Summary
Denne artikel vil vise, hvordan man kan overvåge glutamin dynamik i levende celler ved hjælp af bånd. Genetisk kodede sensorer giver real-time overvågning af biologiske molekyler på en subcellulære opløsning. Eksperimentelle design, tekniske detaljer i de eksperimentelle indstillinger og overvejelser for post-eksperimentelle analyser vil blive diskuteret for genetisk kodet glutamin sensorer.
Abstract
Genetisk kodede sensorer giver real-time overvågning af biologiske molekyler på en subcellulære opløsning. En enorm række af sådanne sensorer til biologiske molekyler blev tilgængelig i de sidste 15 år, hvoraf nogle er blevet uundværlige værktøjer, der anvendes rutinemæssigt i mange laboratorier.
En af de spændende anvendelser af genetisk indkodede sensorer er anvendelsen af disse sensorer i undersøge cellulære transportprocesser. Egenskaber for transportvirksomheder, såsom kinetik og substratspecificiteter kan undersøges på et cellulært niveau, der giver muligheder for celle-type specifikke analyser af transportaktiviteter. I denne artikel vil vi vise, hvordan transporter dynamik kan observeres ved hjælp af genetisk kodet glutamin sensor som et eksempel. Eksperimentelle design, tekniske detaljer i de eksperimentelle indstillinger og overvejelser for post-eksperimentelle analyser vil blive drøftet.
Introduction
På grund af bemærkelsesværdige fremskridt i teknologier, der muliggør undersøgelse af transkriptomet og proteomet på et cellulært niveau, er det nu blevet klart, at biokemi og den resulterende flux af metabolitter og ioner er meget celletypespecifik. For eksempel i pattedyrs lever, sekventiel glutamin nedbrydning og syntese udføres samtidigt ved periportale celler og perivenøs celler henholdsvis fodring ammonium til urinstof-cyklus i det tidligere celletype mens forbrugende overskydende ammoniak i sidstnævnte 1-3. I nogle tilfælde er betydelig biokemisk heterogenitet påvises selv i en enkelt "celletype" 4, 5. Ud over en sådan rumlig specificitet er de cellulære niveauer af metabolitter og ioner er meget dynamisk (f.eks signalmolekyler, såsom Ca2 + og cycliske nukleotider). De spatiotemporale mønstre af metabolitter og ioner ofte spiller afgørende roller i signaltransduktion. MILSYN cellulære dynamik metabolitter og ioner dog anledning unik udfordring. I mange tilfælde ændringen i koncentrationen er hurtige og forbigående, eksemplificeret ved tilfælde af signalmolekyler, såsom Ca2 +, som henfalder inden for ~ 20 msek i dendritiske spidser 6. Desuden opdeling af biokemiske veje i og mellem cellerne gør det vanskeligt at kvantificere dynamikken af metabolitter og ioner ved hjælp af ekstraktion og søjlekromatografi / massespektrometri teknikker.
Genetisk indkodede sensorer til biologiske molekyler er nu i vid udstrækning på grund af den høje Spatiotemporal opløsning, der gør det muligt for forsøgslederen at studere kortlivede og / eller opdelte molekylær dynamik (revideret i 7, 8). Disse genetisk kodede sensorer kan groft inddeles i to kategorier; intensitet-baserede sensorer og ratiometic sensorer. Intensity-baserede sensorer består typisk af en bindende domæne og et influenzaorescent protein (RP), og det opløste stof binder til bindingsdomænet ændrer fluorescensintensiteten. Ratiometic sensorer, på den anden side ofte drage fordel af Foster Resonance Energy Transfer (FRET) mellem to RP'er, der fungerer som et FRET-par. Disse sensorer består af en bindende domæne og to rammeprogrammer, og det opløste stof binding inducerer ændringen i FRET effektivitet mellem de to rammeprogrammer. Et stort antal sensorer til biologisk vigtige metabolitter og ioner er blevet udviklet i de sidste ti år 8, 9.
En af de spændende mulighed, der tilbydes af sådanne genetisk kodede sensorer er deres anvendelse i analysen af membran transportprocesser høj opløsning, som tidligere var ikke let at opdage på celleniveau. Genetisk kodede sensorer lette analysen af transport-mekanismer såsom substrat specificitet og pH-afhængighed 10, 11. Desuden, i kombination med de genetiske resILDER såsom bibliotek af RNAi konstruktioner for modelorganismer, er det nu muligt at foretage genom-dækkende søgninger efter nye transport-processer ved hjælp af genetisk kodede sensorer. Faktisk anvendelse af genetisk kodet følerledning til opdagelsen af hidtil karakteriserede transportører i flere tilfælde 12, 13.
For nylig har vores laboratorium udviklet en serie af FRET-baserede sensor for glutamin. Vi har vist, at cellulær glutamin kan visualiseres ved hjælp af sådanne FRET glutamin sensorer 10. Disse sensorer består af et FRET-donor (mTFP1) indsættes i et bakterielt glutamin protein glnH og et FRET-acceptor (Venus) ved C-terminalerne af glnH (figur 1). FRET effektiviteten af disse sensorer reduceres ved binding af glutamin, hvilket resulterer i fald i acceptor / donor intensitet forhold. Fin regulering af glutamin transportprocesser er vigtigt i biologiske processer såsom neurotransmission 14, 15 og vedligeholdelse af urinstof cyklus i leveren 1, 16, 17.
Her viser vi den metode med at analysere transportaktiviteter med FRET sensorer til glutamin, ved hjælp af et bredt felt fluorescens mikroskop set-up. Målet med forsøgene er vist her, er at afsløre transporter aktiviteter i en enkelt celle og undersøge substrat specificitet en forbigående udtrykt transportvirksomheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Prøveforberedelse
Bemærk: I mange tilfælde perfusion eksperimenter vaske væk en betydelig del af celler, som kan blive en frustrerende problem. Selvom det ikke er nødvendigt for alle cellelinjer belægning cover glasflader med poly-L-lysin (tilsæt 1,0 ml/25 cm2 0,01% opløsning på overfladen, inkuberes> 5 minutter, vaskes to gange med cellekultur kvalitet vand og tørres i biosikkerhed kabinet) øger celle adhæsion. Også være opmærksom på biosikkerhed niveau (BSL) af cellen anvendt linje og følge den standardprocedure, der er godkendt af den lokale sundhed og sikkerhed kontor miljøet. I dette eksperiment blev COS7-celler anvendes på grund af lav endogen glutamin transport aktivitet (se figur 4).
- Frø COS7-celler på ~ 70-80% konfluens i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% kosmisk kalveserum og 100 U / ml penicillin / streptomycin, enten på sterile 25 mm dækglas placeret i 6-brønds kulturparabol eller 8-brønds glasbund dias. Inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2, 100% fugtighed i 24 timer.
- Udskift vækstmedium til DMEM +10% kosmisk kalveserum (ingen antibiotika) ifølge fabrikantens protokol. Grow O / N ved 37 ° C, 5% CO2 ved 100% fugtighed.
- Tilføj 0,4 mg af hver af plasmid-DNA, der koder for glutamin sensor (pcDNA3.1, transporterer FLIPQTV3.0 sensor under CMV-promotoren 10) og mCherry-mærket ASCT2 10 til 50 ml serum-frie medier (OPTI-MEM) og blandes forsigtigt.
- Tilsæt 1 ml transfektionsreagens til 50 ml serum-frie medier. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
- Bland de to opløsninger indeholdende DNA (trin 1.3) og transfektionsreagens (trin 1.4) og inkuberes i 20 min.
- Tilføje forsigtigt transfektionsreagens på toppen af cellerne og bland forsigtigt ved vuggende kammeret. Der inkuberes i 24 timer ved 37 ° C, 5% CO2, 100% fugtighed.
- Efter 24 timer, udveksle mediet til DMEM + 10% Cosmic kalveserum(CCS) + 100 enheder af penicillin / streptomycin.
- Cellerne afbildes 48-72 timer efter transfektion.
2.. Perfusion Experiment
Bemærk: COS7-celler, der anvendes i dette eksperiment blev perfusion medier og kammer, der holdes ved stuetemperatur og omgivende CO 2-koncentration. Men hvis de celler, der anvendes kræver højere temperatur og CO 2 koncentration kontrol for overlevelse, opvarmet mikroskopbordet og / eller et klimakammer bør anvendes.
- Forbered perfusionsbuffer AF (se liste over materialer). Vedhæft stophaner til 50 ml sprøjter, lukke stophaner derefter fylde dem med infusionsvæsker. Vandhanen åbnes for en kort periode til at fylde hovedet plads i stophanen med bufferen.
- Tænd for 8-kanals, tyngdekraft-foder perfusionssystem med en perfusion blyant, og derefter vælge "Manual Mode" under Vælg Function mulighed. Placer en affaldsbeholder under perfusion blyant.
- Manueltaktivere portene ved at trykke på de tilsvarende tal og fylde slangerne ved hjælp af 10 ml sprøjte indeholdende vand, og derefter lukke porten. Når portene er fyldt med vand, sætte sprøjter indeholdende buffere AF på porten 1-6 af perfusionssystem, og åbn stophaner dengang. Åbne de porte igen at erstatte vandet i slangen med pufferne. Flowet skal være omkring 0,8 ml / min.
- Tryk annullere en gang på perfusion controller til at gå tilbage til "Select Function"-menuen. Skift til "Edit Program" valgmulighed, og skriv derefter i perfusion protokollen angivet i tabel 1.. Gem perfusion programmet.
- Tag cellerne ud af inkubatoren. Vask to gange med den perfusionsbuffer, og derefter indstille cellerne på scenen. Slut perfusionssystemet til kammeret. Hvis der anvendes et åbent kammer, der er nedsat en anden pumpe, der fjerner perfusionsopløsningen fra kammeret.
- Åbn Slidebook software. Start et nyt dias.
Bemærk:Følgende fremgangsmåde er specifik for Slidebook software, men anden software, såsom MetaFluor og Nis-Element kan også anvendes til den type billeddannelse beskrevet her. Teoretisk eksperimenter kan udføres ved hjælp af en software, der giver tidsforløb billeddannelse, og billedsekvenser kan analyseres efter eksperimentelt ved hjælp af software som f.eks ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) eller Fiji (http:/ / fiji.sc / Fiji). Men software, der giver real-time overvågning af acceptor / donor-forholdet er meget nyttig. - Monter slide på fluorescensmikroskop fase. Find de celler, co-udtrykker sensoren og ASCT-mCherry hjælp af passende filtersæt (se liste over materialer) under "FOCUS"-funktion. Juster forstærkning ved at klikke på fanebladet "Camera" og skubbe skyderen under "gevinst". Også justere neutralfiltre indstilling fra neutralfiltre drop-down menu. Bemærk: Hvis filteret terning ikke omfatter et øje-filter, skal du ikke bruge øjet stykker siden Short-bølgelængdeexcitering lys er skadeligt for øjnene. Brug computerskærmen for at finde de celler, i stedet.
- Anskaf billeder af celler with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (Filtre er angivet i listen over stoffer). Klik på "Image Capture" og derefter i vinduet erhvervelse, specificere de filtre, der skal bruges. Klik på "TEST"-knappen for at justere eksponeringen tid ved at skrive den ønskede eksponeringstid i boksen ved siden af filter-indstillingerne. Bemærk: Alle tre kanaler har brug for at blive udsat for den samme længde. Når du justerer de billeddannende parametre, tage den forventede FRET effektivitet forandring og fold stige i betragtning: for eksempel, hvis der forventes effektiviteten FRET at gå op 2 gange i løbet af eksperimentet, billedbehandling parametre skal justeressåledes at intensiteten af Donor ex Acceptor em på hvilende staten bør være <50% af den maksimale værdi, der kan optages af instrumentet, således at kanalen ikke bliver mættet under eksperimentet. Signal fra de mærkede celler bør være mindst tre gange højere end i baggrunden regionen.
- Tegn et område af interesse ved hjælp af regioner værktøj i softwaren. Alternativt kan en software-funktion til at vælge pixels ovenstående vis intensitet skal bruges, og derefter omdannet til regioner. For at gøre dette, skal du klikke på Mask - Segment, derefter flytte skyderen til at fremhæve de ønskede områder.
- Vælg "time lapse" i capture typen feltet, angive det interval (10 sek i dette eksperiment), og tidspunkter for eksperimentet.
- Tegn en region i et område uden fluorescerende celler. Dette område bruges til baggrund subtraktion. Højreklik regionen trukket, og indstille den som en baggrund dengang. Bemærk: Ideelt, celler, der ikket udtrykker sensorerne skal anvendes som baggrund regionen til at tage højde for både den autofluorescens og baggrunden fluorescens detekteres af kameraet. Hvis sådanne celler findes i synsfeltet, bør anvendes mindst en region uden celler til at redegøre for baggrundsfluorescens.
- Vælg det ønskede program under "Select Function - Kør programmer" valgmulighed. Skift til den gemte program (se trin 2.3), og derefter ramte ENTER på perfusion controller. Nu er programmet er indlæst, og ramme nogen, starter perfusion.
- Sørg for perfusion og billedbehandling eksperiment starte på samme tid ved at klikke på "Start" knappen i capture vinduet på samme tid som at trykke på en tast på perfusion controller.
Bemærk: Det anbefales at registrere tidspunkterne hvor løsningerne blev udvekslet (dette kan gøres ved hjælp af "NOTER" funktionen, der findes under fanen erhvervelse). - Udfør den samme perfusion protokol USIng celler, der udtrykker en sensor, der forventes at være enten mættet eller ubundet under eksperimentel betingelse.
Bemærk: Her FLIPQTV3.0_1.5μ, som er mættet i den eksperimentelle betingelse, anvendes som en kontrol Figur 6 Sådanne kontrolforsøg er nødvendige for at bekræfte, at FRET-effektiviteten ændring skyldes den faktiske ændring i substratet og ikke. på grund af ændringen i andre parametre, såsom cellulær pH.
3.. Post-eksperiment Analyse
- Undersøg om der er opstået prøve afdrift under eksperimentet. Tegn områder af interesse (ROI) s på billedet taget ved tidspunkterne 0, derefter flytte den glidende øverst på billedenheden vinduet og kontrollere, om cellerne falde ud af ROIs i billeder taget senere i eksperimentet.
- Hvis ja, så bruge tracking funktion til at korrigere for afdrift ved først at skabe masker omkring cellerne ved at vælge Mask - Segment, og skub derefter den linje, der angiver den cutoff til HIGhlight regionerne indeholdende celler. Spor regionerne ved at klikke på Mask - Particle Tracking - Grundlæggende partikel tracking.
- Re-tegne ROIs og baggrund region, når det er nødvendigt.
- Eksportere den gennemsnitlige intensitet ROI'er i løbet af eksperimentet. Klik på Statistik - Eksport - Ratio / timelapse data.
- Når FRET effektivitet og kvantificering af substratkoncentrationen ikke er nødvendig, plotte tidsforløbet af intensiteten ratio (Donor ex Acceptor em, / Donor ex Donor em) som en proxy for dynamikken i underlaget. For at bestemme den cytosoliske koncentration, beregne den maksimale og minimale forhold ændring (dvs. ved mættende og fravær af substratet, henholdsvis), Δr max - Δr min, ved ikke-lineær regression af Δratio (Δr) med følgende ligning:
Δr = [S] / (K d + [S]) x (Δr
hvor [S] er substratkoncentrationen i cytosolen. Brug af Δr max - Δr min værdier opnået, mætning (S) af sensoren på et givet Δr beregnes som
S = (Δr - Δr min) / (Δr max - Δr min)
S kan yderligere omdannes til koncentrationen substrat [S] ved hjælp af følgende ligning:
S = [S] / (K d + [S])
Bemærk: intensiteten af Acceptor ex Acceptor em kanal skal også være planlagt at undersøge, om den eksperimentelle betingelse påvirket fluorescens acceptoren direkte. - Når en basislinjedrift grundet fotoblegende overholdes, udføre en baseline korrektion. For at gøre dette, plotte intensiteten af donor og acceptor over tid (figur 5A). Derefter identificeres tidspunkter bruges til the baseline, ifølge forsinkelsen i perfusionssystemet og transport aktiviteten af den særlige celle (figur 5B).
- Beregn en polynomiets fitting, der bedst beskriver grundlinjen. Derefter normalisere rå intensitet fra hvert tidspunkt til baseline (figur 5C). Beregn intensiteten ratio (Donor ex Acceptor em, / Donor ex Donor em) fra de normaliserede donor-og acceptor intensiteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typiske tid-kursus eksperimenter er repræsenteret i figur 2.. I disse eksperimenter, ærgre glutamin sensorer med tilhørsforhold på 8 mm (FLIPQTV3.0_8m, figur 2A og 2B) og 100 m (FlipQTV3.0_100 μ C og D) blev co-udtrykt med en obligatorisk aminosyre varmeveksler ASCT2 18 i COS7-celler 10. Tilgangen af glutamin detekteres som ændringen i fluorescensintensitetsforhold mellem donor (mTFP1) og acceptor (Venus) (figur 2A og 2C). Udstrømning af glutamin i nærvær af et andet substrat (Ala) er også tydeligt vist i disse eksperimenter. Med begge sensorer ændre normaliserede fluorescerende intensiteter gensidigt (dvs. donor intensitet går op som acceptor intensitet går ned, 2B og 2D) i nærværelse af substrat, hvilket tyder på, at forholdet mellem observerede forandringer er faktisk skyldes to ændringen i FRET effektivitet. Disse forsøg viser, at koncentrationerne glutamin i disse celler svinger meget dynamisk under den eksperimentelle betingelse; fra detekteringsområde på 100 uM sensor til nær-mætning koncentration for 8 mM sensor.
Substratspecificiteter i transportvirksomheder kan også undersøges ved hjælp sensorer, demonstreret i figur 3.. I disse forsøg blev cellerne præinstalleret med glutamin, og derefter forskellige aminosyrer blev føjet til den ekstracellulære perfusat at undersøge, om disse aminosyrer kan fremkalde glutamin efflux. Som forventet, ASCT2 substrater (Ala, Ser, Cys, Thr, D-serin) inducerede glutamin efflux (Fig. 3A), mens ikke-substrat aminosyrer (Pro, His, Lys) ikke gjorde (Fig. 3B), bekræfter med tidligere undersøgelser 18. Normalt er substrat specificitet måles ved kompetitive assays ved anvendelse af en radio-isotop-mærket substrat blandet med konkurrerende substrat, Som er temmelig besværlig og kræver en population af celler, der er jævnt udtrykker transportøren skal undersøges. Optisk billeddannelse her eksemplificeret tilbyder en alternativ fremgangsmåde.
Når der ikke observeret nogen FRET effektivitet ændringer ved tilsætning af substratet, kan flere årsager overvejes. En mulig årsag er den lave optagelse kapacitet til det substrat, som afprøves og / eller høje aktiviteter af enzymer, der opretholder koncentrationen i cellerne. For eksempel glutaminkoncentration ændring var minimal i COS7-celler, som ikke udtrykker ASCT2 transportør under testet tilstand, selv om denne cellelinje kan tydeligt vokse i de medier, hvori glutamin primære nitrogenkilde (figur 4). Desuden, hvis affiniteten af sensoren enten er for høj eller for lav i forhold til den intracellulære koncentration, de fleste af sensor proteiner være konstitutivt bundet eller ubundet henholdsvis; derfor ingen effektivitsændring FRET vil være detected.
Figur 1.. Konfiguration af en FRET glutamin sensor. (A) Åben (cyan) og lukkede (gul) kropsbygning af glnH, glutamin protein fra E. coli. Den position, hvor mTFP1 er indsat er markeret i magenta. (B) Skematisk repræsentationer af FLIPQTV_3.0 sensorer.
Figur 2.. In vivo glutamin målinger ved hjælp FLIPQ-TV3.0_8m og 100μ sensorer. (A) venus/mTFP1 forholdet COS7-celler co-udtrykkende FLIPQ-TV3.0_8m sensor og ASCT2-mCherry. mCherry mærke blev anvendt til at identificere de celler, der udtrykker transportis uden at forstyrre de mTFP1 eller venus emissions-kanaler. Cellerne blev perfunderet med HEPES-pufret Hanks puffer (pH 7,35). Tidspunkter når ekstracellulære glutamin (rød) og alanin (blå) blev tilsat til perfusion medier er angivet som kasser over grafen. Solid og stiplede linjer repræsenterer to individuelle celler målt i samme eksperiment. (B) De intensiteter af donor (mTFP1) og acceptor (Venus) kanaler i forsøget vist i (A). Værdierne blev korrigeret for fotoblegning og normaliseret til basislinjen. (C) og (D) Et tilsvarende forsøg som i (A) og (B) udføres med COS7-celler, der udtrykker FLIPQ-TV3.0_100μ sensor. (Figur modificeret fra 10).
Figur 3.. Eliminering af cellulær glutamin through den ASCT2 transportør i overværelse af eksterne aminosyrer, visualiseret ved hjælp FLIPQ-TV3.0_8m sensor. (A) cytosoliske glutamin udføres ved tilsætning af ekstracellulær Ala, Ser, Cys, Thr og D-Ser. Tidspunkter hvor ekstracellulær glutamin (røde kasser), eller andre aminosyrer (blå kasser) blev føjet til perfusion medier er angivet som kasser over grafen. (B) Tilsætning af Pro, Lys, Hans (sorte bokse) ændrer ikke cytosol glutaminkoncentration , mens tilføjelsen af Ala (blå bokse) fremmer eksport af glutamin. Faste og stiplede linjer repræsenterer to individuelle celler målt i det samme eksperiment. Alle aminosyrer blev tilsat ved 5 mM eksterne koncentrationer. (Figur blev oprindeligt udgivet i 10).
Figur 4.. Den venus/mTFP1 forholdet COS7-celler expressing FLIPQ-TV3.0_8m sensor (A) og 100μ sensor (B). Cellerne blev perfunderet med HEPES-pufret Hanks puffer. Tidspunkter når ekstracellulære glutamin (5 mM) blev tilsat til perfusion medier er angivet som røde kasser over grafen. Faste og stiplede linjer repræsenterer to individuelle celler målt i det samme eksperiment.
Figur 5.. Korrigering for fotoblegning. (A) Rå intensiteter fra to celler, der er repræsenteret i figur 2A og 2C. (B) datapoints, der blev valgt til beregning af basislinjerne. Polynomiets montering kurver er vist i figuren. (C) intensiteter af kanaler er vist i A, normaliseret mod baseline beregnet B. datasæt, der anvendes i dette tal er identical til den vist i figur 2A og 2C.
Fig. 6. In vivo glutamin målinger ved hjælp FLIPQ-TV3.0_1.5m sensor. (A) venus/mTFP1 forholdet COS7-celler co-udtrykkende FLIPQ-TV3.0_1.5m sensor og ASCT2-mCherry. mCherry mærke blev anvendt til at identificere de celler, der udtrykker transportøren uden at forstyrre de mTFP1 eller venus emission kanaler. Cellerne blev perfunderet med HEPES-pufret Hanks puffer (pH 7,35). Tidspunkter når ekstracellulære glutamin (rød) og alanin (blå) blev tilsat til perfusion medier er angivet som kasser over grafen. Solid og stiplede linjer repræsenterer to individuelle celler målt i samme eksperiment. (B) De intensiteter af donor (mTFP1) og acceptor (Venus) kanaleri forsøget er vist i (A). Værdierne blev korrigeret for fotoblegning og normaliseret til baseline.
| Time (min) | Opløsning A | Opløsning B | Opløsning C | Opløsning D | Solution E | Solution F | |||||||
| 0 | ventil på | ||||||||||||
| 2 | ventil off | ventil på | |||||||||||
| 4. | ventil på | ventil off | |||||||||||
| 6 | ventil off | ventil på | |||||||||||
| 8. | ventil på | ventil off | 10 | ventil off | ventil på | ||||||||
| 12 | ventil på | ventil off | |||||||||||
| 14 | ventil off | ventil på | |||||||||||
| 16 | ventil på | ventil off | |||||||||||
| 18 | ventil off | ventil på | |||||||||||
| 20 | ventil på | ventil off | |||||||||||
| 22 | ventil off | ventil på | |||||||||||
| 24 | ventil på | ventil off | 26 | ventil off | ventil på | ||||||||
| 28 | ventil på | ventil off | |||||||||||
| 30 | ventil off | ventil på | |||||||||||
| 32 | ventil på | ventil off | |||||||||||
| 34 | ventil off |
. Tabel 1 Eksempel på perfusion protokol, der anvendes i dette eksperiment Opløsning A:. 9,7 g Hank salt (H1387), 0,35 g NaHCO3, 5,96 g HEPES og 1 L pH-justeret til 7,35 med NaOH Opløsning B:. Opløsning A + 0,04 mM Gin Løsning C:.. Solution A + 0,2 mM Gin solution D:. Solution A + 1 mM Gin Løsning E:. Solution A + 5 mM Gin Solution F: Løsning A + 5 mM Ala
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Succesen af imaging eksperimenter afhænger nogle kritiske faktorer. En af disse faktorer er affiniteten af sensorer anvendes, som beskrevet ovenfor. Absolutte koncentration af substratet i subcellulært afsnit af interesse, er imidlertid ofte ukendt. Derfor anbefaler vi at prøve flere sensorer med forskudte tilhørsforhold til at finde en, der virker bedst under den ønskede eksperimentel betingelse. For eksempel i vores tilfælde, vi transficeret COS 7 celler med glutamin sensorer med 1.5μ, 100μ, 2m og 8m (figur 3 og data ikke vist).
En anden vigtig faktor er ekspressionsniveauet af sensor proteiner. Niveauet af udtryk der kræves til påvisning varierer mellem eksperimenter, for eksempel, når en kortvarig hændelse (fx enkelt handling potentiale) bør observeres et højere udtryk niveau kunne blive nødvendig 19. Derfor, i de fleste tilfælde krævede niveau skal være empirically bestemmes. Hvis målet findes i meget lav koncentration i cellen, kan forstyrrelse af de endogene processer grund til at målrette udtømning blive et problem 20. En uafhængig analyse for at vurdere en sådan mulighed, hvis de er tilgængelige, er derfor ønskeligt. I forsøgene er vist i denne artikel, blev protein udtryk drevet af CMV-promotoren fundet at være tilstrækkelig. I situationer, hvor initiativtagere med meget svagere aktiviteter skal bruges, kan justeringer øge signalintensiteter blive nødvendig. For eksempel kompromis mellem signalintensitet og foto-blegning under eksponeringen skal nås. Ud over længere eksponeringstid, kan faktorer såsom lysstyrke fluoroforer, maksimal intensitet ændring af føleren, arkivering, og følsomheden af CCD-kameraet ændres til at styrke signalintensiteten.
Når der observeres ingen ændring i forhold under den eksperimentelle tilstand, selv om de to ovennævnte kriterier sandsynligvisskal opfyldes, er det muligt, at den cellulære homeostase for den givne metabolit eller ion er stærk nok til at maskere transport aktivitet (se resultatet afsnit). I sådanne tilfælde kan cellelinier med forskellige biokemiske aktiviteter kræves som en baggrund til at registrere de transporter aktiviteter 10, 21.
Mens disse sensorer tillader en at overvåge koncentration dynamik underlaget ved meget højere Spatiotemporal opløsning end udvinding-baserede metoder, bestemmelse af absolutte koncentration kræver yderligere eksperimentelle trin og overvejelser. Normalt er substratkoncentration beregnet på den antagelse, at sensorens affinitet beregnes sædvanligvis ved titrering af oprenset protein sensor, er uændret, når det udtrykkes i cellen. Koncentrationen er beregnet ved hjælp af følgende single bindende isoterm,
[S] = K d x (r - r min) / (r </ Em> max - r)
[S] er substratkoncentrationen, Kd er dissociationskonstanten bestemmes in vitro, r er acceptor / donor-forhold observeret ved en given tidspunkterne, r min er acceptoren / donor-forhold, når sensorerne er i apo form og r max er acceptor / donor-forhold, når alle sensorer er bundet til substratet. R min og r max er påvirket af parametre, såsom koncentration af sensorer, billedbehandling indstillinger, der anvendes, og sammensætningen af den cellulære milleu og dermed skal måles in situ . at bestemme r min og R max værdier, eksperimentelle betingelser, der tillader ændring af intracellulær substratkoncentration bliver nødvendigt. For eksempel selektive ionoforer (f.eks ionomycin for Ca 2 +) 22 eller en perforering reagens, såsom digitonin 23 kan anvendes til at ækvilibrere intracellulær substratkoncentration med den eksterne koncentration.
En af begrænsningerne i den type eksperimenter demonstreret i denne protokol er den lille produktion; analysen er begrænset til at analysere en metabolit i en forholdsvis lille (<10) antallet af celler. Teknologiske fremskridt der gøres, men at overvinde sådanne begrænsninger. For eksempel, med forskuddet i automatiserede, high-content screening, er det nu muligt at bruge genetisk kodede sensorer i kombinationer med lille molekyle eller RNAi bibliotek; celler, der udtrykker en biosensor kan dyrkes i en high-throughput format (fx 96 - eller 384-brønd), derefter individuelle brønde kan behandles med enten siRNA eller kemikalier og afbildes. Sådanne eksperimenter tillader identifikation af siRNA konstruktioner eller kemikalier, som forstyrrer den biologiske proces, som kan iagttages ved biosensoren 24 25. En anden spændende nylige fremskridt inkludes til udvikling af et tidsopløst microfluidic flowcytometer, som giver high-throughput påvisning af FRET effektivitsændring på celleniveau 26. Sådanne tekniske fremskridt vil hjælpe opdagelser af nye lægemiddelkandidater og nye komponenter i biologiske processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud 1R21NS064412, NSF tilskud 1.052.048 og Jeffress Memorial Trust tilskud J-908.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted fluorescent microscope | Olympus | IX81F-3-5 | An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also be appropriate. |
| Excitation filter (mTFP1) | Omega Optical | 3RD450-460 | Band width 450-460 nm |
| Excitation filter (Venus) | Chroma | ET500/20 | Band width 490-510 nm |
| Emission filter (mTFP1) | Chroma | HQ495/30m | Band width 475-505 nm |
| Emission filter (Venus) | Chroma | ET535/30m | Band width 520-550 nm |
| Dichroic mirror (FRET channels) | Chroma | 470dcxr | Long pass, 470 nm cut off |
| Dichroic mirror (YFP channel) | Chroma | 89002bs | Passes 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm |
| mCherry filter set | Chroma | 49008 | Excitation 540-580 nm, long pass dichroic with 585 nm cut off, emission filter 595-695 nm |
| Light source | Olympus | U-LH100L-3-5 | LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended |
| CCD camera | Qimaging | Rolera-MGi EMCCD | |
| Apochromatic fluorescence objective | Olympus | ||
| Perfusion system, ValveBank II | AutoMate Scientific | [01-08] | Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work |
| Laminar-flow chambers | C&L Instruments | VC-MPC-TW | Other larminar-flow chambers would also work. |
| Chambered slide | Lab-Tek | 154534 | For open-chamber experiments |
| Perfusion pump | Thermo Scientific | 74-046-12131 | For open-chamber experiments |
| Software supporting ratiometric measurements | Intellegenent Imaging Innovation | Slidebook 5.5 | |
| Laminar flow biosafety cabinet | ESCO | LA-3A2 | |
| Isotemp CO2 Incubator | Thermo Scientific | 13-255-25 | |
| Dulbecco's MEM (DMEM) | Hyclone | SH30243.01 | |
| Cosmic calf serum | Hyclone | SH3008703 | |
| Penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I) | Invitrogen | 31985 | Used with Lipofectamine 2000 |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma | P4707 | |
| 25 mm circular glass cover slips | Thermo Scientific | 12-545-102 | In case VC-MPC-TW is used |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | Other transfection reagents can also be used. |
| Solution A (Hank's buffer) | 9.7 g HANK salt (Sigma H1387), 0.35 g NaHCO3, 5.96 g HEPES to 1 L, pH adjusted to 7.35 with NaOH | ||
| Solution B | Solution A + 0.04 mM Gln | ||
| Solution C | Solution A + 0.2 mM Gln | ||
| Solution D | Solution A + 1 mM Gln | ||
| Solution E | Solution A + 5 mM Gln | ||
| Solution F | Solution A + 5 mM Ala |
References
- Haussinger, D. Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle. Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).
- Haussinger, D. Hepatic glutamine metabolism. Beitr Infusionther Klin Ernahr. 17, 144-157 (1987).
- Watford, M., Chellaraj, V., Ismat, A., Brown, P., Raman, P. Hepatic glutamine metabolism. Nutrition. 18, 301-303 (2002).
- Mustroph, A., et al. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 18843-18848 (2009).
- Sasagawa, Y., et al. Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity. Genome Biol. 14, R31 (2013).
- Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. The life cycle of Ca(2+) ions in dendritic spines. Neuron. 33, 439-452 (2002).
- Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative imaging with fluorescent biosensors. Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).
- Newman, R. H., Fosbrink, M. D., Zhang, J. Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells. Chemical reviews. , 111-3666 (2011).
- Okumoto, S. Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors. Curr Opin Biotech. 21, 45-54 (2010).
- Gruenwald, K., et al. Visualization of glutamine transporter activities in living cells using genetically encoded glutamine sensors. PLoS One. 7, e38591 (2012).
- Chaudhuri, B., et al. Protonophore- and pH-insensitive glucose and sucrose accumulation detected by FRET nanosensors in Arabidopsis root tips. Plant Journal. 56, 948-962 (2008).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
- Jiang, D. W., Zhao, L. L., Clapham, D. E. Genome-Wide RNAi Screen Identifies Letm1 as a Mitochondrial Ca2+/H+ Antiporter. Science. , 326-147 (2009).
- Barnett, N. L., Pow, D. V., Robinson, S. R. Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light. Glia. 30, 64-73 (2000).
- Rothstein, J. D., Tabakoff, B. Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition. J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).
- Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. X. Differential regulation of amino acid transporter SNAT3 by insulin in hepatocytes. J Biol Chem. 280, 26055-26062 (2005).
- Palmada, M., Speil, A., Jeyaraj, S., Bohmer, C., Lang, F. The serine/threonine kinases SGK1, 3 and PKB stimulate the amino acid transporter ASCT2. Biochem Bioph Res Co. 331, 272-277 (2005).
- Bröer, A., et al. The astroglial ASCT2 amino acid transporter as a mediator of glutamine efflux. J Neurochem. 73, 2184-2194 (1999).
- Wallace, D. J., et al. Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor. Nature. 5, 797-804 (2008).
- Haugh, J. M. Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring. Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).
- San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PLoS One. 8, e57712 (2013).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
- Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).
- Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening. PLoS One. 6, e20114 (2011).
- Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter. Science. 326, 144-147 (2009).
- Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells. J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).
