Summary
Применение матрицы-лазерной десорбцией / время ионизации полета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии (MS) непосредственно к культуре крови бульона ускоряет идентификацию бактерий. Представленный метод является быстрым и надежным методом идентификации грамотрицательных бактерий непосредственно из культуры крови бульоне.
Abstract
Важную роль в клинической лаборатории микробиологии является обеспечение быстрой идентификации бактерий, вызывающих инфекции кровотока. Традиционный идентификация требует суб-культуру сигнальное культуры крови бульоне с идентификации доступных только после колоний на твердой агар созрели. MALDI-TOF MS является надежным, быстрый способ идентификации большинства клинически значимых бактерий при нанесении на колоний на твердых средах. Применение MALDI-TOF MS непосредственно к культуре крови бульона является привлекательным подход, поскольку он имеет потенциал для ускорения идентификации видов бактерий и улучшить клиническое управление. Тем не менее, важной проблемой для преодоления является удаление предварительно анализ интерферирующих смол, белков и гемоглобина, содержащихся в культуре образцов крови, которые, если их не удалить, мешают MS спектров и может привести к недостаточному или низкими оценками идентификации дискриминации. Кроме того, необходимо сосредоточиться BacterИ.А. развивать спектры достаточно высокого качества. Представленный метод описывает концентрацию, очищение, и извлечение грамотрицательных бактерий, позволяющих раннего выявления бактерий из сигнальном культуры крови бульоне.
Introduction
Пациенты с инфекции кровотока (BSI) из-за бактерий по-прежнему имеют высокую смертность в стационаре, начиная от 6-48% 1. Доставка соответствующего эмпирического антибиотика способствует выживанию и в подгруппе пациентов с тяжелым сепсисом, каждый час задержки в соответствующей терапии коррелирует со снижением выживаемости 2,3. Соответственно, одной из ключевых задач клинической лаборатории является быстрое обнаружения, идентификации и общайтесь присутствие бактерий в культурах крови сообщить клинические решения. Было показано, что микробиологическая лаборатория имеет наибольшее влияние на антимикробной терапии на момент отчетности Граму 4 и недавно, обсервационное исследование показало, что время матрица-активированная лазерная десорбция / ионизация массового полета спектрометрии (MALDI-TOF MS) выполняется непосредственно на культуры крови бульонов влиять назначения в более чем одной трети BSI, вызванного грамотрицательных бактерий 5.
6,7. Технология в настоящее время хорошо известны и была интегрирована в многих лабораториях для быстрого и точного определения микроорганизмов, выделенных на твердой среде 6,8. Прямое применение MALDI-TOF MS культуры крови (до н.э.) бульона, что дали понять, "позитивный" для микроорганизмов обращений в обоих клиницистов и лабораторного менеджеров из-за возможности получения более раннюю идентификацию микроорганизмов при низких затратах.
Клиническая полезность прямого применения MALDI-TOF MS к культуре крови бульона было ограничено широким диапазоном чувствительности наблюдаемых по сравнению со стандартным фенотипическая культуры на основе методов идентификации, с сообщениями о успешной идентификации грамотрицательных бактерий, начиная от 47-98.9 % 9-11. Изменение чувствительности всегоотносится к композиции бульона BC, начальной концентрации бактерий, вариации методов подготовки образцов, а также массив грамотрицательных организмов, встречающихся в популяции исследования 9. По сравнению с этими другими опубликованными протоколами метод, представленный здесь избегает использования этанола, хлорид аммония или дополнительного (не матрица) ацетонитрила. В результате бактериальный осадок не будет остаются жизнеспособными (до точки экстракции белка), позволяющий потенциальные методы испытаний фенотипический восприимчивость к быть нанесен непосредственно на этих организмов в бульоне. Кроме того, данный способ, как было показано, чтобы быть недорогой, надежный и быстрый с бактериальной идентификации доступных в пределах 25 мин из культуры крови грамотрицательных результатов окраски, с минимальными "руки на" время 12.
Этот метод представляет собой простой протокол в доме спин-лизис использования добычу муравьиной кислоты наносится непосредственно на положительных культуральных бульонах крови для выявления грамотрицательных бacteria с технологией MALDI-TOF MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Кровь Культура Отвары Отметить как «Позитивный»
- Снимите сигнализируется бутылку культуры кровь из непрерывного мониторинга инкубационного шкафа и поместить его в кабинете биологической безопасности. Примечание: Бутылки могут содержать опасные микроорганизмы и универсальные меры предосторожности должны быть выполнены. В связи с риском инфекционных аэрозолей в выборке, все процедуры отбора проб должны быть выполнены в шкафу с ламинарным потоком биобезопасности класса II.
2. Граму готов
- Подготовьте Граму от сигнальное культуры крови бульоне в соответствии с местными институциональными протоколов. Примечание: Когда грамотрицательные микроорганизмы идентифицируют по микроскопии культуру крови бульон обрабатывается в соответствии со следующим способом. Когда грамположительные организмы будут определены, альтернативный молекулярный метод таргетинга генетическую идентификацию и маркеры сопротивления применяется в бульон (не рассматриваются в этой статье) 13.
- Аккуратно перемешайте бутылку культуры крови путем обращения 2-3х.
- В шкафу биобезопасности приложить 10 мл шприц с передаточным безопасность крови устройства.
- Установите передачи крови устройства к бутылке культуры крови и вывести 5 мл бульона в шприц. Перенести атмосферный BC бульон в разделительную трубку сыворотки.
4. Концентрация крови культуральной жидкости
- Центрифуга, отделяющую трубку сыворотки в 1250 мкг в течение 15 мин, который удаляет большой объем эритроцитов.
- Аспирируйте и отбросить супернатант с помощью стерильной пипетки передачи быть осторожным, чтобы оставить примерно 1 мл светлого сгустка крови непосредственно над интерфейсом гель / жидкости. Примечание: аэробные бутылки показать четкое разделение эритроцитов к нижней части трубы с интерфейсом гель / жидкость появляется непрозрачный белый цвет. В противоположность этому, когдаприменяется к литической анаэробной культуры крови бульона интерфейс гель / жидкость выглядит как темно-красный цвет из-за лизированные компоненты эритроцитов остальные приостановлены в супернатанте.
5. Повторите центрифугирования вымыть шаги
- Аккуратно перемешайте последние 1 мл поглощающее покрытие жидкости над интерфейсом гель стерильной пипеткой, а затем передать весь объем в 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Центрифуга новую трубку при 288 мкг в течение 30 сек.
- Передача супернатант, используя пластиковые одноразовые 1 мл пипетки передачи в новую 1,5 мл микроцентрифужных трубки и выбросить трубку с шариком. Примечание: Очень важно на этом этапе, что осторожность, чтобы избежать передачу таблетки. Это особенно важно для образца обрабатываемой из анаэробного бутылки до н.э. как супернатант остается пигментированный осадок и не всегда хорошо видно.
6. Лизис остаточных клеток
7. Добыча бактериальных белков
- Аспирируйте и отбросить супернатант, опять же используя стремление с тонкой пипетки гарантируя, что столько жидкости, сколько возможно удаляется.
- Ресуспендируют осадок в 10 мкл муравьиной кислоты (70% об / об). Примечание: муравьиная кислота может влиять на тело, если оно вдыхании или если он вступает в контакт с кожей. При подготовке или манипулирования решения оно тecommended, что персонал использовать вытяжной шкаф в дополнение к индивидуальной защиты.
- Хорошо перемешать с помощью пипетки для обеспечения гомогенной ресуспендировали решение. Использование пипетки физически нарушить гранул могут быть необходимы для обеспечения более гомогенного раствора.
8. Подготовка MALDI-TOF Целевая плиты
- Привить чистую MALDI-TOF мишень с 2 мкл подготовленной суспензии в целевой точке. Подготовьте 3 целевые сайты для каждого образца, чтобы преодолеть случайные проблему не удалось читает.
- Разрешить визирная MALDI-TOF для просушки. Скорость сушки может быть увеличена путем размещения пластины на краю вытяжном шкафу, чтобы максимизировать воздушный поток через пластину.
- Накладываются друг на высушенную место с 1 мкл матричного раствора (10 мг / мл α-циано-4-гидроксикоричной кислоты (HCCA), 50% ацетонитрила, 2,5% трифторуксусной кислоты). Примечание: раствор Матрица может влиять на тело, если оно вдыхании или если он вступает в КонтаКТ с кожей. При подготовке или манипулирования решения рекомендуется персонал использовать вытяжной шкаф в дополнение к индивидуальной защиты.
- Разрешить целевой пластина MALDI-TOF сушить на краю вытяжном шкафу, как описано выше. Убедитесь, однородная подготовка наполняет каждого из целевых мест на плите.
9. Место MALDI-TOF Целевая плиты в масс-спектрометр
- Вставьте мишень MALDI-TOF в масс-спектрометра MALDI-TOF. Убедитесь, что пластина сидит на одном уровне с подпружиненных пластин. Примечание: не вставляйте мишень, пока все целевые места не станут сухими.
- Убедитесь, что резиновое уплотнение чистый пух, пыль и волосы, чтобы требуемые условия вакуумные может быть создан.
- Закройте этап крышку MALDI-TOF, а затем нажмите кнопку "в / из" на передней панели прибора. Крышка теперь будет блокировать и позволяют необходимости вакуум должен быть создан.
10. MALDI-TOF MS Spectra Приобретение
- Откройте MALDI Биотипирование и программное обеспечение FlexControl.
- В программном обеспечении Typing выбрать "новую классификацию" из выпадающего меню под названием "файл". Назовите проект и выберите "Новый". Выберите "Next", чтобы завершить установку в программном обеспечении Typing.
- В окне программы управления идентифицировать на экране графический подставки цели. Выделите MALDI-TOF целевые места, которые используются, перемещая курсор привитых пятен, удерживая левую кнопку мыши.
- Используйте правую кнопку мыши щелкните в любом месте на выбранных целевых позиций, а затем выберите "добавить аналитов" из выпадающего меню.
- Добавить культуры идентификационных крови, чтобы "ИД" колонке для каждой из целевых мест и нажмите кнопку "Далее", когда завершена.
- Выберите коммерческую "таксономии" Спектры базу данных и выберите "Далее". Примечание: Laboratories может использовать дополнительный в доме или коммерческих баз данных, чтобы увеличить количество эталонных спектров.
- Нажмите "Finish" и MALDI-TOF MS начнется генерации спектров. Примечание: настройки MALDI-TOF были в соответствии с настройками изготовител (линейный положительном режиме, 60 Гц частоты лазера, напряжение 20 кВ ускорение, 16,7 IS2 напряжение кВ, 170 нс задержки экстракции, и 2,000-20,137 дальности м / з).
- Если программное обеспечение MALDI управления не в состоянии генерировать пики, ручная приобретение спектров могут быть выполнены (метод не описан).
11. Сообщение Анализ Интерпретация MALDI-TOF MS Scores
- После того, как спектры приобретаются и анализ завершен, нажмите кнопку "+" рядом с видовой идентификации на программное обеспечение Typing расширить список идентификационный для каждой цели.
- Исследование 5 лучших идентификации, отметив, если топ-5 аналогичны. Дискордантные топ 5 родов с показателями ≥ 1,7 из той же целипятно поднял вопрос о возможности смешанных бульонов. Примечание: технология MALDI-TOF имеет плохую чувствительность для обнаружения смешанных бульонов. Например, когда бульон содержит смешанное видов высокий балл доверия могут быть идентифицированы в течение только одной из смешанных видов.
- Когда оценка ≥ 2.0 отличается самой высокой матча на целевой точке, сообщают видов.
- Когда высокий балл на целевом пятна ≥ 1,7, но <2,0, сообщают только роды. Если дополнительные критерии лучших 5 идентификаций согласованы, то представить видовом уровне.
12. Удаление MALDI-TOF Target плиты
- Когда все спектры являются полными нажмите кнопку "вход / выход" на машине MALDI-TOF.
- Откройте MALDI-TOF целевой пластины емкость и снимите мишень MALDI-TOF.
- При использовании многоразовой MALDI-TOF мишень, чистые все целевые места, используя спирт и хранить MALDI-TOF пластину при комнатной температуре, когда он будет чистым и сухим.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сгенерированный MALDI-TOF MS спектры по сравнению с интегрированной справочной базы данных спектров. Логарифмическая оценка присваивается за доверие матча между тестовой изолята и справочную базу данных изолирует, с рекомендацией счетом ≥ 1,7, необходимых для возможного выявления до уровня родов (рис. 1) и ≥ 2,0 для вероятного идентификации для определения видов (рис. 2). Сообщить видовом уровне при счете ≥ 1.7 и первые 5 идентификации подобраны с помощью программного обеспечения Typing согласуется (рис. 1) 12. Рисунок 3 демонстрирует результаты, когда посев крови бульон смешанных видов анализируется, в этом случае кишечной палочки и Serratia marcescens. Примечание топ-5 подобранные спектры несогласный. Ранее было показано, что смешанные роды будут определены только этим методом примерно в 30% смешанных бульонов 12. Важно знать, что со смешанным бульона это возможно для последовательного докладе одного вида со счетом высокая степень достоверности. Таблица 1 суммирует ранее опубликованные результаты проверки исследования этого метода, в котором 91,8% от monomicrobial бульонов, достигнутые оценка MALDI-TOF из> 1,7, со 100% и 97,0% согласованию с род и вид, соответственно 12.
Рисунок 1. MALDI-TOF MS генерируется спектры для кишечной палочки с логарифмической счетом 1,861. Справа первые 5 матчей, выявленные с помощью программного обеспечения Typing. Обратите внимание, что вид постоянно сообщали как кишечная палочка. Со счетом 1,861 и с топ-5 матчей будучи Е. палочка идентификация считается надежно видовом уровне 12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. MALDI-TOF MS генерируется спектры для синегнойной палочки с логарифмической счетом 2,216. Справа первые 5 матчей, выявленные с помощью программного обеспечения Typing. Обратите внимание, что вид постоянно сообщали как синегнойная палочка. С высокой счетом 2,216 идентификация считается надежным для видовом уровне идентификации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. MALDI-TOF MS генерируется спектры для смешанного культуральной жидкости крови, содержащей кишечной палочки и Serratia marcescens. Справа находятся первые 5 матчей, определенные Typing программного обеспечения, которое сообщает как кишечная палочка и Serratia marcescens в первые 5 согласованной спектров . Этот смешанный роды только определили примерно в одной трети смешанных культур бульонных 12. Улучшенные версии программного обеспечения в будущем могут улучшить обнаружение смешанных культур. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
0 "/>
Таблица 1. Данные поверки, сравнивающие MALDI-TOF MS осуществляется непосредственно по культуре крови бульоне с последующим фенотипической идентификации на субкультивировали колоний. Конкордата идентификация требуется массовый счет спектрометрии по культуре крови бульона ≥ 1.7. Эта таблица взята из предыдущей публикации 12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важно при применении MALDI-TOF MS в культуральной жидкости крови, что шаги сообщение центрифугирования выполняются с достаточной осторожностью, чтобы не ремикс разделенных компонентов. Особенно важно, чтобы удалить культуры крови составляющие и клеточных белков человека, включая гемоглобина, которые могут производить шипы, препятствующие со спектрами MALDI-TOF.
Хотя МС производит рекомендуем сократить партитуры ≥ 2.0 для видов и ≥ 1,7 для идентификации рода, другие отчеты предложили более низкие логарифмические баллы (диапазон ≥ 1,4 до ≥ 1.6) могут быть реализованы при применении к нашей эры бульона 10,12,14-18. Реализация более низкими баллами идентификации MS в клинических микробиологических лабораторий следует рассматривать только после соответствующих локальных нормативных и проверки процедур.
Иногда плохие спектры генерируются с помощью этого метода, которые либо не совпадают, или сообщаются с лой доверительные оценки. Выполнение двух или трех повторностях пятна для каждого изолята может уменьшить неудобства повторять эксперимент, когда одно пятно не удается. Нечасто, все повторяющиеся пятна не забьет достаточно для идентификации. Причиной плохого идентификации может быть связано с неполным наборов базы данных, или чаще, в результате низкой исходной концентрации бактерий в культуральной крови бульоне. В основе публикуемого валидации для предложенного метода счетом <1.7 была обнаружена у 8% клинических изолятов и было небольшое преобладание когда осуществляется на анаэробных бутылок культуры крови 12.
Технология MALDI-TOF MS не в состоянии отделить все клинически столкнулись грамотрицательных бактерий, даже когда изолирован на твердых средах. Например, E. палочка не будет отличать от видов Shigella и Salmonella роды не могут быть speciated. Как указано в результатах важно признать тыс.на при использовании MALDI-TOF непосредственно на культуры крови бульона чувствительность для обнаружения смешанных видов низка 11,12,18,19.
В целом, этот подход предлагает быстрый, недорогой и надежный способ идентификации более 90% грамотрицательных посев крови изолирует в пределах 25 мин сигнализации посев крови бульона.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BACTEC Plus Aerobic/F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442192 | |
| BACTEC Lytic/10 Anaerobic/F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442265 | |
| BACTEC Peds Plus Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442194 | |
| Vacutainer - Blood transfer device | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 364880 | Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury |
| Vacutainer SST 5.0 ml, Advance plus | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 367954 | Serum separating tube |
| Syringe 10 ml | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 302143 | |
| Transfer pipette | Samco, USA | 222-20S | |
| Transfer pipette (fine tipped) | Samco, USA | 232-20S | |
| Microcentrifuge tube (2.0 ml) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030.120.094 | |
| Sterile water (DNAse and RNAse free) | Life Technologies, Carlsbad, California, USA | 10977-015 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | F0507 | |
| Matrix solution | Bruker Daltonics, Bremen Germany | 285074 | 10 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid |
| Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS | Bruker Daltonics, Bremen Germany | Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software |
References
- Bearman, G. M., Wenzel, R. P. Bacteremias: a leading cause of death. Arch. Med. Res. 36 (6), 646-659 (2005).
- Leibovici, L., Shraga, I., Drucker, M., Konigsberger, H., Samra, Z., Pitlik, S. D. The benefit of appropriate empirical antibiotic treatment in patients with bloodstream infection. J. Intern. Med. 244 (5), 379-386 (1998).
- Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Crit. Care Med. 34 (6), 1589-1596 (2006).
- Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J. Clin. Microbiol. 41 (1), 495-497 (2003).
- Clerc, O., Prod'hom, G., Vogne, C., Bizzini, A., Calandra, T., Greub, G. Impact of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry on the Clinical Management of Patients With Gram-negative Bacteremia: A Prospective Observational Study. Clin. Infect. Dis. 56 (8), 1101-1107 (2013).
- Dekker, J. P., Branda, J. A. MALDI-TOF Mass Spectrometry in the Clinical Microbiology Laboratory. Clinical Microbiology Newslette. 33 (12), 87-93 (2011).
- Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin. Infect. Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
- Neville, S. A., et al. Utility of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry following introduction for routine laboratory bacterial identification. J. Clin. Microbiol. 49 (8), 2980-2984 (2011).
- Schmidt, V., Jarosch, A., März, P., Sander, C., Vacata, V., Kalka-Moll, W. Rapid identification of bacteria in positive blood culture by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (3), 311-317 (2012).
- March-Rosselló, G. A., Muñoz-Moreno, M. F., de Urriés, M. C., Bratos-Pérez, M. A. A differential centrifugation protocol and validation criterion for enhancing mass spectrometry (MALDI-TOF) results in microbial identification using blood culture growth bottles. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 32 (5), 699-704 (2012).
- Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J. Clin. Microbiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).
- Gray, T. J., Thomas, L., Olma, T., Iredell, J. R., Chen, S. C. Rapid identification of Gram-negative organisms from blood culture bottles using a modified extraction method and MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 72 (2), 110-112 (2013).
- Hazelton, B. J., Thomas, L. C., Unver, T., Iredell, J. R. Rapid identification of Gram-positive pathogens and their resistance genes from positive blood culture broth using a multiplex tandem RT-PCR assay. J. Med. Microbiol. 62 (2), 223-2231 (2013).
- Saffert, R. T., Cunningham, S. A., Mandrekar, J., Patel, R. Comparison of three preparatory methods for detection of bacteremia by MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 73 (1), 21-26 (2012).
- Consoir, C., Lörch, D., Schneider, C. Direct identification of bacteria from charcoal-containing blood culture bottles using matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (10), 2843-2850 (2012).
- Martiny, D., Dediste, A., Vandenberg, O. Comparison of an in-house method and the commercial Sepsityper™ kit for bacterial identification directly from positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption-ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (9), 2269-2281 (2012).
- Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16 (11), 1631-1638 (2010).
- Novel,, et al. improved sample preparation for rapid, direct identification from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. J. Mol. Diagn. 13 (6), 701-706 (2011).
- Fothergill, A., Kasinathan, V., Hyman, J., Walsh, J., Drake, T., Wang, Y. F. Rapid Identification of Bacteria and Yeasts from Positive-Blood-Culture Bottles by Using a Lysis-Filtration Method and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrum Analysis with the SARAMIS Database. J. Clin. Microbiol. 51 (3), 805-809 (2013).
