Rapid Identifikasjon av gramnegative bakterier fra blodkultur buljong Bruke MALDI-TOF massespektrometri
Summary
Anvendelsen av matriks-assistert laser desorpsjon / ionisering flukttiden (MALDI-TOF) massespektrometri (MS) direkte til blodkulturkraften påskynder identifisering av bakterier. Den presenterte fremgangsmåten er en hurtig og pålitelig metode for identifikasjon av gram-negative bakterier direkte fra blodkulturkraften.
Abstract
En viktig rolle for den kliniske mikrobiologiske laboratorier er å tilveiebringe rask identifisering av bakterier som forårsaker blodet infeksjon. Tradisjonell identifisering krever sub-kultur signalisert blodkultur buljong med identifikasjon bare tilgjengelig etter kolonier på fast agar har modnet. MALDI-TOF MS er en pålitelig og rask metode for identifisering av de fleste klinisk relevante bakterier ved påføring på kolonier på fast medium. Anvendelsen av MALDI-TOF MS direkte til blodkulturkraften er en attraktiv metode som den har potensial til å akselerere artsidentifikasjon av bakterier og forbedre kliniske behandlingen. Det er imidlertid et viktig problem å overvinne den pre-analyse fjerning av interfererende harpikser, proteiner og hemoglobinet inneholdt i blodkulturprøver som, dersom det ikke fjernes, forstyrre MS-spektra, og kan resultere i utilstrekkelig eller lave diskriminering identifikasjonspoeng. I tillegg er det nødvendig å konsentrere bakteriellebl.a. å utvikle spektra av tilstrekkelig kvalitet. Den presenterte fremgangsmåte beskriver konsentrasjon, rensing og utvinning av Gram-negative bakterier slik at for tidlig identifisering av bakterier fra en signalisert blodkulturkraften.
Introduction
Pasienter med blodbanen infeksjon (BSI) skyldes bakterier fortsette å ha høy i sykehus dødelighet, alt 6-48% 1. Leveransen av passende empirisk antibiotika fremmer overlevelse og i undergruppen av pasienter med alvorlig sepsis, hver time forsinkelse til passende behandling korrelerer til redusert overlevelse 2,3. Følgelig, et viktig mål for den kliniske laboratoriet er å raskt oppdage, identifisere og kommunisere tilstedeværelse av bakterier i blodkulturer å informere kliniske beslutninger. Det har blitt vist at mikrobiologisk laboratorium har størst innflytelse på antimikrobiell behandling på tidspunktet for rapportering av Gram flekken 4 og nylig, viste en observasjonsstudie som matrise-assistert laser desorpsjon / ionisering flygetid massespektrometri (MALDI-TOF MS) utføres direkte på blodkulturbuljonger påvirke forskrivning på over en tredjedel av BSI forårsaket av gramnegative bakterier fem.
<p class="Jove_content"> Den kommersielle utviklingen av MALDI-TOF MS har ført til en effektiv laboratorium verktøy for identifisering av mikroorganismer 6,7. Teknologien er nå godt etablert og har blitt integrert i mange laboratorier for rask og nøyaktig identifisering av mikroorganismer isolert på faste medier 6,8. Den direkte anvendelse av MALDI-TOF MS til blodkultur (BC) kjøttkraft som har signalisert "positive" for mikroorganismer appellerer til både klinikere og laboratorie ledere på grunn av potensialet for å få en tidligere identifisering av mikroorganismer til lave kostnader.Den kliniske nytten av direkte anvendelse av MALDI-TOF MS til blodkultur kjøttkraft har blitt begrenset av varierende følsomhet observert sammenlignet med standard fenotypiske kultur baserte metoder for identifisering, med rapporter om vellykket identifisering av gramnegative bakterier som strekker seg 47 til 98,9 9-11%. Variasjonen i følsomheten sannsynligvedrører BC buljong sammensetning, bakteriell begynnelseskonsentrasjon, variasjon i prøveprepareringsmetoder, så vel som noen av Gram-negative organismer som oppstår i studiepopulasjonene 9. Sammenlignet med disse andre publiserte protokoller metoden presentert her unngår bruk av etanol, ammonium-klorid, eller i tillegg (ikke-matriks) acetonitril. Som et resultat av den bakterielle pellet vil forbli levedyktige (til punktet for proteinutvinning) slik at for potensielle fenotypisk følsomhet testmetoder som skal påføres direkte på disse organismene i buljong. I tillegg har frem-metoden vist seg å være rimelig, effektiv og hurtig måte med bakteriell identifikasjon tilgjengelig innen 25 min til blodkulturGramFarging resultater med minimale "hands på" tids 12..
Denne metoden er en enkel in-house spin-lyse protokollen benytter maursyre utvinning påføres direkte på positive blodkulturbuljonger å identifisere Gram negativ bacteria med MALDI-TOF MS teknologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er viktig når du søker MALDI-TOF MS til blodkultur buljong at innlegget sentrifuge trinnene er utført med tilstrekkelig forsiktighet for ikke å blande de atskilte komponenter. Det er spesielt viktig å fjerne blodkultur bestanddeler og menneske cellulære proteiner, inkludert hemoglobin, som kan produsere pigger forstyrrer MALDI-TOF spektra.
Selv om MS produserer anbefaler kuttet av score på ≥ 2,0 for arter og ≥ 1,7 for slekten identifikasjon, har andre rapporter foreslått lave…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| BACTEC Plus Aerobic/F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442192 | |
| BACTEC Lytic/10 Anaerobic /F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442265 | |
| BACTEC Peds Plus Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442194 | |
| Vacutainer – Blood transfer device | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 364880 | Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury |
| Vacutainer SST 5.0mL, Advance plus | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 367954 | Serum separating tube |
| Syringe 10 mL | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 302143 | |
| Transfer pipette | Samco, USA | 222-20S | |
| Transfer pipette (fine tipped) | Samco, USA | 232-20S | |
| Microcentrifuge tube (2.0 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030.120.094 | |
| Sterile water (DNAse and RNAse free) | Life Technologies, Carlsbad, California, USA | 10977-015 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | F0507 | |
| Matrix solution | Bruker Daltonics, Bremen Germany | 285074 | 10 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid |
| Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS | Bruker Daltonics, Bremen Germany | Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software |
References
- Bearman, G. M., Wenzel, R. P. Bacteremias: a leading cause of death. Arch. Med. Res. 36 (6), 646-659 (2005).
- Leibovici, L., Shraga, I., Drucker, M., Konigsberger, H., Samra, Z., Pitlik, S. D. The benefit of appropriate empirical antibiotic treatment in patients with bloodstream infection. J. Intern. Med. 244 (5), 379-386 (1998).
- Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Crit. Care Med. 34 (6), 1589-1596 (2006).
- Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J. Clin. Microbiol. 41 (1), 495-497 (2003).
- Clerc, O., Prod’hom, G., Vogne, C., Bizzini, A., Calandra, T., Greub, G. Impact of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry on the Clinical Management of Patients With Gram-negative Bacteremia: A Prospective Observational Study. Clin. Infect. Dis. 56 (8), 1101-1107 (2013).
- Dekker, J. P., Branda, J. A. . MALDI-TOF Mass Spectrometry in the Clinical Microbiology Laboratory. Clinical Microbiology Newslette. 33 (12), 87-93 (2011).
- Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin. Infect. Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
- Neville, S. A., et al. Utility of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry following introduction for routine laboratory bacterial identification. J. Clin. Microbiol. 49 (8), 2980-2984 (2011).
- Schmidt, V., Jarosch, A., März, P., Sander, C., Vacata, V., Kalka-Moll, W. Rapid identification of bacteria in positive blood culture by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (3), 311-317 (2012).
- March-Rosselló, G. A., Muñoz-Moreno, M. F., de Urriés, M. C., Bratos-Pérez, M. A. A differential centrifugation protocol and validation criterion for enhancing mass spectrometry (MALDI-TOF) results in microbial identification using blood culture growth bottles. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 32 (5), 699-704 (2012).
- Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J. Clin. Microbiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).
- Gray, T. J., Thomas, L., Olma, T., Iredell, J. R., Chen, S. C. Rapid identification of Gram-negative organisms from blood culture bottles using a modified extraction method and MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 72 (2), 110-112 (2013).
- Hazelton, B. J., Thomas, L. C., Unver, T., Iredell, J. R. Rapid identification of Gram-positive pathogens and their resistance genes from positive blood culture broth using a multiplex tandem RT-PCR assay. J. Med. Microbiol. 62 (2), 223-2231 (2013).
- Saffert, R. T., Cunningham, S. A., Mandrekar, J., Patel, R. Comparison of three preparatory methods for detection of bacteremia by MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 73 (1), 21-26 (2012).
- Consoir, C., Lörch, D., Schneider, C. Direct identification of bacteria from charcoal-containing blood culture bottles using matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (10), 2843-2850 (2012).
- Martiny, D., Dediste, A., Vandenberg, O. Comparison of an in-house method and the commercial Sepsityper™ kit for bacterial identification directly from positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption-ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (9), 2269-2281 (2012).
- Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16 (11), 1631-1638 (2010).
- Novel, , et al. improved sample preparation for rapid, direct identification from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. J. Mol. Diagn. 13 (6), 701-706 (2011).
- Fothergill, A., Kasinathan, V., Hyman, J., Walsh, J., Drake, T., Wang, Y. F. Rapid Identification of Bacteria and Yeasts from Positive-Blood-Culture Bottles by Using a Lysis-Filtration Method and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrum Analysis with the SARAMIS Database. J. Clin. Microbiol. 51 (3), 805-809 (2013).
