade de fluorescência entre o doador (mTFP1) e o receptor (Vénus) (Figura 2A e 2C). O efluxo de glutamina na presença de um outro substrato (Ala) é também claramente demonstrado nestas experiências. Com ambos os sensores, intensidades fluorescentes normalizadas mudar mutuamente (isto é, a intensidade do dador passa-se como a intensidade aceitador vai para baixo, Figura 2B e 2D), na presença de substrato, o que sugere que a mudança de relação observadas são de facto, devido to a mudança na eficiência de FRET. Estas experiências mostram que as concentrações de glutamina nestas células flutuar muito dinamicamente sob a condição experimental; a partir da faixa de sensor de detecção de 100 uM para a concentração próxima da saturação para o sensor 8 mM.
Especificidades de substrato de transportadores também podem ser examinadas por meio de sensores, demonstrado na Figura 3. Nestas experiências, as células foram pré-carregadas com glutamina, e, em seguida, vários aminoácidos foram adicionados ao perfusato extracelular para examinar se os aminoácidos podem induzir o efluxo de glutamina. Como esperado, substratos ASCT2 (Ala, Ser, Cys, Thr, D-serina) induzida efluxo de glutamina (Fig. 3A), enquanto que os aminoácidos não-substrato (Pro, His, Lys) não (Fig. 3B), corroborando com Estudos anteriores 18. Normalmente, a especificidade do substrato é medida por ensaios de competição, usando um substrato marcado com isótopos de rádio misturado com substrato competir, O que é bastante trabalhoso e requer uma população de células que estão uniformemente expressando o transportador a ser estudado. Imageamento óptico exemplificado aqui oferece uma abordagem alternativa.
Quando não há mudanças de eficiência FRET são observados após a adição do substrato, várias razões podem ser considerados. Uma razão possível é a baixa capacidade de absorção para o substrato a ser testado e / ou altas actividades de enzimas que mantêm a concentração nas células. Por exemplo, a alteração da concentração de glutamina foi mínima em células COS7 que não expressam ASCT2 transportador sob a condição testada, mesmo que esta linha de células pode crescer claramente nos meios de comunicação, em que a glutamina na fonte de azoto principal (Figura 4). Além disso, se a afinidade do sensor é demasiado elevado ou demasiado baixo quando comparado com a concentração intracelular, a maior parte das proteínas do sensor permanecerá constitutivamente ligado ou não ligado, respectivamente; portanto, nenhuma alteração FRET eficiência vai ser detected.
Figura 1. Configuração de um sensor de FRET glutamina. (A) Open (ciano) e fechada (amarelo) conformação de glnH, ligação glutamina proteína de E.coli. A posição em que se insere mTFP1 é marcado em magenta. (B) representações esquemáticas de sensores FLIPQTV_3.0.
Figura 2. Medidas in vivo utilizando glutamina-FLIPQ TV3.0_8m e sensores 100μ. (A) O rácio venus/mTFP1 de células COS7 que co-expressam o sensor FLIPQ-TV3.0_8m e ASCT2-mCherry. mCherry tag foi utilizado para identificar as células que expressam o transporteer, sem interferir nos canais de emissão mTFP1 ou Vênus. As células foram perfundidos com tampão de HEPES-tamponado de Hank (pH 7,35). Timepoints quando glutamina extracelular (vermelho) e alanina (azul) foi adicionado ao meio de perfusão são indicados como caixas acima do gráfico. As linhas a cheio e tracejadas representam duas células individuais medidos na mesma experiência. (B) As intensidades de dador (mTFP1) e aceitadores (Vénus) canais na experiência mostrada em (A). Os valores foram corrigidos para a fotodegradação e normalizadas para a linha de base. (C) e (D) Uma experiência semelhante à de (A) e (B), realizada com células COS7 que expressam o sensor FLIPQ-TV3.0_100μ. (Figura modificado a partir de 10).
Figura 3. Eliminação de glutamina celular ttravés do transportador ASCT2 na presença de aminoácidos externos, visualizado utilizando o sensor FLIPQ-TV3.0_8m. (A) citosólico glutamina é exportada pela adição de Ala extracelular, Ser, Cys, Thr, e D-ser. Timepoints quando glutamina extracelular (caixas vermelhas) ou outros aminoácidos (caixas azuis) foram adicionados aos meios de comunicação de perfusão são indicados como caixas acima do gráfico. (B) Adição de Pro, Lys, Suas (caixas-pretas) não altera a concentração de glutamina citosólica , ao passo que a adição de Ala (caixas azuis) promove a exportação de glutamina. As linhas contínuas e tracejadas representam duas células individuais medidos no mesmo experimento. Todos os aminoácidos foram adicionados a cinco concentrações externas mM. (Figura foi originalmente publicado em 10).
Figura 4. Venus/mTFP1 A proporção de células COS7 expressing sensor de FLIPQ-TV3.0_8m (A) e do sensor 100μ (B). As células foram perfundidos com tampão de Hank tamponada com HEPES. Timepoints quando glutamina extracelular (5 mM) foi adicionada ao meio de perfusão são indicados como caixas vermelhas acima do gráfico. As linhas contínuas e tracejadas representam duas células individuais medidos no mesmo experimento.
Figura 5. Corrigindo para a fotodegradação. (A) intensidades brutos de duas células representadas na Figura 2A e 2C. (B) Datapoints que foram selecionados para o cálculo das linhas de base. As curvas de ajuste polinomial são mostrados na figura. (C) As intensidades de canais mostradas em A, normalizada contra a linha de base calculada na B. O conjunto de dados utilizado nesta figura é identical à mostrada na Figura 2A e 2C.
Figura 6. Medidas in vivo utilizando o sensor de glutamina FLIPQ-TV3.0_1.5m. (A) O rácio venus/mTFP1 de células COS7 que co-expressam o sensor FLIPQ-TV3.0_1.5m e ASCT2-mCherry. mCherry tag foi utilizado para identificar as células que expressam o transportador sem interferir os canais de emissão mTFP1 ou Vénus. As células foram perfundidos com tampão de HEPES-tamponado de Hank (pH 7,35). Timepoints quando glutamina extracelular (vermelho) e alanina (azul) foi adicionado ao meio de perfusão são indicados como caixas acima do gráfico. As linhas contínuas e tracejadas representam duas células individuais medidos no mesmo experimento. (B) As intensidades de doador (mTFP1) e receptor de canais (Vênus)na experiência mostrada em (A). Os valores foram corrigidos para a fotodegradação e normalizada para a linha de base.
| Tempo (min) | Solução A | Solução B | Solução C | Solução D | Solução E | Solução F | |||||||
| 0 | válvula em | ||||||||||||
| 2 | válvula off | válvula em | |||||||||||
| 4 | válvula em | válvula off | |||||||||||
| 6 | válvula off | válvula em | |||||||||||
| 8 | válvula em | válvula off | 10 | válvula off | válvula em | ||||||||
| 12 | válvula em | válvula off | |||||||||||
| 14 | válvula off | válvula em | |||||||||||
| 16 | válvula em | válvula off | |||||||||||
| 18 | válvula off | válvula em | |||||||||||
| 20 | válvula em | válvula off | |||||||||||
| 22 | válvula off | válvula em | |||||||||||
| 24 | válvula em | válvula off | 26 | válvula off | válvula em | ||||||||
| 28 | válvula em | válvula off | |||||||||||
| 30 | válvula off | válvula em | |||||||||||
| 32 | válvula em | válvula off | |||||||||||
| 34 | válvula off |
. Tabela 1 Exemplo do protocolo de perfusão utilizado nesta experiência Solução A:. 9,7 g de sal de Hank (H1387), 0,35 g de NaHCO3, 5,96 g de HEPES a 1 L pH ajustado para 7,35 com NaOH Solução B:. Solução A + 0,04 mM Gln Solução C:.. Solução A + Gln 0,2 mM Solutião D:. Solução A + Gln 1 mM Solução E:. Solução A + 5 mM de Gln Solução F: Solução A + 5 mM Ala
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Discussion
O sucesso dos experimentos com imagens depende de alguns fatores críticos. Um desses factores é a afinidade dos sensores utilizados, como discutido acima. Concentração absoluta do substrato no compartimento subcelular de interesse, no entanto, é muitas vezes desconhecida. Portanto, recomendamos tentar vários sensores com afinidades escalonados para encontrar o que funciona melhor sob a condição experimental desejado. Por exemplo, no nosso caso, as células COS7 transfectadas com sensores de glutamina com 1.5μ, 100μ, 2m, e 8m (Figura 3 e dados não mostrados).
Outro fator importante é o nível de proteínas do sensor expressão. O nível de expressão é necessária para a detecção varia entre, as experiências, por exemplo, quando um evento de curta duração (por exemplo, o potencial de acção único) tem de ser observado um nível de expressão mais elevada poderá tornar-se necessário 19. Portanto, na maioria dos casos, o nível exigido tem de ser empirically determinada. Se o destino existe em concentrações muito baixas na célula, perturbação dos processos endógenos, devido ao esgotamento alvo pode se tornar um problema 20. Um ensaio independente para avaliar essa possibilidade, se disponível, é, portanto, desejável. Nas experiências apresentadas neste artigo, a expressão da proteína conduzido por promotor de CMV foi considerada suficiente. Em situações em que os promotores com actividades muito mais fracos precisam ser utilizados, os ajustes para aumentar a intensidade do sinal poderá tornar-se necessário. Por exemplo, um compromisso entre a intensidade do sinal e de foto-branqueamento durante a exposição precisa para ser atingido. Além de um tempo de exposição, como factores, tais como o brilho dos fluoróforos, a mudança de intensidade máxima do sensor, binning, e as sensibilidades de câmara CCD podem ser alteradas para melhorar a intensidade do sinal.
Quando nenhuma alteração na proporção é observada sob a condição experimental, apesar de os dois critérios acima referidos são susceptíveis deser cumprida, é possível que a homeostase celular para o metabolito ou ião dada é suficientemente forte para mascarar a actividade de transporte (ver a secção de resultados). Em tais casos, as linhas de células com diferentes actividades bioquímicas, pode ser necessária como um fundo para detectar as actividades de transportador 10, 21.
Embora estes sensores permitem controlar a dinâmica de concentração do substrato a uma resolução muito maior espaço-temporal do que os métodos à base de extracção, a determinação da concentração absoluta requer passos adicionais e considerações experimentais. Normalmente, a concentração do substrato é calculado no pressuposto de que a afinidade do sensor, geralmente calculadas por titulação da proteína purificada do sensor, é inalterado quando expressos na célula. A concentração é calculado através da seguinte ligação isotérmica único,
[S] = K d x (r - r min) / (r </ Em> max - r)
[S] é a concentração de substrato, K d é a constante de dissociação determinada in vitro, r é a razão aceitador / dador observados num dado instante de tempo, r min é o rácio aceitador / dador quando os sensores estão na forma apo e rmax é a razão aceitador / dador quando todos os sensores são ligados ao substrato. Rmin e Rmax são influenciados por parâmetros tais como a concentração de sensores, configurações de imagem utilizados e a composição do milleu celular, e, portanto, necessitam de ser medidos in situ . Para determinar r valores mínimo e máximo de r, as condições experimentais, que permite a modificação da concentração de substrato intracelular torna-se necessário. Por exemplo, os ionóforos selectivos (por exemplo, ionomicina durante Ca 2 +) 22 ou um reagente de perfuração tal como digitonin 23 pode ser usado para equilibrar a concentração de substrato com a concentração intracelular externo.
Uma das limitações do tipo de experiências demonstradas neste protocolo é a baixa taxa de transferência; a análise se limita a analisar um metabólito em um relativamente pequeno (<10) número de células. Os avanços tecnológicos estão sendo feitos, no entanto, para superar tais limitações. Por exemplo, com o avanço na automatizado, no rastreio de alto conteúdo, é agora possível usar sensores geneticamente codificados em combinações com molécula pequena ou biblioteca de RNAi; As células que expressam um biossensor pode ser cultivada em um formato de alto rendimento (por exemplo, 96 - ou 384 cavidades), em seguida, os poços individuais podem ser tratados com produtos químicos ou siRNA e fotografada. Estas experiências permitem a identificação de construções de siRNA ou produtos químicos que perturbam o processo biológico que pode ser observada com o biossensor 24 25. Outra recente inclusão avanço emocionantedes o desenvolvimento de um fluxo de microfluidos resolvida no tempo citómetro, que permite a detecção de alto rendimento de FRET variação da eficiência a um nível celular 26. Tais avanços técnicos ajudará descobertas de novos fármacos e novos componentes em processos biológicos.
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Disclosures
Não há nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder 1R21NS064412, concessão NSF 1052048 e Jeffress Memorial Trust concessão J-908.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted fluorescent microscope | Olympus | IX81F-3-5 | An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also be appropriate. |
| Excitation filter (mTFP1) | Omega Optical | 3RD450-460 | Band width 450-460 nm |
| Excitation filter (Venus) | Chroma | ET500/20 | Band width 490-510 nm |
| Emission filter (mTFP1) | Chroma | HQ495/30m | Band width 475-505 nm |
| Emission filter (Venus) | Chroma | ET535/30m | Band width 520-550 nm |
| Dichroic mirror (FRET channels) | Chroma | 470dcxr | Long pass, 470 nm cut off |
| Dichroic mirror (YFP channel) | Chroma | 89002bs | Passes 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm |
| mCherry filter set | Chroma | 49008 | Excitation 540-580 nm, long pass dichroic with 585 nm cut off, emission filter 595-695 nm |
| Light source | Olympus | U-LH100L-3-5 | LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended |
| CCD camera | Qimaging | Rolera-MGi EMCCD | |
| Apochromatic fluorescence objective | Olympus | ||
| Perfusion system, ValveBank II | AutoMate Scientific | [01-08] | Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work |
| Laminar-flow chambers | C&L Instruments | VC-MPC-TW | Other larminar-flow chambers would also work. |
| Chambered slide | Lab-Tek | 154534 | For open-chamber experiments |
| Perfusion pump | Thermo Scientific | 74-046-12131 | For open-chamber experiments |
| Software supporting ratiometric measurements | Intellegenent Imaging Innovation | Slidebook 5.5 | |
| Laminar flow biosafety cabinet | ESCO | LA-3A2 | |
| Isotemp CO2 Incubator | Thermo Scientific | 13-255-25 | |
| Dulbecco's MEM (DMEM) | Hyclone | SH30243.01 | |
| Cosmic calf serum | Hyclone | SH3008703 | |
| Penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I) | Invitrogen | 31985 | Used with Lipofectamine 2000 |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma | P4707 | |
| 25 mm circular glass cover slips | Thermo Scientific | 12-545-102 | In case VC-MPC-TW is used |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | Other transfection reagents can also be used. |
| Solution A (Hank's buffer) | 9.7 g HANK salt (Sigma H1387), 0.35 g NaHCO3, 5.96 g HEPES to 1 L, pH adjusted to 7.35 with NaOH | ||
| Solution B | Solution A + 0.04 mM Gln | ||
| Solution C | Solution A + 0.2 mM Gln | ||
| Solution D | Solution A + 1 mM Gln | ||
| Solution E | Solution A + 5 mM Gln | ||
| Solution F | Solution A + 5 mM Ala |
References
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