Summary
Denne artikkelen vil vise hvordan å overvåke glutamin dynamikk i levende celler ved hjelp av FRET. Genetisk kodet sensorer tillater sanntids overvåking av biologiske molekyler på en subcellulære oppløsning. Eksperimentell design, tekniske detaljer om de eksperimentelle innstillingene, og hensynet til post-eksperimentelle analyser vil bli diskutert for genetisk kodet glutamin sensorer.
Abstract
Genetisk kodet sensorer tillater sanntids overvåking av biologiske molekyler på en subcellulære oppløsning. En enorm variasjon av slike sensorer for biologiske molekyler ble tilgjengelig i de siste 15 årene, og noen av dem ble uunnværlig verktøy som brukes rutinemessig i mange laboratorier.
En av de spennende anvendelser av genetisk kodede sensorer er bruken av disse sensorene i å undersøke cellulære transportprosesser. Egenskaper av transportører som kinetikk og substratspesifisiteter kan bli etterforsket på cellenivå, og gir muligheter for celle-type spesifikke analyser av transportvirksomhet. I denne artikkelen vil vi vise hvordan transporter dynamikk kan observeres ved bruk av genetisk kodet glutamin sensor som et eksempel. Eksperimentell design, tekniske detaljer om de eksperimentelle innstillingene, og hensynet til post-eksperimentelle analyser vil bli diskutert.
Introduction
Grunnet bemerkelsesverdig fremgang i teknologi som gjør det mulig undersøkelse av transcriptome og proteomet på cellenivå, har det nå blitt klart at biokjemi og den resulterende flux av metabolitter og ioner er svært celle-type spesifikke. For eksempel, i pattedyrlever, er sekvensiell glutamin nedbrytning og syntese utføres samtidig ved periportal celler og perivenous celler henholdsvis å mate ammonium til ureasyklusen i den tidligere celletype mens forbruker overskytende ammoniakk i det siste 1-3. I noen tilfeller er betydelig biokjemisk heterogenitet detekteres selv i en enkelt "cell type" 4, 5. I tillegg til et slikt romlig spesifisitet, det cellulære nivå av metabolitter og ioner er svært dynamisk (for eksempel signalmolekyler slik som Ca2 + og sykliske nukleotider). De Spatiotemporal mønstre av metabolitter og ioner ofte spiller avgjørende roller i signaltransduksjon. Monitoring cellulære dynamikk metabolitter og ioner imidlertid utgjøre unik utfordring. I mange tilfeller er forandringen i konsentrasjonene hurtig og forbigående, eksemplifisert ved tilfellet med signalmolekyler slik som Ca2 +, som desintegrerer i løpet av ~ 20 msek i dendrittutløperne 6. I tillegg compartmentalization av biokjemiske mekanismer i og mellom cellene som gjør det vanskelig å kvantifisere dynamikken metabolitter og ioner ved hjelp av kolonnekromato-grafi / massespektrometriteknikker ekstraksjon og.
Genetisk kodet sensorer for biologiske molekyler er nå mye brukt på grunn av høy tid og rom oppløsning som gjør at eksperimentator å studere kortlivede og / eller compartmentalized molekyldynamikk (anmeldt i 7, 8). Disse genetisk kodede sensorer kan grovt sett deles inn i to kategorier; intensitet-baserte sensorer og ratiometic sensorer. Intensitet-baserte sensorer typisk bestå av en bindende domene og et fluorescent protein (FPS), og det oppløste stoffet binding til bindingsdomene endrer den fluorescerende intensitet. Ratiometic sensorer, på den annen side, ofte dra nytte av Foster Resonance Energy Transfer (FRET) mellom to fps som fungerer som et FRET-par. Disse sensorene består av en bindende domene og to bps og det oppløste stoffet binding induserer forandring i FRET effektivitet mellom de to bilder i sekundet. Det er utviklet et stort antall sensorer for biologisk viktige metabolitter og ioner i det siste tiåret 8, 9.
En av de praktisk mulighet som tilbys av slike genetisk kodede sensorer er deres anvendelse i den høyoppløselige analyse av membrantransportprosesser, som tidligere var ikke lett å oppdage på cellenivå. Genetisk kodede sensorer lette analysen av transportmekanismer som substrat spesifisitet og pH-avhengighet 10, 11. Videre, i kombinasjon med de genetiske resources eksempel bibliotek av RNAi konstruerer for modellorganismer, er det nå mulig å gjennomføre genome-wide søker etter nye transportprosesser ved hjelp av genetisk kodet sensorer. Faktisk bruk av genetisk kodet sensor føre til oppdagelsen av tidligere uncharacterized transportører i flere tilfeller 12, 13.
Nylig har vårt laboratorium utviklet en serie av FRET-baserte sensor for glutamin. Vi har vist at cellulær glutaminnivået kan visualiseres ved bruk av slike FRET glutamin sensorer 10. Disse sensorene består av et FRET donor (mTFP1) settes inn i en bakteriell glutamin-bindende protein glnH, og et FRET akseptor (venus) ved C-termini av glnH (figur 1). FRET effektiviteten av disse sensorer reduseres ved binding av glutamin, noe som resulterer i reduksjon av akseptor / donor intensitetsforhold. Fin regulering av glutamin transportprosesser er viktig i biologiske prosesser som neurotransmission 14, 15 og opprettholdelse av urea-syklusen i leveren 1, 16, 17.
Her viser vi metodikken for å analysere transportvirksomhet med FRET sensorer for glutamin, ved hjelp av et bredt felt fluorescens mikroskop set-up. Målet med eksperimenter som vises her er å oppdage transporter aktiviteter i en enkelt celle, og å undersøke substrat spesifisitet av en forbigående uttrykt transporter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Prøvepreparering
Merk: I mange tilfeller perfusjon eksperimenter vaske bort en vesentlig del av cellene, som kan bli en frustrerende problem. Selv om det ikke er nødvendig for alle cellelinjer, belegg dekke glassoverflater med poly-L-lysin (tilsett 1,0 ml/25 cm 2 for 0,01%-ig oppløsning til overflaten, inkuber> 5 min, vaskes to ganger med cellekulturkvalitet vann og tørk i biosikkerhet kabinett) forbedrer celle adhesjon. Vær også klar over biosikkerhet nivå (BSL) av cellelinjen som brukes, og følg standard prosedyre godkjent av lokale miljø helse og sikkerhet kontor. I dette eksperimentet, ble cos7 celler brukt på grunn av lav endogen glutamin transportaktivitet (se figur 4).
- Seed cos7 cellene ved ~ 70-80% konfluens i Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% kosmisk kalveserum og 100 enheter / ml penicillin / streptomycin, enten på sterile 25 mm glass-dekkglass som er plassert i 6-brønners kulturparabol eller åtte-brønns glassbunn lysbilder. Inkuber ved 37 ° C, 5% CO2, 100% fuktighet i 24 timer.
- Bytt til vekstmediet til DMEM 10% kosmisk kalveserum (uten antibiotika), i henhold til produsentens protokoll. Dyrk O / N ved 37 ° C, 5% CO2 ved 100% fuktighet.
- Legg 0,4 mg hver av plasmid DNA koder for glutamin sensor (pcDNA3.1, bærer FLIPQTV3.0 sensor etter CMV promoter 10) og mCherry-merket ASCT2 10 til 50 ml serum-frie medier (OPTI-MEM) og bland forsiktig.
- Tilsett 1 ml av transfeksjon reagens til 50 ml serumfritt medium. Inkuber ved RT i 5 min.
- Bland de to oppløsninger som inneholder DNA (trinn 1.3) og transfeksjon reagens (trinn 1.4) og inkuberes i 20 min.
- Forsiktig tilsett transfeksjon reagens på toppen av cellene, og bland forsiktig ved å gynge i kammeret. Inkuber i 24 timer ved 37 ° C, 5% CO2, 100% fuktighet.
- Etter 24 timer, utveksle mediet til DMEM + 10% Cosmic Calf Serum(CCS) + 100 enhet av penicillin / streptomycin.
- Celler er avbildes 48-72 timers post-transfeksjon.
2. Perfusjonsindikator Experiment
Merk: For cos7 celler brukes i dette forsøket, ble perfusjon media og kammer holdt på RT og ambient CO 2-konsentrasjon. Dersom cellene blir brukt krever høyere temperatur og CO2-konsentrasjonen som kontroll for å overleve, oppvarmet objektbord og / eller i et miljøkammer bør brukes.
- Forbered perfusjon buffer AF (Se Liste over Materials). Fest stoppekraner til 50 ml sprøyter, lukke stoppekraner deretter fylle dem med infusjonsløninger. Åpne vannkranen for en kort periode for å fylle hodet plass i vannkranen med buffer.
- Slå på 8-kanals, gravity-fôr perfusjon system med en perfusjon blyant, og deretter velge "manuell modus" under Select Function alternativet. Plasser en avfallsbeholder under perfusjon blyant.
- Manueltaktivere portene ved å trykke på de tilsvarende tall og fylle slangene bruker 10 ml sprøyte som inneholder vann, og deretter lukke porten. Når portene er fylt med vann, sette sprøytene inneholder buffere AF på port 1-6 av perfusjon system, og åpne vannkranene da. Åpne portene på nytt for å erstatte vannet i røret med buffere. Strømningshastigheten bør være rundt 0,8 ml / min.
- Trykk avbryt en gang på perfusjon kontrolleren for å gå tilbake til "Select Function"-menyen. Bytte til "Rediger Program" alternativet, deretter inn i perfusjon protokollen angitt i tabell 1. Lagre perfusjon programmet.
- Ta cellene ut av inkubatoren. Vask to ganger med perfusjon buffer, og deretter sette cellene på scenen. Koble perfusjon systemet til kammeret. Dersom et åpent kammer benyttes, sette opp en annen pumpe som fjerner perfusjon løsning fra kammeret.
- Åpne Slidebook programvare. Start et nytt lysbilde.
Merk:Følgende fremgangsmåte er spesifikk for Slidebook programvare, men andre programmer som MetaFluor og Nis-element kan også brukes for den type avbildnings beskrevet her. Teoretisk eksperimenter kan utføres ved hjelp av programvare som gir tid-retters bildebehandling, og bildesekvenser kan analyseres post-eksperimentelt ved hjelp av programvare som ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) eller Fiji (http:/ / fiji.sc / Fiji). Men, er svært nyttig programvare som tillater sanntids overvåking av akseptor / donor forholdet. - Monter raset på fluorescerende mikroskop scenen. Finn cellene co-uttrykke sensoren og ASCT-mCherry ved hjelp av egnede filtersett (se liste over materialer) under "FOCUS"-funksjonen. Juster gevinst ved å klikke på "Camera"-fanen og skyve glidebryteren under "gain". Også justere nøytral tetthet filter innstillingen fra nøytral tetthet filter rullegardinmenyen. Merk: Hvis filteret kuben ikke inkluderer et øye filter, ikke bruk øyet stykker siden Short-bølgelengde eksitasjon lys er skadelig for øynene. Bruk dataskjermen for å finne cellene i stedet.
- Acquire bilder av celler with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (Filtre er angitt i Liste over Materials). Klikk på "Image Capture", og deretter i oppkjøpet vinduet angir filtrene som skal brukes. Klikk på "TEST"-knappen for å justere eksponeringstiden ved å skrive inn ønsket eksponeringstid i boksen ved siden av filterinnstillingene. Bemerk: Alle tre kanaler trenger å bli utsatt for den samme lengde. Ved justering av avbildningsparametre, ta den forventede FRET effektivitet endring og fold økning i betraktning, for eksempel hvis FRET effektivitet antas å gå opp 2 ganger i løpet av forsøket, avbildningsparametre bør justeresslik at intensiteten av Donor ex akseptor em ved hviletilstand skal være <50% av den maksimale verdi som kan registreres av instrumentet, slik at kanalen ikke blir mettet under forsøket. Signal fra den merkede celler bør være minst tre ganger høyere enn det som i bakgrunnen regionen.
- Tegn en region av interesse ved hjelp av regioner verktøy i programvaren. Alternativt kan en programvarefunksjon for å velge piksler ovenfor viss intensitet benyttes, og deretter omdannet til regioner. For å gjøre dette, klikker Mask - Segment, deretter flytte glidemarkøren for å markere de ønskede områdene.
- Velg "time lapse" i opptakstype, og angi intervallet (10 sek i dette eksperimentet) og tidspunkter for eksperimentet.
- Tegn en region i et område uten noe fluorescerende celler. Dette området blir brukt for bakgrunns subtraksjon. Høyreklikk regionen trukket, og deretter sette det som bakgrunn. Merk: Ideelt celler som ikket uttrykker sensorene bør brukes som bakgrunn regionen for å ta hensyn til både den autofluorescens og bakgrunnen florescence registreres av kameraet. Hvis ingen slike celler er tilgjengelige i synsfeltet, minst en region uten at cellene skal brukes for å ta hensyn til bakgrunnsfluorescens.
- Velg ønsket program under "Velg funksjon - Kjør programmer"-alternativet. Veksle til den lagrede programmet (se trinn 2.3), og deretter trykker ENTER på perfusjon kontrolleren. Nå programmet er lastet, og trykket på en vilkårlig tast vil starte perfusjon.
- Sørg for perfusjon og bildebehandling eksperiment starter samtidig ved å klikke på "Start"-knappen i fangstvinduet samtidig som du trykker på en tast på perfusjon kontrolleren.
Merk: Det anbefales å registrere endepunktet der løsningene ble utvekslet (dette kan gjøres ved hjelp av "Notes" funksjon, som finnes innenfor kategorien kjøpet). - Utfør den samme perfusjon protokollen USIng celler som uttrykker en sensor som er forventet til å være enten mettet eller ubundet under det eksperimentelle forhold.
Merk: Her FLIPQTV3.0_1.5μ, som er mettet under det eksperimentelle tilstand, blir brukt som en kontroll, Fig. 6 Slike kontrolleksperimenter som er nødvendige for å få bekreftet at FRET effektivitet endringen skyldes den aktuelle endring i substratet og ikke. på grunn av endringer i andre parametre slik som cellulær pH.
Tre. Post-eksperiment Analysis
- Undersøke om prøven drift har oppstått i løpet av eksperimentet. Tegn regioner av interesse (ROI) er på bildet tatt ved endepunktet 0, og flytt deretter skyvelinjen øverst på bildevinduet og se om cellene faller ut av Rois i bilder tatt senere i forsøket.
- Hvis ja, så bruke sporingsfunksjonen til å korrigere for drift ved første, lage masker rundt cellene ved å velge Mask - Segment, skyv linjen som angir cutoff til highlight regionene inneholder celler. Spor regionene ved å klikke Mask - Particle sporing - Grunnleggende partikkel sporing.
- Re-trekke ROIs og bakgrunn regionen når det er nødvendig.
- Export den midlere intensitet av ROIs i løpet av eksperimentet. Klikk Statistikk - Eksport - Forholdet / timelapse data.
- Når FRET effektivitet og kvantifisering av substratet konsentrasjon er ikke nødvendig, plotte tidsforløpet av intensitetsforholdet (Donor ex akseptor em, / Donor ex Donor em) som en proxy av dynamikken i substratet. For å bestemme den cytosoliske konsentrasjon, beregner den maksimale og minimale forholdet endring (dvs. på-matnings-og fravær av substratet, henholdsvis), Ar max - Ar min, ved ikke-lineær regresjon av Δratio (Ar) med følgende ligning:
Ar = [S] / (K d + [S]) x (Ar
hvor [S] er konsentrasjonen av substratet i cytosol. Ved hjelp av de Ar max - Ar min verdier som oppnås, metning (S) av sensoren ved en gitt Ar beregnes
S = (Ar - Ar min) / (Ar max - Ar min)
S kan videre bli omdannet til den substratkonsentrasjon [S] ved hjelp av følgende ligning:
S = [S] / (K d + [S])
Merk: intensiteten av akseptor ex akseptor em-kanal bør være også tegnet inn for å undersøke hvorvidt den eksperimentelle tilstand påvirket fluorescensen av akseptor direkte. - Når en baseline drift på grunn av foto-bleking er observert, utføre en baseline korreksjon. For å gjøre dette, plotte intensiteter av donor og akseptor over tid (Figur 5A). Deretter identifisere de tidspunkter som brukes for the grunnlinje, i henhold til forsinkelsen i perfusjons-systemet og transport aktiviteten av den bestemte cellen (figur 5B).
- Beregn en polynomet montering som best beskriver grunnlinjen. Deretter normalisere rå intensitet fra hver endepunktet til grunnlinjen (figur 5C). Beregn intensiteten ratio (Donor ex Acceptor em, / Donor ex Donor em) fra de normaliserte donor og akseptor intensiteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typiske tidskursforsøk er representert på figur 2.. I disse forsøk FRET glutamin sensorer med affiniteter av 8 mM (FLIPQTV3.0_8m, figur 2A og 2B) og 100 pM (FlipQTV3.0_100 μ C og D) ble co-uttrykt med en obligatorisk aminosyre leren ASCT2 18 i cos7 celler 10. Tilstrømningen av glutamin er detektert som endring i fluorescens-intensitetsforhold mellom donor (mTFP1) og akseptor (venus) (Fig. 2A og 2C). Effluks av glutamin i nærvær av et annet substrat (Ala) er også tydelig vist i disse forsøkene. Med begge sensorene, normaliserte fluorescerende intensiteter endres gjensidig (dvs. går donor intensiteten opp som akseptor intensitet går ned, fig 2B og 2D) i nærvær av substratet, noe som tyder på at forholdet mellom forandring observert er faktisk på grunn av to endringen i FRET effektivitet. Disse forsøk viser at glutaminkonsentrasjoner i disse cellene varierer svært dynamisk i henhold til den eksperimentelle tilstand; fra deteksjonsområde fra 100 mikrometer sensor til nær-metningskonsentrasjonen for 8 mm sensor.
Substratspesifisiteter av transportører kan også undersøkes ved hjelp av sensorer, vist i figur 3.. I disse eksperimentene ble cellene forhåndslastet med glutamin, og så forskjellige aminosyrer ble tilsatt til det ekstracellulære perfusatet for å undersøke om disse aminosyrer kan indusere glutamin effluks. Som forventet, ASCT2 underlag (ALA, Tjen, Cys, THR, D-serin) indusert glutaminutstrømning (fig. 3A), mens ikke-substrat aminosyrer (Pro, Hans, Lys) ikke (fig. 3B), bekreftende med tidligere studier 18. Vanligvis er substratspesifisitet målt ved konkurranse-assay ved å bruke en radio-isotop-merkede substrat blandet med konkurrerende substrat, Som er forholdsvis arbeidskrevende og krever en populasjon av celler som er jevnt fordelt uttrykker transportøren for å bli undersøkt. Optisk avbildning eksemplifisert her tilbyr en alternativ tilnærming.
Når ingen FRET effektivitet endringer er observert ved tilsetning av substratet, kan flere grunner overveies. En mulig årsak er den lave opptakskapasitet for substratet under testing og / eller høy aktivitet av enzymer som opprettholder konsentrasjonen i cellene. For eksempel, glutamin konsentrasjonsforandringen var minimal i cos7 celler som ikke uttrykker ASCT2 transportør under forutsetning testet, selv om denne cellelinjen kan tydelig vokse i mediet som glutamin i hovednitrogenkilde (figur 4). I tillegg, hvis affiniteten av sensoren er enten for høyt eller for lavt i forhold til den intracellulære konsentrasjon, vil mesteparten av sensor proteiner forblir konstitutivt bundet eller ubundet henholdsvis; dermed ingen FRET effektivitet endringen vil være detected.
Figur 1. Konfigurasjon av en FRET glutamin sensor. (A) Åpen (cyan) og lukket (gul) konformasjon av glnH, glutamin bindende protein fra E.coli. Posisjonen hvor mTFP1 er satt inn er markert i magenta. (B) Skjematisk representasjoner av FLIPQTV_3.0 sensorer.
Figur 2. In vivo glutamin målinger ved hjelp FLIPQ-TV3.0_8m og 100μ sensorer. (A) Den venus/mTFP1 forholdet mellom cos7 celler co-uttrykke FLIPQ-TV3.0_8m sensor og ASCT2-mCherry. mCherry tag ble anvendt for å identifisere celler som uttrykker transportER uten å forstyrre de mTFP1 eller venus utslippskanaler. Cellene ble perfundert med HEPES-bufret Hanks-buffer (pH 7.35). Tidspunkter når det ekstracellulære glutamin (rød) og alanin (blå) ble tilsatt til perfusjon materiale, er angitt i bokser over grafen. Solide og stiplede linjer representerer to enkeltceller, målt i det samme eksperimentet. (B) De intensiteter av donor (mTFP1) og akseptor (venus) kanaler i eksperimentet vist i (A). Verdiene ble korrigert for fotobleking og normalisert til grunnlinjen. (C) og (D) Et lignende eksperiment som i (A) og (B), fremført med cos7 celler som uttrykker FLIPQ-TV3.0_100μ sensor. (Figur modifisert fra 10).
Figur 3.. Avskaffelse av mobilnettet glutamin through ASCT2 transporter i nærvær av ytre aminosyrer, visualisert ved hjelp av FLIPQ-TV3.0_8m sensor. (A) cytosoliske glutamin eksporteres ved tilsetning av ekstracellulære Ala, Ser, Cys, Thr og D-ser. Tidspunkter når ekstracellulære glutamin (røde bokser) eller andre aminosyrer (blå bokser) ble lagt til i perfusjon media er angitt som bokser over grafen. (B) Tilsetting av Pro, Lys, Hans (svarte boksene) endrer ikke cytosolic glutamin konsentrasjon , mens tilsetning av Ala (blå bokser) fremmer eksport av glutamin. Solide og stiplede linjer representerer to enkeltceller, målt i det samme eksperimentet. Alle aminosyrene ble tilsatt i 5 mM ytre konsentrasjoner. (Figur ble opprinnelig utgitt i 10).
Figur 4. venus/mTFP1 forholdet mellom cos7 celler. Expressing FLIPQ-TV3.0_8m sensor (A) og 100μ sensoren (B). Cellene ble perfundert med HEPES-bufret Hanks buffer. Tidspunkter når det ekstracellulære glutamin (5 mM) ble tilsatt til perfusjon materiale, er angitt som røde bokser over grafen. Solide og stiplede linjer representerer to enkeltceller, målt i det samme eksperimentet.
Figur 5. Korrigering for fotobleking. (A) Rå intensiteter fra to celler representert i figur 2A og 2C. (B) datapunkter som ble valgt for beregning av grunnlinjene. Polynomet sittende Kurvene er vist i figuren. (C) intensiteter av kanaler som vises i A, normalisert mot grunnlinjen regnes i B. Datasettet som brukes i dette tallet er identical til den som er vist i figur 2A og 2C.
Figur 6. In vivo glutamin målinger ved hjelp FLIPQ-TV3.0_1.5m sensor. (A) venus/mTFP1 forholdet mellom cos7 celler co-uttrykke FLIPQ-TV3.0_1.5m sensor og ASCT2-mCherry. mCherry koden ble brukt til å identifisere de cellene som uttrykker transporter uten å forstyrre de mTFP1 eller venus utslippskanaler. Cellene ble perfundert med HEPES-bufret Hanks-buffer (pH 7.35). Tidspunkter når det ekstracellulære glutamin (rød) og alanin (blå) ble tilsatt til perfusjon materiale, er angitt i bokser over grafen. Solid og stiplede linjer representerer to individuelle celler målt i samme eksperiment. (B) De intensiteter av donor (mTFP1) og akseptor (Venus) kanaleri eksperimentet vist i (A). Verdiene ble korrigert for fotobleking og normalisert til grunnlinjen.
| Tid (min) | Løsning A | Løsning B | Løsning C | Løsning D | Løsning E | Løsning F | |||||||
| 0 | ventil på | ||||||||||||
| 2 | ventilen | ventil på | |||||||||||
| 4 | ventil på | ventilen | |||||||||||
| 6 | ventilen | ventil på | |||||||||||
| 8 | ventil på | ventilen | 10 | ventilen | ventil på | ||||||||
| 12 | ventil på | ventilen | |||||||||||
| 14 | ventilen | ventil på | |||||||||||
| 16 | ventil på | ventilen | |||||||||||
| 18 | ventilen | ventil på | |||||||||||
| 20 | ventil på | ventilen | |||||||||||
| 22 | ventilen | ventil på | |||||||||||
| 24 | ventil på | ventilen | 26 | ventilen | ventil på | ||||||||
| 28 | ventil på | ventilen | |||||||||||
| 30 | ventilen | ventil på | |||||||||||
| 32 | ventil på | ventilen | |||||||||||
| 34 | ventilen |
. Tabell 1. Eksempel på perfusjonen protokoll som brukes i dette eksperimentet Løsning A:. 9,7 g Hank salt (H1387), 0,35 g NaHCO 3, 5,96 g HEPES til en l pH justert til 7,35 med NaOH-Løsning B:. Løsning A + 0,04 mM GLN Løsning C:.. Solution A + 0,2 mM GLN Solution D:. Solution A + 1 mM GLN Solution E:. Solution A + 5 mM GLN Solution F: Løsning A + 5 mM Ala
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Suksessen til bildebehandling eksperimenter avhenger noen kritiske faktorer. En av disse faktorer er affiniteten av-sensorer som brukes, som omtalt ovenfor. Absolutte konsentrasjon av substratet i det subcellulære rommet av interesse, er imidlertid ofte ukjent. Derfor anbefaler vi at du prøver flere sensorer med forskjøvet slektskap å finne det som fungerer best under ønsket eksperimentell tilstand. For eksempel, i vårt tilfelle vi tilført de cos7 celler med glutamin sensorer med 1.5μ, 100μ, 2m, og 8m (Figur 3 og data ikke vist).
En annen viktig faktor er uttrykket nivået av sensor-proteiner. Graden av ekspresjon er nødvendig for påvisning varierer mellom eksperimenter, For eksempel, når en kortvarig hendelse (f.eks enkelt aksjonspotensial) trenger å bli observert en høyere ekspresjon nivå kan være nødvendig 19. Derfor, i de fleste tilfeller er det nivået som kreves må være empirically bestemt. Dersom målet foreligger i meget lav konsentrasjon i cellen, kan endringen av de endogene prosesser på grunn av target uttømming bli et problem 20. En uavhengig assay for å bedømme en slik mulighet, hvis tilgjengelig, er derfor ønskelig. I forsøkene som er vist i denne artikkel, ble protein ekspresjon drevet av CMV-promoteren funnet å være tilstrekkelig. I situasjoner hvor promotorer med mye svakere aktiviteter må brukes, kan justeringer for å øke signal-intensiteter blir nødvendig. For eksempel kompromiss mellom signalintensitet og foto-bleking under eksponeringen må nås. I tillegg til lengre eksponeringstid kan faktorer som for eksempel lysstyrken av fluoroforer, maksimal intensitet endring av sensoren, binning, og følsomheten til CCD-kamera bli endret for å øke signalintensiteten.
Når ingen forholdet endring er observert i henhold til den eksperimentelle tilstand, selv om de to ovennevnte kriterier er sannsynligvisvære oppfylt, er det mulig at den cellulære homøostase for den gitte metabolitt eller ion er sterk nok til å maskere transportaktivitet (se resultatet avsnitt). I slike tilfeller kan cellelinjer med ulike biokjemiske aktiviteter være nødvendig som bakgrunn for å oppdage de transporter aktiviteter 10, 21.
Mens disse sensorene tillater en å overvåke konsentrasjons dynamikken i underlaget ved mye høyere tid og rom oppløsning enn utvinning baserte metoder, bestemmelse av absolutte konsentrasjon krever ytterligere eksperimentelle trinn og betraktninger. Vanligvis er substratkonsentrasjon beregnet under forutsetning av at sensoren affinitet, vanligvis beregnet ved å titrere renset sensor protein, er uendret når uttrykt i cellen. Konsentrasjonen beregnes ved hjelp av følgende enkelt bindende isotermen,
[S] = K d x (r - r min) / (r </ Em> max - r)
[S] er konsentrasjonen av substratet, K d er dissosiasjonskonstanten bestemmes in vitro, r er akseptor / donor-forhold ble observert ved en gitt endepunktet, r min er akseptor / donor-forhold når sensorene er i apo form, og r maks er akseptor / donor-forhold ved alle sensorene er bundet til substratet. min R og R max er påvirket av parametere som for eksempel konsentrasjonen av-sensorer, avbildnings innstillinger som brukes, og av sammensetningen av den cellulære milleu, og dermed må måles in situ . For å bestemme r min og r max verdier, forsøksbetingelser som tillater modifikasjon av intracellulær substratkonsentrasjon blir nødvendig. For eksempel, selektiv ionophores (f.eks ionomycin for Ca 2 +) 22 eller en perforeringskanon reagens slik som digitonin 23 kan brukes til å stabilisere intracellulær substrat-konsentrasjon med den ytre konsentrasjon.
En av begrensningene i den type av eksperimenter vist i denne protokollen er den lave gjennomstrømning; analyse er begrenset til å analysere en metabolitt i en relativt liten (<10) antall celler. Teknologiske fremskritt blir gjort, men å overvinne slike begrensninger. For eksempel, med forkant i automatisert, høyt innhold screening, er det nå mulig å bruke genetisk kodet sensorer i kombinasjoner med lite molekyl eller RNAi bibliotek; celler som uttrykker en biosensor kan dyrkes i en high-throughput-format (f.eks, 96 - eller 384-brønn), deretter de enkelte brønner kan behandles med enten siRNA eller kjemikalier og avbildes. Slike eksperimenter tillate identifisering av siRNA konstruksjoner eller kjemikalier som forstyrrer den biologiske prosessen som kan bli observert av biosensor 24 25. En annen spennende nytt fremskritt inkluderingdes til utvikling av en tid-løst microfluidic flowcytometer, som tillater høy gjennomstrømning påvisning av FRET virkningsgrad endring på cellenivå 26.. Slike tekniske fremskritt vil hjelpe oppdagelser av nye legemiddelkandidater og nye komponenter i biologiske prosesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det er ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH stipend 1R21NS064412, NSF stipend 1.052.048 og Jeffress Memorial Trust stipend J-908.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted fluorescent microscope | Olympus | IX81F-3-5 | An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also be appropriate. |
| Excitation filter (mTFP1) | Omega Optical | 3RD450-460 | Band width 450-460 nm |
| Excitation filter (Venus) | Chroma | ET500/20 | Band width 490-510 nm |
| Emission filter (mTFP1) | Chroma | HQ495/30m | Band width 475-505 nm |
| Emission filter (Venus) | Chroma | ET535/30m | Band width 520-550 nm |
| Dichroic mirror (FRET channels) | Chroma | 470dcxr | Long pass, 470 nm cut off |
| Dichroic mirror (YFP channel) | Chroma | 89002bs | Passes 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm |
| mCherry filter set | Chroma | 49008 | Excitation 540-580 nm, long pass dichroic with 585 nm cut off, emission filter 595-695 nm |
| Light source | Olympus | U-LH100L-3-5 | LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended |
| CCD camera | Qimaging | Rolera-MGi EMCCD | |
| Apochromatic fluorescence objective | Olympus | ||
| Perfusion system, ValveBank II | AutoMate Scientific | [01-08] | Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work |
| Laminar-flow chambers | C&L Instruments | VC-MPC-TW | Other larminar-flow chambers would also work. |
| Chambered slide | Lab-Tek | 154534 | For open-chamber experiments |
| Perfusion pump | Thermo Scientific | 74-046-12131 | For open-chamber experiments |
| Software supporting ratiometric measurements | Intellegenent Imaging Innovation | Slidebook 5.5 | |
| Laminar flow biosafety cabinet | ESCO | LA-3A2 | |
| Isotemp CO2 Incubator | Thermo Scientific | 13-255-25 | |
| Dulbecco's MEM (DMEM) | Hyclone | SH30243.01 | |
| Cosmic calf serum | Hyclone | SH3008703 | |
| Penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I) | Invitrogen | 31985 | Used with Lipofectamine 2000 |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma | P4707 | |
| 25 mm circular glass cover slips | Thermo Scientific | 12-545-102 | In case VC-MPC-TW is used |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | Other transfection reagents can also be used. |
| Solution A (Hank's buffer) | 9.7 g HANK salt (Sigma H1387), 0.35 g NaHCO3, 5.96 g HEPES to 1 L, pH adjusted to 7.35 with NaOH | ||
| Solution B | Solution A + 0.04 mM Gln | ||
| Solution C | Solution A + 0.2 mM Gln | ||
| Solution D | Solution A + 1 mM Gln | ||
| Solution E | Solution A + 5 mM Gln | ||
| Solution F | Solution A + 5 mM Ala |
References
- Haussinger, D. Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle. Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).
- Haussinger, D.
- Watford, M., Chellaraj, V., Ismat, A., Brown, P., Raman, P.
- Mustroph, A., et al. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 18843-18848 (2009).
- Sasagawa, Y., et al. Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity. Genome Biol. 14, R31 (2013).
- Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. The life cycle of Ca(2+) ions in dendritic spines. Neuron. 33, 439-452 (2002).
- Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative imaging with fluorescent biosensors. Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).
- Newman, R. H., Fosbrink, M. D., Zhang, J. Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells. Chemical reviews. , 111-3666 (2011).
- Okumoto, S. Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors. Curr Opin Biotech. 21, 45-54 (2010).
- Gruenwald, K., et al. Visualization of glutamine transporter activities in living cells using genetically encoded glutamine sensors. PLoS One. 7, e38591 (2012).
- Chaudhuri, B., et al. Protonophore- and pH-insensitive glucose and sucrose accumulation detected by FRET nanosensors in Arabidopsis root tips. Plant Journal. 56, 948-962 (2008).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
- Jiang, D. W., Zhao, L. L., Clapham, D. E. Genome-Wide RNAi Screen Identifies Letm1 as a Mitochondrial Ca2+/H+ Antiporter. Science. , 326-147 (2009).
- Barnett, N. L., Pow, D. V., Robinson, S. R. Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light. Glia. 30, 64-73 (2000).
- Rothstein, J. D., Tabakoff, B. Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition. J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).
- Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. X. Differential regulation of amino acid transporter SNAT3 by insulin in hepatocytes. J Biol Chem. 280, 26055-26062 (2005).
- Palmada, M., Speil, A., Jeyaraj, S., Bohmer, C., Lang, F. The serine/threonine kinases SGK1, 3 and PKB stimulate the amino acid transporter ASCT2. Biochem Bioph Res Co. 331, 272-277 (2005).
- Bröer, A., et al. The astroglial ASCT2 amino acid transporter as a mediator of glutamine efflux. J Neurochem. 73, 2184-2194 (1999).
- Wallace, D. J., et al. Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor. Nature. 5, 797-804 (2008).
- Haugh, J. M. Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring. Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).
- San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PLoS One. 8, e57712 (2013).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
- Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).
- Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening. PLoS One. 6, e20114 (2011).
- Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter. Science. 326, 144-147 (2009).
- Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells. J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).
