Summary
Эта статья покажет, как контролировать динамику глютамина в живых клетках с помощью волнуйтесь. Генетически кодируемые сенсоры позволяют мониторинг в реальном времени биологических молекул на субклеточном резолюции. Экспериментальное проектирование, технические детали экспериментальных установок, и соображения для пост-экспериментального анализа будут обсуждаться на генетически кодируемых сенсоров глютамина.
Abstract
Генетически кодируемые сенсоры позволяют мониторинг в реальном времени биологических молекул на субклеточном резолюции. Огромное разнообразие таких датчиков для биологических молекул стали доступны в последние 15 лет, некоторые из которых стали незаменимыми инструментами, которые обычно используются во многих лабораториях.
Один из интересных приложений генетически кодируемых датчиков является использование этих датчиков при исследовании процессов клеточного транспорта. Свойства перевозчиков, таких как кинетики и подложки специфики могут быть исследованы на клеточном уровне, обеспечивая возможности для камерного типа конкретных анализов транспортной деятельности. В этой статье мы покажем, как динамика транспортера можно наблюдать с помощью генетически закодированного датчик глютамина в качестве примера. Экспериментальное проектирование, технические детали экспериментальных установок, и соображения для пост-экспериментального анализа будут обсуждаться.
Introduction
Из-за значительного прогресса в области технологий, что позволяет экспертизу транскриптома и протеома на клеточном уровне, то сейчас она стала ясно, что биохимия и результирующий поток метаболитов и ионов весьма сотового типа конкретных. Например, в печени млекопитающих, последовательный деградация глутамина и синтез проводят одновременно по перипортальных клеток и клеток перивенозной соответственно, подача аммоний в цикле мочевины в первом типе клеток, потребляя избытка аммиака в последнем 1-3. В некоторых случаях, значительная биохимическая гетерогенность обнаруживается даже в одном "типа клеток" 4, 5. В дополнение к такому пространственной специфичности, клеточные уровни метаболитов и ионов высокой динамичностью (например, сигнальных молекул, таких как Са 2 + и циклических нуклеотидов). Пространственно-временные закономерности метаболитов и ионов часто играют важную роль в передаче сигнала. Ммониторинг функционирования клеточных динамику метаболитов и ионов, однако, представляют уникальную проблему. Во многих случаях изменение концентрации быстрый и временный, примером которого случае сигнальных молекул, таких как Ca 2 +, который распадается в течение ~ 20 мс в дендритных шипов 6. Кроме того, компартментализация биохимических путей в рамках и среди клеток затрудняет количественную динамику метаболитов и ионов с использованием экстракции и хроматографии на колонке / методы масс-спектрометрии.
Генетически кодируемые сенсоры для биологических молекул в настоящее время широко используется в связи с высокой пространственно-временной резолюции, которая позволяет экспериментатор изучать короткоживущие и / или обособленных молекулярной динамики (обзор в 7, 8). Эти генетически закодированные датчики можно условно разделить на две категории; датчики интенсивности основе и ratiometic датчики. Датчики интенсивности на основе, как правило, состоят из связывающего домена и гриппаorescent белок (FPS), и растворенное вещество связывания с связывающего домена изменяет интенсивность флуоресценции. Ratiometic датчики, с другой стороны, часто пользуются Фостер резонансный перенос энергии (FRET) между двумя ФП, которые функционируют как пара волнуйтесь. Эти датчики состоят из связывающего домена и двух ФП, и растворенное вещество связывания вызывает изменение эффективности FRET между двумя ФП. Большое количество датчиков для биологически важных метаболитов и ионов были разработаны в последнее десятилетие 8, 9.
Один из захватывающих возможности, предлагаемые таких генетически кодируемых сенсоров является их использование в анализе с высоким разрешением процессов мембранного транспорта, который ранее не был легко обнаружить на клеточном уровне. Генетически кодируемые сенсоры облегчить анализ транспортных механизмов, таких как субстратной специфичности и рН зависимости 10, 11. Кроме того, в сочетании с генетическими разрешенииources таких как библиотека РНК-интерференции конструкции для модельных организмов, в настоящее время можно проводить обыски генома для новых транспортных процессов с использованием генетически закодированные датчиков. Действительно, использование генетически закодированного датчика приводят к открытию ранее неохарактеризованных перевозчиков в нескольких случаях 12, 13.
В последнее время наша лаборатория разработала серию FRET основе датчика для глутамина. Мы показали, что уровни глютамина сотовой могут быть визуализированы с помощью таких FRET глютамина датчики 10. Эти датчики состоят из FRET донора (mTFP1), вставленной в бактериальную обязательного глютамин белка glnH, и FRET акцептора (Венера) на С-концах glnH (рис. 1). FRET эффективность этих датчиков уменьшить при связывании глутамина, в результате уменьшения отношения интенсивностей акцептор / доноров. Изысканные регулирование глютамин транспортных процессов играет важную роль в биологических процессах, таких как neurotransmission 14, 15 и содержание цикла мочевины в печени 1, 16, 17.
Здесь мы показываем, методологию анализа транспортной деятельности с FRET датчиков для глутамина, используя широким полем флуоресцентного микроскопа настройки. Цель экспериментов, представленных здесь, чтобы обнаружить транспортера деятельность в одной ячейке и изучить субстрата специфику временно выраженной транспортера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка образца
Примечание: Во многих случаях перфузии эксперименты смыть значительную часть клеток, которая может стать разочарование вопрос. Хотя не обязательно для всех клеточных линий, крышка покрытие стеклянных поверхностей с поли-L-лизин (добавить 1,0 ml/25 см 2 0,01% раствора на поверхность, инкубировать> 5 мин, мыть дважды класса культуры клеток водой и сушат в биобезопасности кабинет) повышает адгезию клеток. Кроме того, быть в курсе уровня безопасности (BSL) клеточной линии, используемой, и следовать стандартной операционной процедурой, утвержденной местной экологической офисе здоровья и безопасности. В этом эксперименте клетки COS7 были использованы из-за низкой эндогенного глутамина транспортной деятельности (см. рисунок 4).
- Семя клетки COS7 при ~ 70-80% слияния в Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) + 10% космического телячьей сывороткой и 100 ед / мл пенициллина / стрептомицина, или на стерильных 25 мм покровные стекла, помещенных в культуре 6-луночныйблюдо или стеклянным дном горки 8-а. Инкубировать при 37 ° C, 5% CO 2, 100% влажности в течение 24 часов.
- Замените питательную среду для DMEM + 10% космических сыворотки теленка (не антибиотики), в соответствии с протоколом производителя. Расти O / N при 37 ° С, 5% СО 2 при 100% влажности.
- Добавить 0,4 мг каждая из плазмидной ДНК, кодирующие датчик глутамин (pcDNA3.1, несущий датчик FLIPQTV3.0 под промотора цитомегаловируса 10) и mCherry-меченого ASCT2 от 10 до 50 мл бессывороточной среде (OPTI-MEM) и осторожно перемешать.
- Добавить 1 мл реагента для трансфекции в 50 мл бессывороточной средой. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Смешайте два решения, содержащие ДНК (шаг 1.3) и реагента для трансфекции (шаг 1.4) и инкубировать в течение 20 мин.
- Аккуратно добавить реагента для трансфекции в верхней части клеток и аккуратно перемешать покачиванием камеру. Выдержите в течение 24 часов при температуре 37 ° C, 5% CO 2, 100% влажности.
- После 24 часов, обменять среды в DMEM + 10% Космического телячьей сывороткой(CCS) + 100 единица пенициллина / стрептомицина.
- Клетки изображаются 48-72 ч после трансфекции.
2. Перфузии Эксперимент
Примечание: COS-7 клетки, используемые в данном эксперименте, средства массовой информации и перфузии камера хранились при комнатной температуре и окружающей среды концентрация СО 2. Тем не менее, если клетки используются требуют более высокой температуры и CO 2 контроль концентрации для выживания, подогреваемый столик микроскопа и / или окружающей среды камеру следует использовать.
- Подготовка перфузии буфера AF (См. перечень материалов). Прикрепите запорные краны до 50 мл шприцев, закрыть запорные краны затем заполнить их с перфузионные растворы. Откройте кран для краткого периода, чтобы заполнить свободное пространство в кран с буфером.
- Включите 8-канальный, гравитация-системы подачи перфузии с перфузии карандашом, а затем выберите "Ручной режим" в разделе Выбор опции Function. Поместите контейнер для отходов под перфузии карандашом.
- Вручнуюактивировать порты, нажав соответствующие номера и заполнить шланги с использованием 10 мл шприц, содержащий воду, а затем закрыть порт. После того, как порты заполнены водой, установить шприцы, содержащие буферные AF на порту 1-6 из системы перфузии, а затем открыть запорные краны. Открыть порты снова, чтобы заменить воду в трубке с буферов. Скорость потока должна быть около 0,8 мл / мин.
- Пресс отменить, как только на контроллере перфузии, чтобы вернуться в меню "Выбор функции". Перейдите к опции "Редактировать программы", затем введите в протокол перфузии указаны в таблице 1. Сохраните программу перфузии.
- Возьмем клетки из инкубатора. Мыть два раза с буфером перфузии, а затем установить клетки на сцене. Подключите систему перфузии в камеру. При использовании открытой камерой, создали еще один насос, который удаляет перфузии раствора из камеры.
- Откройте программное обеспечение Slidebook. Начните новый слайд.
Примечание:Следующая процедура является специфическим для программного обеспечения Slidebook, но и другие программы, такие как MetaFluor и Ниш-элемент также может быть использован для типа изображений, описанной здесь. Теоретически эксперименты могут быть выполнены с помощью любого программного обеспечения, позволяющего изображений время блюд, и последовательности изображений могут быть проанализированы после экспериментально с помощью программного обеспечения, таких как ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) или Фиджи (http:/ / fiji.sc / Фиджи). Тем не менее, программное обеспечение, которое позволяет отслеживать в режиме реального времени отношение акцептор / доноров является весьма полезным. - Монтаж салазок на сцену флуоресцентного микроскопа. Найти клетки коэкспрессирующей датчик и АТСК-mCherry с помощью соответствующих наборов фильтров (см. перечень материалов) под функции "Фокус". Отрегулируйте усиление, нажав вкладку "Камера" и сдвинув ползунок под "усилением". Кроме того, регулировать плотность установки нейтрального фильтра из фильтра плотность выпадающего меню нейтральной. Примечание: Если куб фильтр не включает в себя фильтр глаз, не использовать глазные штук с момента шорт-волны возбуждающего света вреден для глаз. Используйте экран компьютера, чтобы найти ячейки вместо этого.
- Получение изображений клеток with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (Фильтры, указанные в Перечне материалов). Нажмите кнопку "изображения", а затем в окне приобретения, указать фильтры, которые собираются использовать. Нажмите кнопку «TEST» для регулировки времени экспозиции, набрав нужное время экспозиции в поле рядом с настройками фильтров. Примечание: Все три канала должны быть выставлены на той же длины. При настройке параметров визуализации, принять ожидаемое изменение эффективности рвать и кратное увеличение во внимание: например, если эффективность FRET, как ожидается, подняться в 2 раза во время эксперимента, параметры визуализации должна быть скорректированатак что интенсивность донора экс акцепторной EM в состоянии покоя должна быть <50% максимального значения, которые могут быть записаны на приборе, так что канал не станет насыщенным ходе эксперимента. Сигнал от меченых клеток должно быть по крайней мере в три раза выше, чем в фоновой области.
- Нарисуйте область интереса с использованием регионы инструмент в программном обеспечении. Кроме того, функция программного обеспечения для выбора пикселей выше определенной интенсивности может быть использован, а затем преобразуется в регионах. Чтобы сделать это, нажмите Mask - сегмент, затем переместите ползунок, чтобы выделить нужные области.
- Выберите "промежуток времени" в поле типа захвата, затем укажите интервал (10 сек в этом эксперименте) и моменты времени для эксперимента.
- Нарисуйте область в районе без каких-либо флуоресцирующих клеток. Эта область используется для вычитания фона. Щелкните правой кнопкой мыши область обращается, а затем установить его в качестве фона. Примечание: В идеале, клетки, которые нет выразить датчики должны использоваться в качестве фоновой области, чтобы учитывать как флуоресценции и фоновой цветения, обнаруженного камерой. Если такие клетки не доступны в поле зрения, по меньшей мере, область без клеток следует использовать для учета фоновой флуоресценции.
- Выберите нужную программу в разделе "Select Function - Запуск программы" вариант. Перейдите к сохраненной программы (см. шаг 2.3), а затем ударил ENTER на контроллере перфузии. Теперь программа загружается, и поразить любую клавишу начнет перфузии.
- Убедитесь, перфузии и эксперимент изображений начать в то же время, нажав кнопку "Пуск" в окне захвата, в то же время, как нажатие клавиш на контроллере перфузии.
Примечание: Рекомендуется записать временной точке, где были обменены решения (это можно сделать с помощью "Записки" функции, найденные на вкладке приобретения). - Выполните те же протокола USI перфузиинг клеток, экспрессирующих датчик, который, как ожидается, быть либо насыщенным, либо несвязанный в экспериментальных услови х.
Примечание: Здесь FLIPQTV3.0_1.5μ, который насыщен в экспериментальных услови х, используется в качестве контроля, фиг.6 Такие контрольные эксперименты необходимы, чтобы подтвердить, что изменение эффективности FRET связано с фактическим изменением в подложке, а не. в связи с изменением других параметров, таких как сотовые рН.
3. Анализ после эксперимента
- Изучите, если образец дрейф произошла во время эксперимента. Нарисуйте регионах, представляющих интерес (ROI) с на изображении, полученном при временной точке 0, затем переместите ползунок в верхней части окна изображения и проверить, если клетки выпадают из трансформирования на снимках, сделанных позже в эксперименте.
- Если да, то используйте функцию отслеживания для коррекции дрейфа, сначала, создания масок вокруг клеток, выбрав Mask - сегмент, затем сдвиньте строку, задающую обрезание, теплицаhlight регионы, содержащая элементы. Ниже в хронологическом порядке регионы, нажав Mask - отслеживание частиц - отслеживание Basic частиц.
- Перерисовать трансформирования и фон регион в случае необходимости.
- Экспорт среднее интенсивность трансформирования в течение эксперимента. Нажмите Статистика - Экспорт - Данные побед / Timelapse.
- Когда эффективность FRET и количественное определение концентрации субстрата не надо, построить временной ход соотношения интенсивностей (Донор экс Acceptor эм, / Донор экс Донор EM) в качестве прокси динамики подложки. Для определения цитозольную концентрацию, рассчитать максимальные и минимальные изменения отношения (т. е. при насыщающего и отсутствие подложки, соответственно), Δr макс - Δr мин, по нелинейной регрессии Δratio (Δr) со следующим уравнением:
Δr = [S] / (K D + [S]) х (Δr
где [S] является концентрация субстрата в цитозоле. Используя Δr макс - значения Δr мин, полученные, насыщенность (S) датчика в данный Δr рассчитывается как
S = (Δr - Δr мин) / (Δr макс - Δr мин)
S далее могут быть преобразованы в концентрации субстрата [S], используя следующее уравнение:
S = [S] / (К д + [S])
Примечание: интенсивность Acceptor экс Acceptor эм канала должна быть также нанесена изучить влияние ли экспериментальная условие флуоресценцию акцептора непосредственно. - Когда базовый дрейф из-за фото-отбеливание наблюдается, выполнить базовую коррекцию. Чтобы сделать это, построить интенсивности донора и акцептора с течением времени (рис. 5, а). Тогда определить временные точки, используемые для гое базовый, в соответствии с задержкой в системе перфузии и транспортной активности конкретного клетки (фигура 5В).
- Рассчитать полиноминальными фитинг, что лучше всего описывает базовую линию. Тогда, нормализуют сырой интенсивность от каждой временной точке с базовым (рис. 5C). Рассчитать отношение интенсивности (Донор экс Acceptor ет, / Донор экс Донор EM) от нормированных донора и акцептора интенсивности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Типичные эксперименты времени курс представлены на рисунке 2. В этих экспериментах, FRET глютамина датчики с сродства 8 (2B FLIPQTV3.0_8m, рисунок 2А и В) мм и 100 мкМ (FlipQTV3.0_100 μ С и D) были коэкспрессии с обязательно теплообменник аминокислота ASCT2 18 в клетках COS7 10. Приток глутамина обнаруживается как изменение соотношения интенсивности флуоресценции между донором (mTFP1) и акцептора (Венера) (рис. 2А и 2С). Efflux глутамина в присутствии другого субстрата (Ala) также четко продемонстрировано в этих экспериментах. С обоих датчиков, нормированные люминесцентные интенсивности изменить взаимно (т. е. интенсивность донор идет вверх, как интенсивность акцептор идет вниз, рисунок 2В и 2D) в присутствии субстрата, которые свидетельствуют о том, что изменение соотношения наблюдаются действительно из-за то изменение эффективности FRET. Эти эксперименты показывают, что концентрации глютамина в этих клетках колебаться очень динамично в экспериментальных услови х; от дальности обнаружения датчика 100 мкМ концентрации вблизи насыщения для датчика 8 мм.
Субстратной специфичности транспортеров также могут быть изучены с помощью датчиков, показанных на рисунке 3. В этих экспериментах клетки были предварительно загружены глутамина, а затем различные аминокислоты были добавлены к внеклеточной перфузата изучить ли эти аминокислоты могут индуцировать отток глутамин. Как и ожидалось, ASCT2 субстраты (Ala, Ser, Cys, THR, D-серин), индуцированный глютамин оттока (рис. 3А), в то время как не-субстрата аминокислоты (Pro, Его, Lys) не сделал (рис. 3б), подтверждая тем предыдущие исследования 18. Как правило, субстратной специфичности измеряется конкурентных анализах с использованием радио меченого изотопом субстрата, смешанный с конкурирующими подложка, Которая является достаточно трудоемким и требует популяцию клеток, которые равномерно выражающую транспортер для изучения. Оптический изображений примером здесь предлагает альтернативный подход.
Когда никакие изменения эффективности FRET не наблюдается при добавлении субстрата, несколько причин, могут быть рассмотрены. Одной из возможных причин является низкая пропускная способность поглощения для подложки проходит испытания и / или высокой активностью ферментов, которые поддерживают концентрацию в клетках. Например, глютамин изменение концентрации был минимальным в клетках COS7 которые не выражают ASCT2 транспортер при условии испытания, хотя эта клеточная линия может четко расти в средствах массовой информации, в котором глютамин в основном источнике азота (рис. 4). Кроме того, если сродство датчика либо слишком высокой или слишком низкой по сравнению с внутриклеточной концентрации, большинство белков датчика будет оставаться конститутивно связанного или несвязанного соответственно; следовательно, никаких изменений эффективность FRET не будет гetected.
Рисунок 1. Конфигурация датчика FRET глутамина. (А) Открыть (голубой) и закрылся (желтый) конформацию glnH, глутамин связывающий белок из E.coli. Положение, в котором mTFP1 вставляется отмечается в пурпурный. (B) Схема представления датчиков FLIPQTV_3.0.
Рисунок 2. IN VIVO измерения глутамина с использованием FLIPQ-TV3.0_8m и датчики 100μ. (A) Отношение venus/mTFP1 клеток COS7 коэкспрессирующей датчик FLIPQ-TV3.0_8m и ASCT2-mCherry. mCherry тег используется для идентификации клеток, экспрессирующих транспортэ, не вмешиваясь каналы выбросов mTFP1 или Венеры. Клетки перфузии буфером HEPES буфером Хенкса (рН 7,35). Временных точках, когда внеклеточное глутамин (красный) и аланин (синий) был добавлен в перфузионной средой, как указано выше коробок на графике. Твердые и пунктирные линии представляют две отдельные клетки, измеренных в том же эксперименте. (B) Интенсивности донора (mTFP1) и акцептора (Венера) каналов в эксперименте, показанном в (А). Значения корректировали на фотообесцвечивания и нормализованы к базовой линии. (С) и (D) Аналогичный эксперимент, как в (а) и (б) выполнены с COS-7 клеток, экспрессирующих датчик FLIPQ-TV3.0_100μ. (Рис. модифицированный из 10).
Рисунок 3. Ликвидация сотовой глутамина твозь в ASCT2 транспортера в присутствии внешних аминокислот, визуализировали с использованием датчика FLIPQ-TV3.0_8m. (A) цитозольного глутамин экспортируется путем добавления внеклеточного Ala, Ser, Cys, Thr, и D-Ser. Моменты времени, когда внеклеточного глутамина (красные коробки) или другие аминокислоты (синие коробки) были добавлены в перфузии СМИ обозначены как коробки над графиком. (В) Добавление Pro, Lys, его (черных ящиков) не изменяет цитозольную концентрацию глютамина , в то время как добавление Ала (синие коробки) содействует развитию экспорта глутамина. Твердые и пунктирные линии представляют два отдельных клеток, измеренные в том же эксперименте. Все аминокислоты были добавлены в 5 внешних концентраций мм. (Рис. была впервые опубликована в 10).
Рисунок 4. Соотношение venus/mTFP1 клеток COS7 электроннойxpressing датчик FLIPQ-TV3.0_8m (А) и датчик 100μ (B). Клетки озарен HEPES-буферном буфера Хэнкса. Временных точках, когда внеклеточное глутамин (5 мМ) добавляли к перфузионной средой, как указано красные коробки над графиком. Твердые и пунктирные линии представляют два отдельных клеток, измеренные в том же эксперименте.
Рисунок 5. Корректировка фотообесцвечивания. (А) Сырье интенсивности от двух ячеек, представленных на рисунке 2А и 2С. (В) точек данных, которые были выбраны для расчета базовых линий. Полином прилегающие кривые приведены на рисунке. (C) Интенсивности каналов, показанных на А, нормированный против базовой линии, рассчитанной в B. набор данных, используемый в этом рисунке IDEntical показанному на фиг.2А и 2С.
Рисунок 6. В естественных условиях измерения глутамина с использованием датчика FLIPQ-TV3.0_1.5m. (A) Отношение venus/mTFP1 клеток COS7 коэкспрессирующей датчик FLIPQ-TV3.0_1.5m и ASCT2-mCherry. mCherry тег используется для идентификации клеток, экспрессирующих транспортер не вмешиваясь каналы выбросов mTFP1 или Венеры. Клетки перфузии буфером HEPES буфером Хенкса (рН 7,35). Временных точках, когда внеклеточное глутамин (красный) и аланин (синий) был добавлен в перфузионной средой, как указано выше коробок на графике. Твердые и пунктирные линии представляют два отдельных клеток, измеренные в том же эксперименте. (В) Интенсивность донора (mTFP1) и акцептора (Венера) каналыВ эксперименте, показанном на (А). Значения были исправлены для фотообесцвечивания и нормированы на базовой линии.
| Время (мин) | Решение | Раствор В | Раствор С | Раствор D | Решение E | Решение F | |||||||
| 0 | клапан на | ||||||||||||
| 2 | перекрывать задвижкой | клапан на | |||||||||||
| 4 | клапан на | перекрывать задвижкой | |||||||||||
| 6 | перекрывать задвижкой | клапан на | |||||||||||
| 8 | клапан на | перекрывать задвижкой | 10 | перекрывать задвижкой | клапан на | ||||||||
| 12 | клапан на | перекрывать задвижкой | |||||||||||
| 14 | перекрывать задвижкой | клапан на | |||||||||||
| 16 | клапан на | перекрывать задвижкой | |||||||||||
| 18 | перекрывать задвижкой | клапан на | |||||||||||
| 20 | клапан на | перекрывать задвижкой | |||||||||||
| 22 | перекрывать задвижкой | клапан на | |||||||||||
| 24 | клапан на | перекрывать задвижкой | 26 | перекрывать задвижкой | клапан на | ||||||||
| 28 | клапан на | перекрывать задвижкой | |||||||||||
| 30 | перекрывать задвижкой | клапан на | |||||||||||
| 32 | клапан на | перекрывать задвижкой | |||||||||||
| 34 | перекрывать задвижкой |
. Таблица 1 Пример протокола перфузии использовали в этом эксперименте Раствор А:. 9,7 г HANK соль (H1387), 0,35 г NaHCO 3, 5,96 г HEPES до 1 л рН доводили до 7,35 с NaOH раствора В:. Решение + 0,04 мМ Глн Раствор С:.. Решение + 0,2 мМ Глн Solutионный D:. Решение + 1 мМ Глн Решение E:. Решение + 5 мМ Глн Решение F: Решение + 5 мМ штат Алабама
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Успех экспериментов изображений зависит от нескольких важных факторов. Одним из таких факторов является сродство датчиков используются, как описано выше. Абсолютная концентрация субстрата в субклеточном компартменте интерес, однако, часто неизвестно. Поэтому мы рекомендуем попробовать несколько датчиков с шахматном сродства, чтобы найти тот, который работает лучше под нужный экспериментальных условиях. Например, в нашем случае трансфицировали в COS-7 клетки с помощью датчиков глутамина с 1.5μ, 100μ, 2м, и 8м (фиг.3 и данные не показаны).
Другим важным фактором является уровень экспрессии белков датчиков. Уровень экспрессии требуемого для обнаружения изменяется между, экспериментах Например, когда недолго событие (например, один потенциал действия) должен наблюдаться более высокий уровень экспрессии может стать необходимым 19. Таким образом, в большинстве случаев, требуемый уровень должен быть empiricallу определяется. Если цель существует в очень низкой концентрации в клетке, возмущение эндогенных процессов за счет целевой истощение может стать проблемой 20. Независимый анализ для оценки такой возможности, если таковые имеются, поэтому желательно. В экспериментах, показанных в этой статье, экспрессия белка обусловлен промотора цитомегаловируса было установлено, что достаточно. В ситуациях, когда промоутеры с гораздо более слабых деятельности должны быть использованы, корректировки по увеличению интенсивности сигнала может стать необходимым. Например, компромисс между интенсивностью сигнала и фото-обесцвечивания во время экспозиции должны быть достигнуты. В дополнение к большое время экспозиции факторы, как, например, яркости флуорофоров, максимального изменения интенсивности датчика, биннинга, и чувствительности ПЗС-камеры могут быть изменены, чтобы повысить интенсивность сигнала.
Когда отношение без изменений не наблюдается в экспериментальных услови х, даже если вышеупомянутые два критерия, скорее всего,быть выполнены, не исключено, что клеточный гомеостаз для данного метаболита или иона достаточно, чтобы замаскировать транспортной активности сильный (см. раздел результат). В таких случаях клеточные линии с различными биохимическими деятельности может потребоваться в качестве фона для обнаружения транспортер деятельности 10, 21.
В то время как эти датчики позволяют отслеживать динамику концентрации субстрата на гораздо более высоком разрешении, чем пространственно-временной экстракции на основе методов, определение абсолютной концентрации требует дополнительных экспериментальных шаги и соображения. Как правило, концентрация субстрата рассчитывается на предположении, что сродство сенсора, как правило, рассчитана путем титрования очищенный белок датчика, является неизменным при экспрессии в клетке. Концентрация рассчитывается с использованием следующей одного связывания изотермы,
[S] = К д х (г - г мин) / (г </ EM> макс - г)
[S] обозначает концентрацию субстрата, K D представляет собой константу диссоциации определяется в пробирке, R представляет собой отношение акцептор / донор наблюдается при заданной временной точке, т мин представляет собой отношение акцептор / донор, когда датчики выполнены в виде апо и R макс это соотношение акцептор / донор, когда все датчики связаны с подложкой. R мин и R макс находятся под влиянием параметров, таких как концентрации датчиков, параметры изображений, используемых и состава клеточной milleu и, следовательно, должны быть измерены на месте . Для определения г минимального и максимального R, экспериментальные условия, что позволяет модификация внутриклеточной концентрации субстрата становится необходимым. Например, селективные ионофоры (например, иономицин для Ca 2 +) 22 или перфорации реагента, такого как диgitonin 23 может быть использован, чтобы уравновесить внутриклеточной концентрации субстрата с внешним концентрации.
Одним из ограничений в типе экспериментов продемонстрировали в этом протоколе является низкая пропускная; анализ ограничен в анализе одного метаболита в относительно небольшом (<10) числа клеток. Технический прогресс делаются, однако, для преодоления таких ограничений. Например, с заранее в автоматизированном, скрининга высокого контента, теперь можно использовать генетически закодированные датчиков в комбинации с малой молекулы или библиотеки RNAi; клетки, экспрессирующие биосенсор может быть выращен в формате высокой пропускной (например, 96 - или 384-луночный), то отдельные скважины можно лечить с помощью любой миРНК или химических веществ и образ. Такие эксперименты позволяют идентифицировать миРНК конструкций или химических веществ, которые разрушают биологический процесс, что можно наблюдать на биосенсора 24 25. Еще одной интересной последним достижением включенийде разработка временным разрешением микрофлюидный проточного цитометра, что позволяет обнаруживать высокой пропускной изменения эффективности FRET на клеточном уровне 26. Такие технические достижения поможет открытия новых лекарств-кандидатов и новых компонентов в биологических процессах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Там нет ничего, чтобы раскрыть.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH грант 1R21NS064412, NSF гранта 1052048 и Джеффресс Мемориал Целевой грант J-908.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted fluorescent microscope | Olympus | IX81F-3-5 | An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also be appropriate. |
| Excitation filter (mTFP1) | Omega Optical | 3RD450-460 | Band width 450-460 nm |
| Excitation filter (Venus) | Chroma | ET500/20 | Band width 490-510 nm |
| Emission filter (mTFP1) | Chroma | HQ495/30m | Band width 475-505 nm |
| Emission filter (Venus) | Chroma | ET535/30m | Band width 520-550 nm |
| Dichroic mirror (FRET channels) | Chroma | 470dcxr | Long pass, 470 nm cut off |
| Dichroic mirror (YFP channel) | Chroma | 89002bs | Passes 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm |
| mCherry filter set | Chroma | 49008 | Excitation 540-580 nm, long pass dichroic with 585 nm cut off, emission filter 595-695 nm |
| Light source | Olympus | U-LH100L-3-5 | LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended |
| CCD camera | Qimaging | Rolera-MGi EMCCD | |
| Apochromatic fluorescence objective | Olympus | ||
| Perfusion system, ValveBank II | AutoMate Scientific | [01-08] | Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work |
| Laminar-flow chambers | C&L Instruments | VC-MPC-TW | Other larminar-flow chambers would also work. |
| Chambered slide | Lab-Tek | 154534 | For open-chamber experiments |
| Perfusion pump | Thermo Scientific | 74-046-12131 | For open-chamber experiments |
| Software supporting ratiometric measurements | Intellegenent Imaging Innovation | Slidebook 5.5 | |
| Laminar flow biosafety cabinet | ESCO | LA-3A2 | |
| Isotemp CO2 Incubator | Thermo Scientific | 13-255-25 | |
| Dulbecco's MEM (DMEM) | Hyclone | SH30243.01 | |
| Cosmic calf serum | Hyclone | SH3008703 | |
| Penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I) | Invitrogen | 31985 | Used with Lipofectamine 2000 |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma | P4707 | |
| 25 mm circular glass cover slips | Thermo Scientific | 12-545-102 | In case VC-MPC-TW is used |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | Other transfection reagents can also be used. |
| Solution A (Hank's buffer) | 9.7 g HANK salt (Sigma H1387), 0.35 g NaHCO3, 5.96 g HEPES to 1 L, pH adjusted to 7.35 with NaOH | ||
| Solution B | Solution A + 0.04 mM Gln | ||
| Solution C | Solution A + 0.2 mM Gln | ||
| Solution D | Solution A + 1 mM Gln | ||
| Solution E | Solution A + 5 mM Gln | ||
| Solution F | Solution A + 5 mM Ala |
References
- Haussinger, D. Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle. Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).
- Haussinger, D.
- Watford, M., Chellaraj, V., Ismat, A., Brown, P., Raman, P.
- Mustroph, A., et al. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 18843-18848 (2009).
- Sasagawa, Y., et al. Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity. Genome Biol. 14, R31 (2013).
- Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. The life cycle of Ca(2+) ions in dendritic spines. Neuron. 33, 439-452 (2002).
- Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative imaging with fluorescent biosensors. Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).
- Newman, R. H., Fosbrink, M. D., Zhang, J. Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells. Chemical reviews. , 111-3666 (2011).
- Okumoto, S. Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors. Curr Opin Biotech. 21, 45-54 (2010).
- Gruenwald, K., et al. Visualization of glutamine transporter activities in living cells using genetically encoded glutamine sensors. PLoS One. 7, e38591 (2012).
- Chaudhuri, B., et al. Protonophore- and pH-insensitive glucose and sucrose accumulation detected by FRET nanosensors in Arabidopsis root tips. Plant Journal. 56, 948-962 (2008).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
- Jiang, D. W., Zhao, L. L., Clapham, D. E. Genome-Wide RNAi Screen Identifies Letm1 as a Mitochondrial Ca2+/H+ Antiporter. Science. , 326-147 (2009).
- Barnett, N. L., Pow, D. V., Robinson, S. R. Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light. Glia. 30, 64-73 (2000).
- Rothstein, J. D., Tabakoff, B. Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition. J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).
- Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. X. Differential regulation of amino acid transporter SNAT3 by insulin in hepatocytes. J Biol Chem. 280, 26055-26062 (2005).
- Palmada, M., Speil, A., Jeyaraj, S., Bohmer, C., Lang, F. The serine/threonine kinases SGK1, 3 and PKB stimulate the amino acid transporter ASCT2. Biochem Bioph Res Co. 331, 272-277 (2005).
- Bröer, A., et al. The astroglial ASCT2 amino acid transporter as a mediator of glutamine efflux. J Neurochem. 73, 2184-2194 (1999).
- Wallace, D. J., et al. Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor. Nature. 5, 797-804 (2008).
- Haugh, J. M. Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring. Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).
- San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PLoS One. 8, e57712 (2013).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
- Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).
- Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening. PLoS One. 6, e20114 (2011).
- Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter. Science. 326, 144-147 (2009).
- Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells. J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).
