Summary
Cet article va vous montrer comment contrôler la dynamique de la glutamine dans les cellules vivantes en utilisant FRET. Capteurs codés génétiquement permettent un suivi en temps réel de molécules biologiques à une résolution subcellulaire. Conception expérimentale, les détails techniques des paramètres expérimentaux, et des considérations pour les analyses post-expérimentaux seront discutées pour les capteurs de glutamine codés génétiquement.
Abstract
Capteurs codés génétiquement permettent un suivi en temps réel de molécules biologiques à une résolution subcellulaire. Une grande variété de ces capteurs pour des molécules biologiques est devenu disponible dans les 15 dernières années, dont certains est devenu un outil indispensable qui sont utilisés en routine dans de nombreux laboratoires.
Une des applications intéressantes de capteurs codés génétiquement est l'utilisation de ces capteurs dans l'étude des processus de transport cellulaires. Propriétés des transporteurs tels que la cinétique et des spécificités de substrat peuvent être étudiés au niveau cellulaire, offrant des possibilités d'analyses spécifiques de type cellulaire des activités de transport. Dans cet article, nous allons démontrer comment la dynamique du transporteur peuvent être observés en utilisant le capteur de glutamine génétiquement codé comme un exemple. Conception expérimentale, les détails techniques des paramètres expérimentaux, et des considérations pour les analyses post-expérimentaux seront discutés.
Introduction
Grâce à des progrès remarquables dans les technologies qui permet l'examen du transcriptome et le protéome au niveau cellulaire, il est devenu clair que la biochimie et le flux résultant des métabolites et des ions sont de type cellulaire spécifique hautement. Par exemple, dans le foie de mammifère, de la dégradation séquentielle de la glutamine et de la synthèse sont effectuées simultanément par les cellules et les cellules périportes périveineux respectivement, l'alimentation ammonium dans le cycle de l'urée dans le premier type de cellule, tout en consommant un excès d'ammoniac dans celui-ci 3.1. Dans certains cas, l'hétérogénéité biochimique significatif est détecté, même dans une seule "de type cellulaire" 4, 5. En plus d'une telle spécificité spatiale, les niveaux cellulaires de métabolites et des ions sont très dynamiques (par exemple, des molécules telles que Ca 2 + et nucleotides cycliques de signalisation). Les patrons spatiotemporels de métabolites et des ions jouent souvent un rôle crucial dans la transduction du signal. MSUIVI dynamique cellulaire des métabolites et des ions, cependant, poser défi unique. Dans de nombreux cas, le changement dans les concentrations sont rapide et transitoire, comme en témoigne le cas de molécules de signalisation tels que Ca 2 +, qui se désintègre dans ~ 20 ms dans les épines dendritiques 6. En outre, le cloisonnement des voies biochimiques dans et entre les cellules, il est difficile de quantifier la dynamique des métabolites et des ions en utilisant une extraction et une Chromatographie sur colonne / des techniques de spectrométrie de masse.
Capteurs codés génétiquement pour les molécules biologiques sont maintenant largement utilisés en raison de la résolution spatio-temporelle élevée qui permet à l'expérimentateur d'étudier la dynamique moléculaire de courte durée et / ou compartimentées (revue en 7, 8). Ces capteurs codés génétiquement peuvent être grossièrement divisées en deux catégories; capteurs fondés sur l'intensité et des capteurs ratiometic. Capteurs basées sur l'intensité sont généralement constitués d'un domaine de liaison et une grippeorescent protéine (PF), et la liaison au domaine de liaison soluté modifie l'intensité de fluorescence. Capteurs Ratiometic, d'autre part, profitent souvent de transfert d'énergie par résonance Foster (FRET) entre deux points focaux qui fonctionnent comme une paire de FRET. Ces capteurs sont constitués d'un domaine de liaison et deux points focaux, et le soluté de liaison induit le changement de l'efficacité de FRET entre les deux points focaux. Un grand nombre de capteurs pour les métabolites et des ions biologiquement importantes ont été développées dans la dernière décennie, 8, 9.
Une des possibilités offertes par excitation de ces capteurs codés génétiquement est leur utilisation dans l'analyse à haute résolution du processus de transport de la membrane, ce qui était jusqu'à présent pas facile à détecter au niveau cellulaire. Capteurs codés génétiquement faciliter l'analyse des mécanismes de transport tels que la spécificité du substrat et de la dépendance au pH 10, 11. De plus, en combinaison avec les res génétiquesources comme la bibliothèque de l'ARNi construit pour des organismes modèles, il est désormais possible d'effectuer des recherches sur le génome entier pour de nouveaux procédés de transport à l'aide de capteurs codés génétiquement. En effet, l'utilisation d'organismes génétiquement codé la sonde à la découverte des transporteurs non définies auparavant dans plusieurs cas 12, 13.
Récemment, notre laboratoire a développé une série de capteur à base de FRET pour la glutamine. Nous avons démontré que les niveaux de glutamine cellulaire peuvent être visualisés à l'aide de tels capteurs FRET de glutamine 10. Ces capteurs sont constitués d'un donneur de FRET (mTFP1) inséré dans une protéine bactérienne liant glnH glutamine, et un accepteur de FRET (venus) à l'extrémité C-terminale de glnH (Figure 1). FRET efficacité de ces capteurs diminuer lors de la liaison de la glutamine, ce qui entraîne la diminution du rapport d'intensité accepteur / donneur. Régulation fine des processus de transport de la glutamine est important dans les processus biologiques tels que neurotransmission 14, 15 et le maintien de cycle de l'urée dans le foie 1, 16, 17.
Ici, nous montrons la méthodologie de l'analyse des activités de transport de capteurs FRET pour la glutamine, l'aide d'un grand champ microscope à fluorescence set-up. Le but d'expériences montrées ici sont pour détecter les activités de transporteur dans une seule cellule et pour examiner la spécificité de substrat d'un transporteur exprimé de manière transitoire.
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Protocol
1. Préparation de l'échantillon
Remarque: Dans de nombreux cas expériences de perfusion lavent une partie importante de cellules, ce qui peut devenir un problème frustrant. Bien que n'étant pas nécessaire pour toutes les lignées cellulaires, les surfaces de verre de revêtement de couverture avec la poly-L-lysine (ajouter 1,0 ml pour 25 cm 2 de solution à 0,01% de la surface, incuber> 5 min, laver deux fois avec de l'eau de qualité culture cellulaire et sec l'enceinte de sécurité biologique) améliore l'adhérence cellulaire. Aussi, soyez conscient du niveau de biosécurité (BSL) de la lignée cellulaire utilisée, et suivez la procédure d'exploitation standard approuvé par le bureau local de la santé et de la sécurité de l'environnement. Dans cette expérience, les cellules COS7 ont été utilisés en raison de la faible activité de transport de la glutamine endogène (voir figure 4).
- Graine cellules cos7 à ~ 70-80% de confluence dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) + 10% de sérum de veau cosmique et 100 U / ml de pénicilline / streptomycine, soit sur des lamelles de verre stériles de 25 mm placés dans la culture à 6 puitsplat ou des lames de verre à fond de 8 puits. Incuber à 37 ° C, 5% CO 2, à 100% d'humidité pendant 24 heures.
- Échanger le milieu de culture DMEM à 10% de sérum de veau cosmique (sans antibiotiques), selon le protocole du fabricant. Cultivez O / N à 37 ° C, 5% de CO 2 à 100% d'humidité.
- Ajouter 0,4 mg chacune d'un ADN plasmidique codant pour le capteur de la glutamine (pcDNA3.1, transportant capteur de FLIPQTV3.0 sous promoteur CMV 10) et le ASCT2 mCherry à étiquette 10 à 50 ml de milieu sans sérum (Opti-MEM) et mélanger doucement.
- Ajouter 1 ml de réactif de transfection à 50 ml du milieu sans sérum. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Mélanger les deux solutions contenant de l'ADN (étape 1.3) et un réactif de transfection (étape 1.4) et incuber pendant 20 min.
- Ajouter délicatement le réactif de transfection sur des cellules et mélanger doucement en faisant basculer la chambre. Incuber pendant 24 heures à 37 ° C, 5% CO 2, à 100% d'humidité.
- Après 24 h, échanger le milieu de DMEM + 10% de sérum de veau cosmique(CCS) + 100 unités de pénicilline / streptomycine.
- Les cellules sont imagés 48-72 heures après la transfection.
2. Perfusion Expérience
Remarque: Pour les cellules cos7 utilisées dans cette expérience, les milieux de perfusion et de la chambre ont été maintenus à la température ambiante et la concentration du CO 2 ambiant. Toutefois, si les cellules utilisées nécessitent une température plus élevée et le CO 2 de contrôle de la concentration pour la survie, la platine du microscope chauffé et / ou une chambre de l'environnement doivent être utilisés.
- Préparer la perfusion AF tampon (Voir la liste des matériaux). Attacher les robinets à seringues de 50 ml, fermer les robinets puis les remplir avec les solutions de perfusion. Ouvrir le robinet pendant une brève période pour remplir l'espace de tête dans le robinet avec le tampon.
- Allumez le 8 canaux, système de perfusion par gravité avec un crayon de perfusion, puis sélectionnez "mode manuel" sous Sélectionnez l'option de fonction. Placez un conteneur à déchets sous le crayon de perfusion.
- Manuellementactiver les ports en appuyant sur les chiffres correspondants et remplir les tuyaux à l'aide seringue de 10 ml contenant de l'eau, puis fermer le port. Une fois que les ports sont remplis avec de l'eau, mettre les seringues contenant des tampons AF sur le port 1-6 de système de perfusion, puis ouvrez les robinets. Ouvrir les orifices de nouveau pour remplacer l'eau dans le tube avec les tampons. Le débit devrait être d'environ 0,8 ml / min.
- Appuyez sur annuler, une fois sur le contrôleur de perfusion pour retourner au menu "Select Function". Basculez l'option "Editer un programme", puis tapez dans le protocole de perfusion indiqué dans le tableau 1. Enregistrez le programme de perfusion.
- Prenez les cellules de l'incubateur. Laver deux fois avec le tampon de perfusion, puis définissez les cellules sur la scène. Connectez le système de perfusion à la chambre. Si une chambre ouverte est utilisée, mettre en place une autre pompe qui élimine la solution de perfusion de la chambre.
- Ouvrez le logiciel Slidebook. Lancer une nouvelle diapositive.
Note:procédure suivante est spécifique au logiciel Slidebook, mais d'autres logiciels comme MetaFluor et Nis-élément peut également être utilisé pour le type de formation d'image décrit ici. Théoriquement expériences peuvent être réalisées en utilisant n'importe quel logiciel qui permet l'imagerie temps bien sûr, et les séquences d'images peuvent être analysées après expérimentalement en utilisant un logiciel tel que ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) ou Fidji (http:/ / fiji.sc / Fidji). Cependant, un logiciel qui permet de surveiller en temps réel des taux accepteur / donneur est très utile. - Monter la lame sur la platine du microscope fluorescent. Trouver les cellules co-exprimant le capteur et ASCT-mCherry utilisant des filtres appropriés (voir la liste des matériaux) sous la fonction "FOCUS". Régler le gain en cliquant sur l'onglet "Caméra" et en faisant glisser le curseur sous "gain". En outre, régler le filtre de densité neutre à partir du menu déroulant de filtre de densité neutre. Remarque: Si le cube de filtre ne comprend pas un filtre pour les yeux, ne pas utiliser les yeux morceaux depuis shorT-longueur d'onde de lumière d'excitation est dangereux pour les yeux. Utilisez l'écran de l'ordinateur pour trouver les cellules à la place.
- Acquérir des images de cellules with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (Filtres sont indiqués dans la liste des matériaux). Cliquez sur "Capture d'image", puis dans la fenêtre d'acquisition, spécifiez les filtres qui vont être utilisés. Cliquez sur le bouton "TEST" pour régler le temps d'exposition en tapant le temps d'exposition souhaité dans la boîte à côté des réglages de filtre. Note: Tous les trois canaux doivent être exposés à la même longueur. Lors du réglage des paramètres d'imagerie, prendre le FRET changement de l'efficacité attendue et multiplication en compte: par exemple, s'il est prévu que l'efficacité de FRET de monter 2 fois au cours de l'expérience, les paramètres d'imagerie doivent être ajustésde sorte que l'intensité du donneur accepteur ex em à l'état de repos doit être <50% de la valeur maximale pouvant être enregistrée par l'instrument, de sorte que le canal ne devienne pas saturé pendant l'expérience. Signal à partir des cellules marquées doit être au moins trois fois supérieure à celle de la région d'arrière-plan.
- Dessiner une région d'intérêt en utilisant les régions outil dans le logiciel. Alternativement, une fonction logicielle pour sélectionner pixels au-dessus certaine intensité peut être utilisé, et ensuite converti en régions. Pour ce faire, cliquez sur Masque - Segment, puis déplacez la barre coulissante pour mettre en évidence les zones souhaitées.
- Sélectionnez «laps de temps» dans la boîte de type de capture, puis spécifiez l'intervalle (10 secondes dans cette expérience) et des points de temps pour l'expérience.
- Dessiner une région dans une zone sans cellules fluorescentes. Cette zone est utilisée pour soustraction de fond. Faites un clic droit de la région dessiné, puis le définir comme un arrière-plan. Note: Idéalement, les cellules qui ne sontT exprimant les capteurs doit être utilisée comme la région d'arrière-plan afin de tenir compte à la fois pour l'autofluorescence et la fluorescence d'arrière-plan détectée par la caméra. En l'absence de telles cellules sont disponibles dans le champ de vision, au moins une région sans les cellules doit être utilisé pour tenir compte de la fluorescence de fond.
- Sélectionnez le programme souhaité sous "Sélectionner une fonction - Exécuter les programmes" option. Basculer vers le programme enregistré (voir l'étape 2.3), puis appuyez sur ENTRER sur le contrôleur de perfusion. Maintenant, le programme est chargé, et en appuyant sur n'importe quelle touche pour démarrer la perfusion.
- Assurer la perfusion et l'expérience d'imagerie commencer en même temps en cliquant sur le bouton "Démarrer" dans la fenêtre de capture en même temps que d'appuyer sur une touche sur le contrôleur de perfusion.
Note: Il est recommandé d'enregistrer le point de temps où les solutions ont été échangés (ce qui peut être fait en utilisant la fonction «NOTES», trouvés dans l'onglet d'acquisition). - Effectuez la même perfusion protocole USIng cellules exprimant un capteur qui est prévu pour être saturé ou non lié à la condition expérimentale.
Remarque: ici, FLIPQTV3.0_1.5μ, qui est saturé dans la condition expérimentale, est utilisé en tant que contrôle, la figure 6 Ces expériences de contrôle sont nécessaires pour confirmer que le changement de l'efficacité de FRET est due à la variation réelle du substrat et non. en raison de la variation des autres paramètres tels que le pH cellulaire.
3. Analyse de post-expérience
- Examiner si la dérive de l'échantillon a eu lieu au cours de l'expérience. Dessiner des régions d'intérêt (ROI) s sur l'image prise au point de temps 0, puis déplacez la barre coulissante en haut de la fenêtre d'imagerie et de vérifier si les cellules tombent des ROI dans les images prises plus tard dans l'expérience.
- Si oui, alors utiliser la fonction de suivi pour corriger la dérive d'abord, la création de masques autour des cellules en sélectionnant Masque - Segment, puis faites glisser la ligne qui spécifie le seuil de highlight les régions contenant des cellules. Suivre les régions en cliquant sur Masque - suivi de particules - suivi de particules de base.
- Redessiner le ROI et la région de fond si nécessaire.
- Exporter l'intensité moyenne des ROI au cours de l'expérience. Cliquez sur Statistiques - Export - Ratio données / timelapse.
- Lorsque l'efficacité de FRET et la quantification de la concentration en substrat n'est pas nécessaire, tracer le cours du temps du rapport d'intensité (Donateur ex accepteur de lui, / donateurs ex em donateurs) comme un proxy de la dynamique du substrat. Pour déterminer la concentration cytosolique, calculer la variation maximale et minimale du rapport (c'est à dire, lors de la saturation et de l'absence de substrat, respectivement), Ar max - min Ar, par régression non-linéaire de Δratio (Ar) avec l'équation suivante:
Ar = [S] / (K + d [S]) x (Ar
où [S] est la concentration du substrat dans le cytosol. En utilisant les Ar max - AR valeurs min obtenus, la saturation (S) du capteur à Ar donné est calculée comme
S = (Ar - Ar min) / (Ar max - min Ar)
S peut en outre être convertie en la concentration de substrat [S] à l'aide de l'équation suivante:
S = [S] / (K + d [S])
Remarque: l'intensité du canal de lui accepteur ex accepteur doit être aussi comploté pour examiner si la condition expérimentale influencé la fluorescence de l'accepteur directement. - Quand une dérive de base en raison de la photo-blanchiment est observé, effectuer une correction de base. Pour ce faire, tracer les intensités de donneur et de l'accepteur dans le temps (Figure 5A). Ensuite, identifier les points de temps utilisés pour ee ligne de base, en fonction du retard dans le système de perfusion et l'activité de transport de la cellule particulière (figure 5B).
- Calculer un raccord polynôme qui décrit le mieux la ligne de base. Ensuite, normaliser l'intensité brute de chaque heure à la ligne de base (figure 5C). Calculer le ratio de l'intensité (Donateur ex accepteur de lui, / donateurs ex em donateurs) à partir des intensités de donneur et accepteur normalisés.
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Representative Results
Temps-cours des expériences typiques sont représentées sur la figure 2. Lors de ces expériences, les capteurs FRET de la glutamine ayant des affinités de 8 mM (FLIPQTV3.0_8m, la figure 2A et 2B) et 100 uM (FlipQTV3.0_100 μ C et D) ont été co-exprimés avec une condition de l'échangeur d'acides aminés ASCT2 18 dans des cellules COS7 10. Afflux de glutamine est détecté en tant que changement de rapports d'intensité de fluorescence entre le donneur (mTFP1) et l'accepteur (venus) (figure 2A et 2C). Efflux de glutamine en présence d'un autre substrat (Ala) est également clairement démontrée dans ces expériences. Avec deux capteurs, intensités de fluorescence normalisés changent réciproquement (c'est à dire, l'intensité des donateurs augmente l'intensité de l'accepteur descend, Figure 2B et 2D) en présence de substrat, ce qui suggère que le changement de rapport sont en effet observés en raison to la variation de l'efficacité de FRET. Ces expériences montrent que les concentrations de glutamine dans ces cellules varient très dynamiquement sous la condition expérimentale; à partir de la plage de détection du capteur de 100 pM à la concentration proche de la saturation pour capteur de 8 mM.
spécificités de substrat des transporteurs peuvent également être examinés à l'aide de capteurs, l'illustre la figure 3. Dans ces expériences, les cellules ont été pré-chargées avec de la glutamine, et ensuite divers acides aminés ont été ajoutés à la solution de perfusion extracellulaire d'examiner si ces acides aminés peuvent induire glutamine efflux. Comme prévu, les substrats ASCT2 (Ala, Ser, Cys, Thr, D-sérine) induite efflux de glutamine (figure 3A), tandis que les acides aminés non-substrat (Pro, His, Lys) n'a pas (figure 3B), ce qui corrobore avec Des études antérieures 18. Habituellement, la spécificité du substrat est mesurée par des tests de compétition en utilisant un substrat marqué avec un isotope mélangé avec la radio substrat concurrent, Qui est assez laborieux et nécessite une population de cellules qui expriment uniformément le transporteur à étudier. L'imagerie optique illustré ici propose une approche alternative.
Lorsque aucune modification de l'efficacité de FRET sont observés lors de l'addition du substrat, plusieurs raisons peuvent être envisagées. Une raison possible est la faible capacité d'absorption pour le substrat à tester et / ou à des activités élevées d'enzymes qui maintiennent la concentration dans les cellules. Par exemple, la glutamine changement de concentration était minime dans les cellules cos7 qui n'expriment pas ASCT2 transporteur dans les conditions testées, même si cette lignée cellulaire peut croître clairement dans les milieux dans lesquels la glutamine dans la source principale d'azote (figure 4). En outre, si l'affinité de la sonde est soit trop élevé ou trop bas par rapport à la concentration intracellulaire, la plupart des protéines de détecteur reste lié ou non lié de manière constitutive, respectivement; donc pas de changement de l'efficacité de FRET sera Detected.
Figure 1. Configuration d'un capteur FRET de la glutamine. (A) ouverte (cyan) et fermé (jaune) conformation de glnH, la protéine de liaison de E. coli glutamine. La position où mTFP1 est inséré est marqué en magenta. (B) Représentation schématique de capteurs de FLIPQTV_3.0.
Figure 2. In vivo des mesures de glutamine aide de capteurs de 100μ FLIPQ-TV3.0_8m et. (A) Le rapport de venus/mTFP1 de cellules COS7 co-exprimant capteur FLIPQ-TV3.0_8m et ASCT2-mCherry. mCherry tag a été utilisé pour identifier les cellules exprimant le transporter sans interférer les canaux d'émission mTFP1 ou venus. Les cellules ont été perfusées avec le tampon de tampon HEPES Hank (pH 7,35). Timepoints lorsque glutamine extracellulaire (rouge) et l'alanine (bleu) a été ajouté aux milieux de perfusion sont indiqués comme boîtes au-dessus du graphique. Les lignes continues et pointillées représentent les deux cellules individuelles mesurées dans la même expérience. (B) Les intensités de donateurs (mTFP1) et accepteurs (venus) des canaux dans l'expérience présentée dans (A). Les valeurs ont été corrigées pour photoblanchiment et normalisées par rapport à la ligne de base. (C) et (D) Une expérience similaire à celle de (A) et (B), réalisée avec des cellules COS7 exprimant le capteur FLIPQ-TV3.0_100μ. (Modifié à partir de la figure 10).
Figure 3. Élimination de la glutamine cellulaire Through le transporteur de ASCT2 en présence d'acides aminés externes, visualisé en utilisant le capteur FLIPQ-TV3.0_8m. (A) la glutamine cytosolique est exportée par l'addition de extracellulaire Ala, Ser, Cys, Thr, et D-ser. Timepoints quand glutamine extracellulaire (cases rouges) ou d'autres acides aminés (boîtes bleues) ont été ajoutés aux médias de perfusion sont indiqués comme des boîtes au-dessus du graphique. (B) Ajout de Pro, Lys, ses (boîtes noires) ne modifie pas la concentration de glutamine cytosolique , tandis que l'addition de Ala (cases bleues) favorise l'exportation de la glutamine. Les lignes pleines et pointillées représentent deux cellules individuelles mesurées dans la même expérience. Tous les acides aminés ont été ajoutés à des concentrations extérieures 5 mM. (Figure a été initialement publié en 10).
Figure 4. Le ratio d'venus/mTFP1 de cellules cos7 expressing capteur FLIPQ-TV3.0_8m (A) et le capteur de 100μ (B). Les cellules ont été perfusées avec du tampon de Hank tamponnée par HEPES. Timepoints lorsque glutamine extracellulaire (5 mM) a été ajouté aux milieux de perfusion sont indiqués comme des boîtes rouges au-dessus du graphique. Les lignes pleines et pointillées représentent deux cellules individuelles mesurées dans la même expérience.
Figure 5. Correction de photoblanchiment. (A) intensités brutes des deux cellules représentées dans la figure 2A et 2C. (B) points de données qui ont été sélectionnés pour le calcul des lignes de base. Ajustement des courbes polynômes sont présentés dans la figure. (C) Les intensités de canaux indiqués dans A, normalisé contre la ligne de base calculée en B. La base de données utilisée dans cette figure est identical à celui représenté sur la figure 2A et 2C.
Figure 6. In vivo des mesures de glutamine aide capteur FLIPQ-TV3.0_1.5m. (A) Le rapport de venus/mTFP1 de cellules cos7 co-exprimant capteur FLIPQ-TV3.0_1.5m et ASCT2-mCherry. mCherry tag a été utilisé pour identifier les cellules exprimant le transporteur sans interférer les canaux d'émission mTFP1 ou venus. Les cellules ont été perfusées avec le tampon de tampon HEPES Hank (pH 7,35). Timepoints lorsque glutamine extracellulaire (rouge) et l'alanine (bleu) a été ajouté aux milieux de perfusion sont indiqués comme boîtes au-dessus du graphique. Les lignes continues et pointillées représentent les deux cellules individuelles mesurées dans la même expérience. (B) Les intensités de donateurs (mTFP1) et accepteur (venus) des canauxdans l'expérience représentée en (A). Les valeurs ont été corrigées pour photoblanchiment et normalisé à la ligne de base.
| Temps (min) | Solution A | Solution B | Solution C | Solution D | Solution E | Solution F | |||||||
| 0 | vanne sur | ||||||||||||
| 2 | OFF vanne | vanne sur | |||||||||||
| 4 | vanne sur | OFF vanne | |||||||||||
| 6 | OFF vanne | vanne sur | |||||||||||
| 8 | vanne sur | OFF vanne | 10 | OFF vanne | vanne sur | ||||||||
| 12 | vanne sur | OFF vanne | |||||||||||
| 14 | OFF vanne | vanne sur | |||||||||||
| 16 | vanne sur | OFF vanne | |||||||||||
| 18 | OFF vanne | vanne sur | |||||||||||
| 20 | vanne sur | OFF vanne | |||||||||||
| 22 | OFF vanne | vanne sur | |||||||||||
| 24 | vanne sur | OFF vanne | 26 | OFF vanne | vanne sur | ||||||||
| 28 | vanne sur | OFF vanne | |||||||||||
| 30 | OFF vanne | vanne sur | |||||||||||
| 32 | vanne sur | OFF vanne | |||||||||||
| 34 | OFF vanne |
. Tableau 1 Exemple de protocole de perfusion utilisé dans cette expérience Solution A:. 9,7 g de sel d'écheveaux (de H1387), 0,35 g de NaHCO3, 5,96 g d'HEPES à 1 litre pH ajusté à 7,35 avec NaOH Solution B:. Solution A + 0,04 mM Gin Solution C:.. Solution A + mM Gin 0,2 Solution D:. Solution A + 1 mM Gin Solution E:. Solution A + mM Gin 5 Solution F: Solution A + mM Ala 5
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Discussion
Le succès d'expériences d'imagerie dépend de quelques facteurs essentiels. L'un de ces facteurs est l'affinité de capteurs utilisés, comme discuté ci-dessus. Concentration absolue du substrat dans le compartiment sous-cellulaire d'intérêt, toutefois, est souvent inconnue. Par conséquent, nous vous recommandons d'essayer plusieurs capteurs ayant des affinités quinconce pour trouver celui qui fonctionne le mieux dans la condition expérimentale souhaitée. Par exemple, dans notre cas, nous avons transfecté des cellules COS7 avec des capteurs de glutamine avec 1.5μ, 100μ, 2m, et 8m (Figure 3 et données non montrées).
Un autre facteur important est le taux de protéines de capteur d'expression. Le niveau d'expression requis pour la détection varie entre, d'expériences, par exemple, quand un événement de courte durée (par exemple, le potentiel d'action unique) doit être observé un niveau d'expression plus élevé pourrait devenir nécessaire 19. Par conséquent, dans la plupart des cas, le niveau requis doit être empirically déterminée. Si la cible existe en très faible concentration dans la cellule, perturbation des processus endogènes en raison de cibler l'épuisement peut devenir un problème 20. Un essai indépendant pour évaluer cette possibilité, le cas échéant, est donc souhaitable. Dans les expériences présentées dans cet article, l'expression de la protéine entraînée par le promoteur CMV a été jugée suffisante. Dans les situations où des promoteurs ayant des activités beaucoup plus faibles doivent être utilisées, les ajustements pour augmenter les intensités de signal peuvent devenir nécessaires. Par exemple, un compromis entre l'intensité du signal et de photo-blanchiment au cours de l'exposition ont besoin d'être atteint. En plus de la plus longue durée d'exposition, en tant que tels facteurs comme la luminosité des fluorophores, les changements de l'intensité maximale du capteur, binning, et les sensibilités de la caméra CCD peut être modifiée afin d'améliorer l'intensité du signal.
Quand aucun changement de rapport n'est observée dans la condition expérimentale, même si les deux critères ci-dessus sont susceptibles d'être respectées, il est possible que l'homéostasie cellulaire pour le métabolite ou ion donné est suffisant pour masquer l'activité de transport solide (voir la section de résultat). Dans de tels cas, les lignées cellulaires avec différentes activités biochimiques pourraient être nécessaires comme arrière-plan pour détecter les activités des transporteurs 10, 21.
Bien que ces capteurs permettent de surveiller la dynamique de la concentration du substrat à une résolution spatio-temporelle beaucoup plus élevées que les méthodes basées-extraction, la détermination de la concentration absolue nécessite de nouvelles mesures expérimentales et de considérations. Habituellement, la concentration du substrat est calculée en supposant que l'affinité de la sonde, généralement calculée en titrant la protéine purifiée de la sonde, est inchangé lorsqu'il est exprimé dans la cellule. La concentration est calculée en utilisant l'isotherme unique liaison suivante,
[S] = K x d (r - r min) / (r </ Em> max - r)
[S] est la concentration en substrat, K d est la constante de dissociation déterminée in vitro, r est le rapport accepteur / donneur observé à un point de temps donné, R min est le rapport accepteur / donneur lorsque les capteurs sont sous la forme apo et r max est le rapport accepteur / donneur lorsque toutes les sondes sont liées au substrat. Rmin et Rmax sont influencées par les paramètres tels que la concentration de capteurs, des paramètres d'imagerie utilisées et la composition de la Milleu cellulaire, et par conséquent besoin d'être mesurée in situ . Pour déterminer r les valeurs min et max r, les conditions expérimentales qui permet la modification de la concentration du substrat intracellulaire devient nécessaire. Par exemple, les ionophores sélectifs (par exemple, pour Ionomycine Ca 2 +) 22 ou un réactif de perforation comme digitonin 23 peut être utilisé pour équilibrer la concentration du substrat avec la concentration intracellulaire externe.
Une des limites dans le type d'expériences démontrées dans ce protocole est le faible débit; l'analyse est limitée à l'analyse d'un métabolite dans un nombre relativement faible (<10) des cellules. Les progrès technologiques sont faits, cependant, pour surmonter ces limitations. Par exemple, avec l'avance en automatique, le criblage à haut contenu, il est maintenant possible d'utiliser des capteurs codés génétiquement dans des combinaisons avec petite molécule ou une bibliothèque ARNi; cellules exprimant un biocapteur peuvent être cultivées dans un format à haut débit (par exemple, 96 - ou 384 puits), puis les puits individuels peuvent être traités avec des produits chimiques ou siRNA et imagés. Ces expériences permettent l'identification des constructions d'ARNsi ou des produits chimiques qui perturbent le processus biologique qui peut être observée par le biocapteur 24 25. Une autre étude récente inclusion de l'avance passionnantedes le développement d'un écoulement microfluidique temps résolu cytomètre, qui permet la détection à haut débit de FRET changement de l'efficacité au niveau cellulaire 26. Ces progrès techniques faciliteront la découverte de nouveaux médicaments candidats et de nouveaux composants dans les processus biologiques.
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Disclosures
Il n'y a rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par NIH 1R21NS064412, subvention NSF 1052048 et Jeffress Memorial Trust subvention J-908.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted fluorescent microscope | Olympus | IX81F-3-5 | An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also be appropriate. |
| Excitation filter (mTFP1) | Omega Optical | 3RD450-460 | Band width 450-460 nm |
| Excitation filter (Venus) | Chroma | ET500/20 | Band width 490-510 nm |
| Emission filter (mTFP1) | Chroma | HQ495/30m | Band width 475-505 nm |
| Emission filter (Venus) | Chroma | ET535/30m | Band width 520-550 nm |
| Dichroic mirror (FRET channels) | Chroma | 470dcxr | Long pass, 470 nm cut off |
| Dichroic mirror (YFP channel) | Chroma | 89002bs | Passes 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm |
| mCherry filter set | Chroma | 49008 | Excitation 540-580 nm, long pass dichroic with 585 nm cut off, emission filter 595-695 nm |
| Light source | Olympus | U-LH100L-3-5 | LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended |
| CCD camera | Qimaging | Rolera-MGi EMCCD | |
| Apochromatic fluorescence objective | Olympus | ||
| Perfusion system, ValveBank II | AutoMate Scientific | [01-08] | Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work |
| Laminar-flow chambers | C&L Instruments | VC-MPC-TW | Other larminar-flow chambers would also work. |
| Chambered slide | Lab-Tek | 154534 | For open-chamber experiments |
| Perfusion pump | Thermo Scientific | 74-046-12131 | For open-chamber experiments |
| Software supporting ratiometric measurements | Intellegenent Imaging Innovation | Slidebook 5.5 | |
| Laminar flow biosafety cabinet | ESCO | LA-3A2 | |
| Isotemp CO2 Incubator | Thermo Scientific | 13-255-25 | |
| Dulbecco's MEM (DMEM) | Hyclone | SH30243.01 | |
| Cosmic calf serum | Hyclone | SH3008703 | |
| Penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I) | Invitrogen | 31985 | Used with Lipofectamine 2000 |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma | P4707 | |
| 25 mm circular glass cover slips | Thermo Scientific | 12-545-102 | In case VC-MPC-TW is used |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | Other transfection reagents can also be used. |
| Solution A (Hank's buffer) | 9.7 g HANK salt (Sigma H1387), 0.35 g NaHCO3, 5.96 g HEPES to 1 L, pH adjusted to 7.35 with NaOH | ||
| Solution B | Solution A + 0.04 mM Gln | ||
| Solution C | Solution A + 0.2 mM Gln | ||
| Solution D | Solution A + 1 mM Gln | ||
| Solution E | Solution A + 5 mM Gln | ||
| Solution F | Solution A + 5 mM Ala |
References
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