This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.
Primær neonatale rotte cardiomyocytes er nyttige i grunn in vitro kardiovaskulær forskning, fordi de lett kan isoleres i store mengder i en enkelt prosedyre. På grunn av fremskritt i teknologien mikroskop er det relativt enkelt å fange levende celle bilder med det formål å undersøke cellulære begivenheter i sann tid med minimal bekymring vedrørende fototoksisitet til cellene. Denne protokollen beskriver hvordan du kan ta levende celle timelapse bilder av primære rotte neonatal cardiomyocytes bruke en confocal spinnende disk mikroskop etter lentiviral og adenovirale transduksjon å modulere egenskaper i cellen. Anvendelsen av to forskjellige typer av virus som gjør det lettere å oppnå en passende transduksjon hastighet og ekspresjonsnivåer for to forskjellige gener. Godt fokusert levende celle bilder kan oppnås ved hjelp av mikroskop autofokussystem, som opprettholder stabile fokus i lange tidsperioder. Bruk av denne metoden, funksjoner av eksogent ingeniøred proteiner uttrykt i dyrkede primære celler kan bli analysert. I tillegg kan dette systemet bli brukt til å undersøke funksjonene av gener ved bruk av siRNAs samt av kjemiske modulatorer.
Primære rotte neonatal cardiomyocytes har lenge blitt brukt for å undersøke cardiomyocyte funksjon in vitro en. De er lett å isolere fra rotteunger av flere godt etablerte metoder 2-4. Den vanligste metoden benytter kollagenase eller trypsin å fordøye bindevev av hjertet før celleisolasjon. Forskere har også utviklet metoder for å isolere cardiomyocytes fra voksne gnagere 5-8 samt neonatale mus 9,10.
Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for isolering av kardiomyocytter fra neonatal rotteunger, anvendelse av en to-trinns enzymoppslutningsprosedyre. Trypsin blir først brukt O / N ved 4 ° C, og deretter renset kollagenase ved 37 ° C. Inkubasjon av hjertevevet med trypsin O / N ved 4 ° C reduserer de nødvendige skritt for å høste cellene i forhold til fremgangsmåter som benytter sekvens inkubasjoner i en varm enzymløsning 2. I tillegg, ved å bruke renset collagenase snarere enn råolje enzymer, kan mye til lot variasjon bli eliminert, og dermed gi bedre reproduserbarhet.
Funksjonelle studier av et bestemt protein benytter ofte et protein-ekspresjonssystem ved hjelp av en adenovirus 11 til 13 og / eller en lentivirus 14-16. [FORBEHOLD NOTE] Den virusproduksjonen og manipulasjon bør utføres i henhold til NIH retningslinjer.
Denne adenovirus ikke integreres i vertsgenomet. Den har en meget høy virkningsgrad for transduksjon i de fleste celletyper, blant delende celler og ikke-delende celler, så vel som primære celler og etablerte cellelinjer. Dette gjør adenovirus en pålitelig vektor for genekspresjon. Høye nivåer av proteinet kodet for av adenovirus vektor utvikle seg i løpet av 48 timer etter transduksjon, og de kan vare i flere uker, 17. Det er imidlertid en ulempe å bruke en adenovirus for proteinekspresjon at utviklingen av et rekombinant adenovirus er både komplisert og tidkrevende. Denne ulempen forklarer delvis hvorfor mange forskere har vært å snu til lentiviruses for rekombinant genuttrykk. I motsetning adenovirus konstruerer, genererer en lentiviral konstruere er raskt og enkelt. Selv lentiviruses generelt har lavere effektivitet ved transduksjon enn adenovirus, i begge dele og ikke-delende celler, de integreres i vertsgenomet. Følgelig, er ekspresjon av genet transduced mer stabil for lentiviruses enn for adeno-virus.
På grunn av teknologiske fremskritt innen mikroskopi, er det mye lettere å fange levende celle bilder av celler som uttrykker rekombinante proteiner. Dette gjelder selv ved video rente hastigheter på kjøpet. Dette gjør det mulig for undersøkeren for å bestemme hvor særlige endringer i proteinet av interesse funksjonelt påvirke cellen i sanntid. Confocal roterende disk mikroskop har flere viktige funksjoner som gjør det en optimal teknikk for live cell imaging 18,19. Den Yokogawa roterende plate tillater langt hurtigere bildeopptak, mens på samme tid å benytte langt mindre kraft enn laserpunkt skanning confocal mikroskoper. Begge disse spesielle funksjoner er på grunn av den roterende disk, som inneholder tallrike confocal hull gjennom hvilket laser passerer samtidig med prøvene. Under oppkjøpet, spinner selve disken raskt og kontinuerlig 18-20. Ved hjelp av autofokussystemet av mikroskopet er stabil vekt opprettholdes over lengre tid. Dette gjør det mulig for forskerne å ta godt fokusert levende celle bilder. Ervervede bildene spilles av som en filmfil. Bildene er analysert ved hjelp av bildeanalyse programvare som ImageJ 21,22, FIJI 23, eller andre kommersielt tilgjengelig programvare.
Primære cardiomyocytes isolert fra nyfødte rotter har lenge blitt brukt til å studere cardiomyocyte funksjoner in vitro. Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for isolering av neonatale kardiomyocytter fra rotteunger ved hjelp av en to-trinns enzymfordøyelsesmetode, først fordøyd med trypsin O / N ved 4 ° C og deretter renset collagenase. En fordel ved anvendelse av det rensede kollagenase trinn er at den samme grad av enzym blir brukt for alle isoleringer. Således, kvaliteten og mengden av isol…
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Dr. Alengo Nyamay’antu and Dr. Ilse Timmerman for their advices about lentiviral packaging. This work is supported by an American Heart Association Scientist Development Grant 10SDG4170137.
1 scissors for decapitation | WPI | 501749 | Autoclave before use |
1 fine scissors for heart isolation and chopping | WPI | 14393 | Autoclave before use |
2 fine forceps (Dumont No. 5) | Sigma | F6521 | Autoclave before use |
Three sterilized 10 cm plastic dishes | Sigma | CLS430165 | for hearts isolation |
3.5 cm glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C | for final plating of cardiomyocytes for future live cell imaging. micro-Dishes from ibidi are an acceptable alternative. |
3.5 cm glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-0.17-14-C | for TIRF or high resolution image |
Ethanol solution, 70 % (v/v) in water | Sigma | E7148 | |
2% gelatin | Sigma | G1393 | |
One sterilized 10 cm plastic dish | Sigma | CLS430165 | for trypsinization |
Aluminium foil | any brand | ||
parafilm | Sigma | P7543 | |
Two 10 cm plastic cell culture dish | Sigma | CLS430165 | for selection |
Auto pipette | Drummond Scientific | 4-000-300 | for trituration |
Cell counter | |||
Cellometer, automated cell counter | nexcelom | to check and count cells | |
Microscope and Hematocytometer | any brand | to check and count cells | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | invitrogen | 15250-061 | |
CO2 incubator | Sanyo | MCO-19AIC | |
incubating orbital shaker | Sigma | Z673129 | to shake heart tissue with collagenase at 37 C at 170-200 rpm |
10 mg/ml BrdU solution | BD Pharmingen | 550891 | |
DMEM, High Glucose | invitrogen | 41965039 | Mix medium as indicated in the protocol and warm before use |
MEM | invitrogen | 31095029 | Mix medium as indicated in the protocol and warm before use |
Fetal Bovine Serum | invitrogen | 26140079 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | invitrogen | 15140-122 | |
Section 2 lentiviral transduction | |||
three packaging plasmids | |||
pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
pMD2.G | Addgene | 12259 | |
The lentiviral transfer vector, pLVX-IRES-Puro | Clontech | 632183 | |
Opti-MEM (serum-free medium) | invitrogen | 31985070 | |
transfection reagent | |||
polyethyleneimine“Max”, (Mw 40,000) – High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25,000 in Free Base Form) | Polysciences | 24765-2 | It can be substituted with X-tremeGENE 9 from Roche |
X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | substitute for PEI as transfection reagent |
chloroquine | Sigma | C6628 | dissolve in water and make 100 mM stock solution. Inhibition of endosomal acidification can be achieved with 10-100 μM Chloroquine. |
HEPES | Sigma | H3375 | |
10 ml Luer-Lok syringe, sterilized | BD | 309604 | |
0.45 um filters | Sigma | F8677 | use only cellulose acetate or polyethersulfone (PES) (low protein binding) filters. Do not use nitrocellulose filters. Nitrocellulose binds surface proteins on the lentiviral envelope and destroys the virus. |
Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | dissolve in water and make 8mg/ml stock solution, then filter it to sterilize. |
polyethylene glicol 6000 | Sigma | 81260 | |
Sodium chloride | Sigma | S9888 | |
sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
Section 3 Adenoviral transduction | |||
HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
Some 10 cm cell culture dishes | Sigma | CLS430165 | |
96-Well Microplate with lid, flat-bottom, tissue culture, sterile | BD Falcon | 353072 | for titration |
Multichannel piptte, 10-100 ul, 8-channel | eppendorf | 3122 000.035 | |
Section 4 live cell imaging | |||
Spinning disk confocal microspopy | PerkinElmer | L7267000 | |
a temperature controlled chamber | any brand | to keep temperature at 37 C | |
a CO2 environmental system | any brand | optional to maintain CO2 concentration optimal | |
Medium | |||
CO2 Independent Medium, No Glutamine | invitrogen | 18045-054 | for long time time-lapse imaging |
DMEM, High Glucose, HEPES, no Phenol Red | invitrogen | 21063-029 | for long time time-lapse imaging |