Summary
Dit artikel laat zien hoe u glutamine dynamiek in levende cellen met behulp van FRET. Genetisch gecodeerde sensoren mogelijk real-time monitoring van biologische moleculen op een subcellulaire resolutie. Experimenteel ontwerp, technische specificaties van de experimentele instellingen, en overwegingen voor post-experimentele analyses voor genetisch gecodeerd glutamine sensoren worden besproken.
Abstract
Genetisch gecodeerde sensoren mogelijk real-time monitoring van biologische moleculen op een subcellulaire resolutie. Een enorme verscheidenheid van dergelijke sensoren voor biologische moleculen werd in de afgelopen 15 jaar, waarvan werd onmisbare gereedschappen die routinematig worden gebruikt in veel laboratoria.
Een van de interessante toepassingen van genetisch gecodeerde sensoren is het gebruik van deze sensoren bij het onderzoek cellulaire transportprocessen. Eigenschappen van vervoerders zoals kinetiek en substraatspecificiteiten kan worden onderzocht op een cellulair niveau, mogelijkheden te bieden voor celtype specifieke analyses van transportactiviteiten. In dit artikel zullen we zien hoe transporter dynamiek kan worden waargenomen met behulp van genetisch gecodeerd glutamine sensor als voorbeeld. Experimenteel ontwerp, technische specificaties van de experimentele instellingen, en overwegingen voor post-experimentele analyses zullen worden besproken.
Introduction
Door opmerkelijke vooruitgang in technologie die onderzoek van de transcriptoom en proteoom op celniveau toelaat, is het nu duidelijk dat de biochemie en de resulterende flux van metabolieten en ionen zijn zeer specifiek celtype. Bijvoorbeeld, in de lever van zoogdieren, sequentiële glutamine afbraak en synthese gelijktijdig uitgevoerd door periportale cellen en periveneuze cellen respectievelijk toevoeren ammonium om het ureum cyclus in het eerste type cel en verbruikt overmaat ammoniak in de laatste 1-3. In sommige gevallen is significant biochemische heterogeniteit waargenomen zelfs in een "celtype" 4, 5. Naast dergelijke ruimtelijke specificiteit, de cellulaire niveaus van metabolieten en ionen die aan snelle veranderingen (bijv. signaalmoleculen zoals Ca2 + en cyclische nucleotiden). De spatiotemporele metabolieten en ionen spelen vaak cruciale rol in signaaltransductie. MMonitoring van cellulaire dynamiek van metabolieten en ionen, echter, vormen unieke uitdaging. In veel gevallen de verandering in concentraties snelle en voorbijgaande, geïllustreerd door het geval van signalerende moleculen zoals Ca2 +, die vervalt binnen ~ 20 msec dendritische 6. Bovendien compartimentering van biochemische pathways in en tussen de cellen maakt het moeilijk om de dynamiek van metabolieten en ionen kwantificeren middels extractie en chromatografie / massaspectrometrie technieken.
Genetisch gecodeerde sensoren voor biologische moleculen worden nu op grote schaal gebruikt vanwege de hoge spatiotemporal resolutie waarmee de experimentator om kortstondige en / of gecompartimenteerde moleculaire dynamica te bestuderen (beoordeeld 7, 8). Deze genetisch gecodeerde sensoren kunnen grofweg worden onderverdeeld in twee categorieën; intensiteit gebaseerde sensoren en ratiometic sensoren. Intensiteit gebaseerde sensoren bestaan doorgaans uit een bindend domein en een grieporescent eiwit (FP), en de opgeloste binding aan het bindingsdomein verandert de fluorescentie-intensiteit. Ratiometic sensoren, daarentegen, vaak gebruik maken van Foster Resonance Energy Transfer (FRET) tussen twee KP die functioneren als FRET-paar. Deze sensoren bestaan uit een bindend domein en twee KP's, en de opgeloste stof binding induceert de verandering in de FRET efficiëntie tussen de twee KP's. Een groot aantal sensoren voor biologische belangrijke metabolieten en ionen ontwikkeld in het afgelopen decennium 8, 9.
Een van de interessante mogelijkheid die zodanig genetisch gecodeerde sensoren is hun gebruik in de hoge-resolutie analyse van membraantransport processen die voorheen moeilijk te detecteren op cellulair niveau. Genetisch gecodeerde sensoren vergemakkelijken de analyse van mechanismen vervoer, zoals substraat specificiteit en pH-afhankelijkheid 10, 11. Bovendien, in combinatie met de genetische resRONNEN zoals de bibliotheek van RNAi constructen voor modelorganismen, is het nu mogelijk om genoom-brede bevragen voor nieuwe transportprocessen met genetisch gecodeerde sensoren. Inderdaad, het gebruik van genetisch gecodeerde sensor aan de ontdekking van eerder gekenmerkte transporters in meerdere gevallen 12, 13.
Onlangs heeft ons laboratorium een reeks van FRET-gebaseerde sensor voor glutamine ontwikkeld. We hebben aangetoond dat cellulaire glutamine niveaus kunnen worden gevisualiseerd met behulp van dergelijke FRET glutamine sensoren 10. Deze sensoren omvatten een FRET-donor (mTFP1) ingebracht in een bacterieel glutamine bindingseiwit glnH en een FRET acceptor (venus) en de C-termini van glnH (figuur 1). FRET efficiëntie van deze sensoren verminderen na binding van glutamine, waardoor de afname van acceptor / donor intensiteitverhouding. Fijnregeling glutamine transportprocessen belangrijk in biologische processen zoals neurotransmissie 14, 15 en het behoud van ureum cyclus in de lever 1, 16, 17.
Hier laten we de methodologie voor het analyseren van transportactiviteiten met FRET sensoren voor glutamine, met behulp van een wide-field fluorescentie microscoop set-up. Het doel van de experimenten hier moeten transporter activiteiten op te sporen in een vak en substraatspecificiteit van een tijdelijk tot expressie transporter onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Monstervoorbereiding
Opmerking: In veel gevallen was perfusie experimenten weg een aanzienlijk deel van de cellen, die een frustrerend probleem kan worden. Hoewel niet noodzakelijk voor alle cellijnen, coaten dekglas oppervlakken met poly-L-lysine (voeg 1,0 ml/25 cm2 van 0,01% oplossing van de oppervlakte, incubeer> 5 min, tweemaal spoelen met celkweek kwaliteit water en droog de bioveiligheid kast) verbetert cel adhesie. Ook de hoogte van de bioveiligheid niveau (BSL) van de gebruikte cellijn, en volg de standaard werkwijze van de lokale milieu-gezondheid en veiligheid kantoor goedgekeurd. In dit experiment werden COS7 cellen gebruikt vanwege lage endogene glutamine transportactiviteit (zie figuur 4).
- Zaad COS7 cellen bij ~ 70-80% confluentie in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% kosmische kalfsserum en 100 U / ml penicilline / streptomycine, hetzij op steriele 25 mm dekglaasjes geplaatst in 6-putjesgerecht of 8-well glazen bodem dia's. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2, 100% vochtigheid gedurende 24 uur.
- Vervang het groeimedium DMEM +10% kosmische kalfsserum (geen antibiotica), volgens het protocol van de fabrikant. Grow O / N bij 37 ° C, 5% CO 2 bij 100% vochtigheid.
- Voeg 0,4 mg elk plasmide DNA dat codeert voor glutamine sensor (pcDNA3.1, dragen FLIPQTV3.0 sensor in CMV-promoter 10) en mCherry-gelabelde ASCT2 10 tot 50 ml serumvrij medium (OPTI-MEM) en meng voorzichtig.
- Voeg 1 ml transfectie reagens 50 ml serumvrij medium. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Meng de twee oplossingen die DNA (stap 1.3) en transfectie reagens (stap 1.4) en incubeer gedurende 20 minuten.
- Voeg voorzichtig de transfectie reagens bovenop de cellen en meng voorzichtig door het schommelen van de kamer. Incubeer 24 uur bij 37 ° C, 5% CO2, 100% vochtigheid.
- Na 24 uur wisselen de middellange tot DMEM + 10% Cosmic Calf Serum(CCS) + 100 eenheden van penicilline / streptomycine.
- Cellen worden afgebeeld 48-72 uur na transfectie.
2. Perfusie Experiment
Opmerking: COS7 cellen die in dit experiment werden perfusie media kamer bij kamertemperatuur bewaard en omgeving CO2 concentratie. Indien de cellen die worden gebruikt vereisen hogere temperatuur en CO2-concentratie controle te overleven, verwarmde microscoop podium en / of een klimaatkamer worden gebruikt.
- Bereid perfusiebuffer AF (Zie lijst van materialen). Hechten kranen tot 50 ml spuiten, sluit de kranen dan vul ze met de bloedtransfusie-oplossingen. Open de kraan voor een korte periode om de kopruimte in de kraan met de buffer te vullen.
- Schakel de 8-kanaals, bovenbeker perfusie-systeem met een perfusie potlood, en selecteer vervolgens "Manual Mode" onder Selecteer Functie optie. Plaats een afvalcontainer onder de perfusie potlood.
- Handmatigactiveer de poorten door op de bijbehorende nummers en vullen de leidingen met behulp van 10 ml spuit met water en sluit de poort. Nadat de poorten zijn gevuld met water, zet de spuiten met buffers AF op de haven 1-6 van perfusie-systeem, en open de kranen. Open opnieuw de poorten om het water te vervangen in de buis met de buffers. De stroomsnelheid moet ongeveer 0,8 ml / min zijn.
- Druk eenmaal op Annuleren op het perfusie controller om terug naar het menu "Select Function" gaan. Schakelen naar "Edit Program"-optie, typ dan de perfusie protocol aangegeven in tabel 1. Sla het perfusie programma.
- Neem de cellen uit de incubator. Twee keer wassen met de perfusie buffer, en vervolgens de cellen op het podium. Sluit de perfusie-systeem naar de kamer. Als een open kamer wordt gebruikt, het opzetten van een andere pomp die de perfusie-oplossing uit de kamer verwijderd.
- Open Slidebook software. Start een nieuwe dia.
Opmerking: Devolgende procedure is specifiek voor Slidebook software, maar ook andere software zoals Metafluor en Nis-element kan ook worden gebruikt voor het type beeldvorming beschreven. Theoretisch experimenten kunnen uitgevoerd worden met elke software die tijdsverloop imaging maakt het mogelijk, en het beeld sequenties kunnen post-experimenteel worden geanalyseerd met behulp van software zoals ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) of Fiji (http:/ / fiji.sc / Fiji). Echter, software die real-time monitoring van acceptor / donor verhouding maakt is zeer nuttig. - Monteer de glijbaan op de fluorescentie microscoop podium. Vind de cellen co-uiting van de sensor en ASCT-mCherry behulp van geschikte filter sets (zie lijst van materialen) onder de functie "FOCUS". Stel de versterking door te klikken op het tabblad "Camera" en schuiven de schuifbalk onder "winst". Stel ook de filter met neutrale dichtheid instelling van grijsfilter drop-down menu. Opmerking: Als de filter kubus een oog-filter bevat, geen gebruik maken van de oculairen sinds short-golflengte excitatie licht is schadelijk voor de ogen. Gebruik het scherm om de cellen in plaats daarvan vinden.
- Acquire beelden van cellen with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (Filters worden gespecificeerd in de lijst van materialen). Klik op "Beeld vastleggen", en vervolgens in de overname-venster geeft u de filters die gebruikt gaan worden. Klik op "TEST" knop om de belichtingstijd aanpassen door het intypen van de gewenste belichtingstijd in het vak naast de filter instellingen. Opmerking: Alle drie kanalen moeten worden blootgesteld aan dezelfde lengte. Bij het afstellen van de beeldvormende parameters, neemt de verwachte efficiëntie FRET veranderingen en voudige toename in aanmerking: bijvoorbeeld als de FRET-efficiëntie zal naar verwachting 2-voudig tijdens het experiment gaan, beeldparameters moeten worden aangepastzodat de intensiteit van de donor af acceptor ze op de rusttoestand moet <50% van de maximale waarde die kan worden opgenomen door het instrument, zodat kanaal niet verzadigd tijdens het experiment. Signaal van de gemerkte cellen ten minste drie keer hoger dan de achtergrond regio.
- Teken een regio van belang het gebruik van gebieden gereedschap in de software. Alternatief kan een software functie pixels hierboven bepaalde intensiteit selecteren worden gebruikt en vervolgens omgezet in gebieden. Om dit te doen, klik Mask - Segment, verplaats de schuifbalk naar de gewenste gebieden te markeren.
- Selecteer "time lapse" in het soort capture doos, dan geeft u het interval (10 sec in dit experiment) en tijdstippen voor het experiment.
- Teken een regio in een gebied zonder fluorescerende cellen. Dit gebied wordt gebruikt voor de achtergrond aftrekken. Klik rechts op de regio getrokken, en dan instellen als achtergrond. Opmerking: Idealiter cellen die niet zijnt expressie sensoren worden gebruikt als achtergrondgebied om zowel de autofluorescentie en de achtergrond fluorescentie gedetecteerd door de camera. Indien dergelijke cellen in het gezichtsveld, tenminste een gebied zonder de cellen worden ter verwerking van de achtergrond fluorescentie.
- Selecteer het gewenste programma onder "Select Function - Run programma" optie. Schakelen naar de opgeslagen programma (zie stap 2.3), en dan druk op ENTER op de perfusie controller. Nu het programma is geladen, en op een toets zal de perfusie te starten.
- Zorgen voor perfusie en de beeldvorming experiment te starten op hetzelfde moment door te klikken op "Start" knop in het venster vast te leggen op hetzelfde moment als het indrukken van een toets op de perfusie controller.
Opmerking: Het wordt aanbevolen om het meetpunt waar de oplossingen werden uitgewisseld (dit kan worden gedaan met behulp van "OPMERKINGEN" functie, te vinden in het tabblad overname) opnemen. - Voer dezelfde perfusieprotocol using cellen die een sensor die wordt verwacht verzadigd of ongebonden om onder de experimentele conditie.
Opmerking: Hier, FLIPQTV3.0_1.5μ, dat verzadigd onder dezelfde voorwaarde, wordt gebruikt als controle, Figuur 6 Een dergelijke beheersing experimenten zijn nodig om te bevestigen dat de FRET efficiëntie verandering door de feitelijke verandering in het substraat en niet. door de verandering van andere parameters zoals cellulaire pH.
3. Post-experiment Analyse
- Onderzoeken of sample drift is opgetreden tijdens het experiment. Teken regio's van belang (ROI) s op het beeld dat bij timepoint 0, verplaats de schuifbalk aan de bovenkant van de beeldvorming venster en controleer of de cellen van de ROI's vallen in beelden later in het experiment genomen.
- Zo ja, gebruik dan de tracking-functie om te corrigeren voor de drift door het eerste, het creëren van maskers rond de cellen door het selecteren Mask - Segment, schuif vervolgens de lijn die de cutoff aangeeft om highlight de gebieden met cellen. Volg de regio door te klikken Mask - Particle Tracking - Basic particle tracking.
- Hertekenen de ROI en de achtergrond regio indien nodig.
- Exporteren de gemiddelde intensiteit van het ROI in de loop van het experiment. Klik Statistieken - Export - Ratio / timelapse gegevens.
- Bij FRET efficiëntie en kwantificering van substraatconcentratie is niet nodig, plot het tijdsverloop van de intensiteitverhouding (Donor ex Handelaar em / Donor Donor ex em) als maatstaf voor de dynamiek van het substraat. De cytosolische concentratie bepalen berekent de maximale en minimale verhouding verandering (dat wil zeggen in de verzadigende en afwezigheid van het substraat, respectievelijk), Ar max - min Ar, door niet-lineaire regressie van Δratio (Ar) met de volgende vergelijking:
Ar = [S] / (K d + [S]) x (Ar
waarbij [S] de substraatconcentratie in het cytosol. De Ar max - min Ar verkregen waarden, verzadiging (S) van de sensor op een gegeven Ar wordt berekend als
S = (Ar - Ar min) / (max Ar - Ar min)
S kan verder worden omgezet in de substraatconcentratie [S] met de volgende vergelijking:
S = [S] / (K d + [S])
Let op: de intensiteit van Acceptant ex Acceptant em kanaal moet ook uitgezet om te onderzoeken of de experimentele conditie beïnvloed de fluorescentie van de acceptor direct. - Wanneer een basislijn drift vanwege fotoblekingsreactie wordt waargenomen, het uitvoeren van een basislijn correctie. Om dit te doen, plot de intensiteiten van donor en acceptor in de tijd (figuur 5A). Vervolgens identificeer ik de tijdstippen gebruikt voor the basislijn volgens de vertraging bij het perfusie systeem en de transportactiviteit van de bepaalde cel (Figuur 5B).
- Bereken een kromme passend dat het beste beschrijft de basislijn. Dan, normaliseren de rauwe intensiteit van elk meetpunt aan de basislijn (figuur 5C). Bereken de intensiteit ratio (Donor ex Acceptor em, / Donor ex Donor em) van de genormaliseerde donor en acceptor intensiteiten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typische tijdsverloop experimenten zijn weergegeven in figuur 2. Bij deze experimenten FRET glutamine sensoren met affiniteiten van 8 mM (FLIPQTV3.0_8m figuur 2A en 2B) en 100 uM (FlipQTV3.0_100 μ C en D) werden co-expressie gebracht met een verplichte aminozuur wisselaar ASCT2 18 in COS7 cellen 10. Influx van glutamine wordt gedetecteerd als de verandering in fluorescentie-intensiteit verhouding tussen de donor (mTFP1) en acceptor (venus) (Figuur 2A en 2C). Efflux van glutamine in aanwezigheid van een substraat (Ala) is ook duidelijk aangetoond in deze experimenten. Met beide sensoren genormaliseerde fluorescentie intensiteiten veranderen samengebouwd (dwz de donor intensiteit stijgt, de acceptor intensiteit daalt, figuur 2B en 2D) in aanwezigheid van substraat, die suggereren dat de verhouding verandering waargenomen zal immers to de verandering in FRET efficiëntie. Deze experimenten tonen aan dat de glutamine concentratie in deze cellen zeer dynamisch fluctueren onder experimentele conditie; van het detectiebereik van 100 uM sensor om de bijna verzadigingsconcentratie 8 mM sensor.
Substraatspecificiteiten van vervoerders kunnen worden onderzocht met sensoren, getoond in figuur 3. In deze experimenten werden de cellen vooraf geladen met glutamine, en verschillende aminozuren werden toegevoegd aan de extracellulaire perfusaat onderzocht of deze aminozuren glutamine efflux kan induceren. Zoals verwacht, ASCT2 substraten (Ala, Ser, Cys, Thr, D-serine) geïnduceerde glutamine efflux (fig. 3A), terwijl niet-substraat aminozuren (Pro, His, Lys) niet (fig. 3B), bevestigende met eerdere studies 18. Meestal wordt substraatspecificiteit gemeten competitietesten met een radio-isotoop gemerkt substraat gemengd met concurrerende substraat, Die is vrij omslachtig en vereist een populatie cellen die gelijkmatig expressie de transporteur te bestuderen. Optische beeldvorming hier geïllustreerd biedt een alternatieve benadering.
Indien geen FRET veranderingen efficiëntie waargenomen na toevoeging van het substraat, kunnen verschillende redenen worden beschouwd. Een mogelijke reden is de lage opname capaciteit voor het substraat getest en / of hoge activiteiten van enzymen die de concentratie in de cellen te handhaven. Bijvoorbeeld, glutamine concentratie verandering minimaal in COS7 cellen die geen expressie ASCT2 transporter voorwaarde getest terwijl deze cellijn duidelijk groeien in de media waarin glutamine in de belangrijkste stikstofbron (figuur 4). Bovendien, indien de affiniteit van de sensor te hoog of te laag in vergelijking met de intracellulaire concentratie meeste sensor eiwitten constitutief gebonden of ongebonden respectievelijk blijven; dus geen FRET efficiëntie wijziging zal worden detected.
Figuur 1. Configuratie van een FRET-glutamine sensor. (A) Open (cyaan) en gesloten (geel) conformatie van glnH, glutamine bindend eiwit van E.coli. De positie waar mTFP1 wordt ingebracht wordt gemarkeerd in magenta. (B) Schematische voorstelling van FLIPQTV_3.0 sensoren.
Figuur 2. In vivo glutamine metingen met behulp FLIPQ-TV3.0_8m en 100μ sensoren. (A) De venus/mTFP1 verhouding van COS7 cellen die co-expressie FLIPQ-TV3.0_8m sensor ASCT2-mCherry. mCherry tag werd gebruikt om de cellen die transport identificerener zonder storende de mTFP1 of venus emissie kanalen. De cellen werden geperfuseerd met HEPES-gebufferde Hank's buffer (pH 7.35). Tijdstippen wanneer extracellulaire glutamine (rood) en alanine (blauw) werd toegevoegd aan de perfusie media worden aangeduid als vakjes boven de grafiek. Solide en onderbroken lijnen vertegenwoordigen twee afzonderlijke cellen gemeten in hetzelfde experiment. (B) De intensiteiten van donor (mTFP1) en acceptor (Venus) kanalen in de in (A) experiment. De waarden werden gecorrigeerd voor fotobleken en genormaliseerd naar de basislijn. (C) en (D) een soortgelijk experiment als in (A) en (B), uitgevoerd met COS7 cellen die de FLIPQ-TV3.0_100μ sensor. (Figuur gewijzigd van 10).
Figuur 3. Eliminatie van cellulaire glutamine through de ASCT2 vervoerder de aanwezigheid van externe aminozuren, gevisualiseerd met FLIPQ-TV3.0_8m sensor. (A) cytosolische glutamine wordt uitgevoerd door het toevoegen van extracellulaire Ala, Ser, Cys, Thr, en D-ser. Tijdstippen wanneer extracellulaire glutamine (rode vakjes) of andere aminozuren (blauwe dozen) werden toegevoegd aan de perfusie media worden aangeduid als vakjes boven de grafiek. (B) toevoeging van Pro, Lys, His (zwarte blokken) ofwel cytosolische glutamine concentratie wijzigen , terwijl de toevoeging van Ala (blauwe vakken) bevordert de export van glutamine. Vaste en stippellijnen vertegenwoordigen twee afzonderlijke cellen gemeten in hetzelfde experiment. Alle aminozuren werden toegevoegd met 5 mM externe concentraties. (Figuur werd oorspronkelijk gepubliceerd op 10).
Figuur 4. Het venus/mTFP1 verhouding van COS7 cellen expressing FLIPQ-TV3.0_8m sensor (A) en 100μ sensor (B). De cellen werden geperfuseerd met HEPES-gebufferde Hank's buffer. Tijdstippen wanneer extracellulaire glutamine (5 mM) werd toegevoegd aan de perfusie media worden aangeduid als rode vakjes boven de grafiek. Vaste en stippellijnen vertegenwoordigen twee afzonderlijke cellen gemeten in hetzelfde experiment.
Figuur 5. Corrigeren voor fotobleken. (A) Raw intensiteiten van twee cellen weergegeven in Figuur 2A en 2C. (B) Datapunten die werden geselecteerd voor de berekening van de basislijnen. Polynoom curven worden getoond in de figuur. (C) Intensiteit kanalen getoond in A, genormaliseerd tegen de basislijn berekende B. De gegevensset die in deze figuur is identical aan die getoond in figuur 2A en 2C.
Figuur 6. In vivo metingen met glutamine FLIPQ-TV3.0_1.5m sensor. (A) De venus/mTFP1 verhouding van COS7 cellen die co-expressie FLIPQ-TV3.0_1.5m sensor ASCT2-mCherry. mCherry tag werd gebruikt om de cellen die de vervoerder, zonder storende de mTFP1 of venus emissie kanalen identificeren. De cellen werden geperfuseerd met HEPES-gebufferde Hank's buffer (pH 7.35). Tijdstippen wanneer extracellulaire glutamine (rood) en alanine (blauw) werd toegevoegd aan de perfusie media worden aangeduid als vakjes boven de grafiek. Solide en onderbroken lijnen vertegenwoordigen twee afzonderlijke cellen gemeten in hetzelfde experiment. (B) De intensiteiten van donor (mTFP1) en acceptor (venus) kanalenin de volgorde (A) experiment. De waarden werden gecorrigeerd voor fotobleken en genormaliseerd naar de basislijn.
| Tijd (min) | Oplossing A | Oplossing B | Oplossing C | Oplossing D | Oplossing E | Solution F | |||||||
| 0 | ventiel op | ||||||||||||
| 2 | ventiel af | ventiel op | |||||||||||
| 4 | ventiel op | ventiel af | |||||||||||
| 6 | ventiel af | ventiel op | |||||||||||
| 8 | ventiel op | ventiel af | 10 | ventiel af | ventiel op | ||||||||
| 12 | ventiel op | ventiel af | |||||||||||
| 14 | ventiel af | ventiel op | |||||||||||
| 16 | ventiel op | ventiel af | |||||||||||
| 18 | ventiel af | ventiel op | |||||||||||
| 20 | ventiel op | ventiel af | |||||||||||
| 22 | ventiel af | ventiel op | |||||||||||
| 24 | ventiel op | ventiel af | 26 | ventiel af | ventiel op | ||||||||
| 28 | ventiel op | ventiel af | |||||||||||
| 30 | ventiel af | ventiel op | |||||||||||
| 32 | ventiel op | ventiel af | |||||||||||
| 34 | ventiel af |
. Tabel 1 Voorbeeld van de perfusie protocol in dit experiment Oplossing A:. 9,7 g STRENG zout (H1387), 0,35 g NaHCO3, 5,96 g HEPES 1 L pH 7,35 met NaOH Oplossing B:. Oplossing A + 0,04 mM Gin Oplossing C:.. Oplossing A + 0,2 mM Gin Solution D:. Oplossing A + 1 mM Gin Oplossing E:. Oplossing A + 5 mM Gin Oplossing F: Oplossing A + 5 mM Ala
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het succes van beeldvormende experimenten hangt af van een aantal kritische factoren. Een van deze factoren is de affiniteit van sensoren, zoals hierboven besproken. Absolute concentratie van het substraat in het subcellulaire compartiment van belang is echter vaak onbekend. Daarom raden we proberen meerdere sensoren met verspringende affiniteiten aan degene die het beste werkt onder de gewenste experimentele conditie te vinden. Bijvoorbeeld, in ons geval hebben we de getransfecteerde COS7 cellen met glutamine sensoren met 1.5μ, 100μ, 2m en 8m (Figuur 3 en gegevens niet getoond).
Een andere belangrijke factor is de expressie van sensor eiwitten. Het niveau van expressie vereist voor de detectie varieert, experimenten, bijvoorbeeld bij een kortstondige gebeurtenis (bijvoorbeeld enkele actiepotentiaal) moet worden genomen een hoger expressieniveau noodzakelijk zou 19 worden. Daarom is in de meeste gevallen het vereiste niveau moet worden empirically bepaald. Als het doel bestaat in zeer lage concentratie in de cel, kan verstoring van de endogene processen vanwege uitputting richten probleem 20 worden. Een onafhankelijke bepaling dergelijke mogelijkheid, indien beschikbaar, is daarom wenselijk. In de in dit artikel experimenten eiwitexpressie aangedreven door CMV promoter bleek voldoende. In situaties waarin promoters met veel zwakkere activiteiten moeten worden gebruikt, kunnen aanpassingen van de signaalintensiteiten verhogen noodzakelijk. Zo compromis tussen de signaalintensiteit en fotoblekingsreactie tijdens de belichting moet worden bereikt. Naast langere belichtingstijd, kunnen factoren zoals de helderheid van de fluoroforen, maximale intensiteit verandering van de sensor, binning, en de gevoeligheden van de CCD-camera worden veranderd om de signaalsterkte te vergroten.
Als er geen verandering verhouding waargenomen onder dezelfde voorwaarde, hoewel de bovenstaande twee criteria waarschijnlijkworden voldaan, is het mogelijk dat de cellulaire homeostase voor de gegeven metaboliet of ion sterk genoeg is om de vervoersactiviteiten maskeren (zie de sectie resultaat). In zulke gevallen kunnen de cellijnen met verschillende biochemische activiteiten vereist als achtergrond van de transporteur activiteiten 10, 21 detecteren.
Hoewel deze sensoren laten ons toe om concentratie dynamiek van het substraat te volgen bij veel hogere resolutie dan spatiotemporal-extractie-gebaseerde methoden, bepaling van de absolute concentratie vereist verdere experimentele stappen en overwegingen. Gewoonlijk wordt de substraatconcentratie in de veronderstelling dat affiniteit van de sensor, meestal berekend door titratie gezuiverd sensor eiwit ongewijzigd uitgedrukt in de cel. De concentratie wordt berekend met de volgende enkele binding isotherm,
[S] = K x d (r - r min) / (r </ Em> max - r)
[S] de substraatconcentratie, Kd de dissociatieconstante in vitro bepaald, r de acceptor / donor verhouding waargenomen op een bepaald tijdpunt, Rmin is de acceptor / donor verhouding als sensoren in de apo vorm en Rmax wordt de acceptor / donor verhouding wanneer alle sensoren gebonden aan het substraat. Rmin en Rmax worden beïnvloed door parameters zoals de concentratie sensoren, weergave-instellingen gebruikt en de samenstelling van de cellulaire milleu, en dus moeten worden in situ . Om r min en r max waarden, experimentele omstandigheden die het mogelijk maakt modificatie van intracellulaire substraat concentratie noodzakelijk te bepalen. Bijvoorbeeld selectieve ionoforen (bijv. ionomycine voor Ca 2 +) 22 of perforeren reagens zoals digitonin 23 kan worden gebruikt om de intracellulaire substraatconcentratie equilibreren met de externe concentratie.
Een van de beperkingen van het type experimenten aangetoond in dit protocol de geringe productie; de analyse is beperkt tot de analyse van een metaboliet in een relatief klein (<10) aantal cellen. Technologische vooruitgang wordt geboekt, echter, om dergelijke beperkingen te overwinnen. Bijvoorbeeld, met de vooruitgang in geautomatiseerde high content, is het nu mogelijk om genetisch gecodeerde sensoren in combinatie met kleine molecuul of RNAi bibliotheek; cellen die een biosensor kan worden gekweekt in een high-throughput formaat (bijv., 96 - of 384 putjes), vervolgens afzonderlijke putjes worden behandeld met siRNA of chemicaliën en afgebeeld. Deze experimenten laten identificeren siRNA constructen of chemicaliën die de biologische proces dat kan worden waargenomen door de biosensor 24 25 verstoren. Een andere interessante recente vooraf includes ontwikkeling van tijdsopgeloste microfluïdische flowcytometer die high-throughput detectie van FRET efficiëntie wijziging maakt op cellulair niveau 26. Deze technische vooruitgang zal helpen ontdekkingen van nieuwe kandidaat-geneesmiddelen en nieuwe componenten in biologische processen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er is niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie 1R21NS064412, NSF subsidie 1.052.048 en Jeffress Memorial Trust subsidie J-908.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted fluorescent microscope | Olympus | IX81F-3-5 | An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also be appropriate. |
| Excitation filter (mTFP1) | Omega Optical | 3RD450-460 | Band width 450-460 nm |
| Excitation filter (Venus) | Chroma | ET500/20 | Band width 490-510 nm |
| Emission filter (mTFP1) | Chroma | HQ495/30m | Band width 475-505 nm |
| Emission filter (Venus) | Chroma | ET535/30m | Band width 520-550 nm |
| Dichroic mirror (FRET channels) | Chroma | 470dcxr | Long pass, 470 nm cut off |
| Dichroic mirror (YFP channel) | Chroma | 89002bs | Passes 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm |
| mCherry filter set | Chroma | 49008 | Excitation 540-580 nm, long pass dichroic with 585 nm cut off, emission filter 595-695 nm |
| Light source | Olympus | U-LH100L-3-5 | LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended |
| CCD camera | Qimaging | Rolera-MGi EMCCD | |
| Apochromatic fluorescence objective | Olympus | ||
| Perfusion system, ValveBank II | AutoMate Scientific | [01-08] | Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work |
| Laminar-flow chambers | C&L Instruments | VC-MPC-TW | Other larminar-flow chambers would also work. |
| Chambered slide | Lab-Tek | 154534 | For open-chamber experiments |
| Perfusion pump | Thermo Scientific | 74-046-12131 | For open-chamber experiments |
| Software supporting ratiometric measurements | Intellegenent Imaging Innovation | Slidebook 5.5 | |
| Laminar flow biosafety cabinet | ESCO | LA-3A2 | |
| Isotemp CO2 Incubator | Thermo Scientific | 13-255-25 | |
| Dulbecco's MEM (DMEM) | Hyclone | SH30243.01 | |
| Cosmic calf serum | Hyclone | SH3008703 | |
| Penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I) | Invitrogen | 31985 | Used with Lipofectamine 2000 |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma | P4707 | |
| 25 mm circular glass cover slips | Thermo Scientific | 12-545-102 | In case VC-MPC-TW is used |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | Other transfection reagents can also be used. |
| Solution A (Hank's buffer) | 9.7 g HANK salt (Sigma H1387), 0.35 g NaHCO3, 5.96 g HEPES to 1 L, pH adjusted to 7.35 with NaOH | ||
| Solution B | Solution A + 0.04 mM Gln | ||
| Solution C | Solution A + 0.2 mM Gln | ||
| Solution D | Solution A + 1 mM Gln | ||
| Solution E | Solution A + 5 mM Gln | ||
| Solution F | Solution A + 5 mM Ala |
References
- Haussinger, D. Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle. Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).
- Haussinger, D.
- Watford, M., Chellaraj, V., Ismat, A., Brown, P., Raman, P.
- Mustroph, A., et al. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 18843-18848 (2009).
- Sasagawa, Y., et al. Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity. Genome Biol. 14, R31 (2013).
- Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. The life cycle of Ca(2+) ions in dendritic spines. Neuron. 33, 439-452 (2002).
- Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative imaging with fluorescent biosensors. Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).
- Newman, R. H., Fosbrink, M. D., Zhang, J. Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells. Chemical reviews. , 111-3666 (2011).
- Okumoto, S. Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors. Curr Opin Biotech. 21, 45-54 (2010).
- Gruenwald, K., et al. Visualization of glutamine transporter activities in living cells using genetically encoded glutamine sensors. PLoS One. 7, e38591 (2012).
- Chaudhuri, B., et al. Protonophore- and pH-insensitive glucose and sucrose accumulation detected by FRET nanosensors in Arabidopsis root tips. Plant Journal. 56, 948-962 (2008).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
- Jiang, D. W., Zhao, L. L., Clapham, D. E. Genome-Wide RNAi Screen Identifies Letm1 as a Mitochondrial Ca2+/H+ Antiporter. Science. , 326-147 (2009).
- Barnett, N. L., Pow, D. V., Robinson, S. R. Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light. Glia. 30, 64-73 (2000).
- Rothstein, J. D., Tabakoff, B. Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition. J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).
- Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. X. Differential regulation of amino acid transporter SNAT3 by insulin in hepatocytes. J Biol Chem. 280, 26055-26062 (2005).
- Palmada, M., Speil, A., Jeyaraj, S., Bohmer, C., Lang, F. The serine/threonine kinases SGK1, 3 and PKB stimulate the amino acid transporter ASCT2. Biochem Bioph Res Co. 331, 272-277 (2005).
- Bröer, A., et al. The astroglial ASCT2 amino acid transporter as a mediator of glutamine efflux. J Neurochem. 73, 2184-2194 (1999).
- Wallace, D. J., et al. Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor. Nature. 5, 797-804 (2008).
- Haugh, J. M. Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring. Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).
- San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PLoS One. 8, e57712 (2013).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
- Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).
- Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening. PLoS One. 6, e20114 (2011).
- Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter. Science. 326, 144-147 (2009).
- Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells. J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).
