Studere DNA Looping af Single-Molecule FRET

Summary

Denne undersøgelse viser en detaljeret eksperimentel fremgangsmåde til at måle looping dynamik dobbeltstrenget DNA under anvendelse af enkelt-molekyle Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). Protokollen beskriver også, hvordan at udtrække looping sandsynlighedsfordelingen kaldet J faktor.

Abstract

Bøjning af dobbeltstrenget DNA (dsDNA) er forbundet med mange vigtige biologiske processer såsom DNA-protein-genkendelse og DNA emballage, nukleosomer. Termodynamik dsDNA bøjning er blevet undersøgt af en metode kaldet ringslutning som beror på DNA-ligase til kovalent slutte korte klæbrige ender af et dsDNA. Dog kan ligatur effektivitet påvirkes af mange faktorer, som ikke er relateret til dsDNA looping såsom DNA-struktur omkring tiltrådte klæbrige ender, og ligase kan også påvirke den tilsyneladende looping sats gennem mekanismer såsom uspecifik binding. Her viser vi, hvordan man kan måle dsDNA looping kinetik uden ligase ved at afsløre forbigående DNA loop dannelse af FRET (fluorescensresonansenergioverførsel). dsDNA molekyler er konstrueret ved hjælp af en simpel PCR-baseret protokol med et FRET-par og en biotinlinkeren. Looping sandsynlighedsfordelingen kendt som J faktor ekstraheres fra looping sats og annealing hastighed mellem to frakoblingted klæbrige ender. Ved at teste to dsDNAs med forskellige iboende krumninger, viser vi, at J faktor er følsom over for den indre form af dsDNA.

Introduction

Forstå de mekaniske egenskaber af dsDNA er af fundamental betydning i Grundvidenskab og ingeniørmæssige anvendelser. Strukturen af ​​dsDNA er mere kompliceret end en straight spiralformet stige fordi roll, vippe, og snoningsvinkler mellem på hinanden følgende basepar kan variere med sekvens. Termiske fluktuationer kan forårsage dsDNA til at gennemgå de forskellige former for konformationelle udsving såsom bøjning, vridning og udspænding. Overgange såsom smeltepunkt og knæk kan også forekomme under ekstreme forhold.

Blandt disse bevægelser, dsDNA bøjning har det mest bemærkelsesværdige biologiske virkning ^1.. dsDNA bøjning er forbundet med genet undertrykkelse eller aktivering ved at bringe to fjerne steder tæt på hinanden. Det spiller også en vigtig rolle i DNA emballage i cellekernen eller et viralt capsid. Bøjningsdeformering af dsDNA kan visualiseres eksperimentelt ved høj opløsning mikroskopi (AFM ² og TEM ³⁾ og thermodynAmics og kinetik kan studeres ved looping assays, som kemisk linker sidestillede steder i dsDNA.

Et sådant assay er ligase-afhængig ringslutning ^4. I dette assay er dsDNA molekyler med "klæbrige" (kohæsive) ender cirkulariseret eller dimeriseret ved DNA-ligase. Ved at sammenligne satserne for cirkel og dimerdannelse, kan man opnå en effektiv molære koncentration af den ene ende af DNA i nærheden af ​​den anden ende, der er kendt som J faktor. Denne J faktor er dimensionsmæssigt svarer til sandsynlighedstætheden for at finde den ene ende af DNA ved en kort afstand fra den anden ende, og afspejler således fleksibiliteten af ​​DNA'et. Måling J som funktion af DNA længde afslører mange karakteristika om DNA mekanik herunder persistens længde ^4,5.

Ormen-lignende kæde (WLC) model er blevet bredt anerkendt som den kanoniske polymer model for dsDNA mekanik baseret på dens succes i forklaringlingen af kraft-udvidelse kurver opnået i DNA trække eksperimenter ^6, og korrekt forudsige J faktorer dsDNAs længere end 200 bp ^7. Men ved hjælp ringslutningen analyse på dsDNA molekyler så korte som 100 bp, Cloutier og Widom måles, J faktorer at være flere størrelsesordener højere end WLC model forudsigelse ^8. Et år senere, Du et al. produceret J faktorer i aftale med WLC model ved hjælp cycliseringen assay med lavere koncentrationer af ligase og tilskrives den afvigende resultat fra Widom gruppe høje ligase koncentrationer brugt ^9. Denne kontrovers eksemplificerer den uundgåelige påvirkning af DNA-ligase på ringslutningsprocedurer kinetik, når du bruger den konventionelle assay ^9. Desuden kan DNA-ligase også påvirke DNA-struktur og stivhed ved specifik binding ^10,11.

For at eliminere de tekniske bekymringer protein-afhængige looping analyser, vi for nylig vist en protein-fri looping assay baseret på Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) ^12.. I denne fremgangsmåde sløjfes konformationer påvises ved FRET mellem donoren og acceptoren fastgjort nær de klæbrige ender af et DNA-molekyle. En objektiv-typen total intern refleksion fluorescens mikroskop (TIRFM) bruges til at registrere baner af reversibel looping og unlooping begivenheder fra overfladeimmobiliseret enkelt DNA-molekyler i en længere periode. Denne metode har PCR-baseret samling af DNA-molekyler til at generere mismatch-fri DNA-molekyler, som er en afgørende forbedring i forhold til en lignende metode Vafabakhsh og Ha ^13. Den fælles-molekyle aspekt af denne protokol tillader måling af udlodninger i tillæg til ensemble gennemsnit, mens FRET aspekt gør det muligt at måle DNA looping dynamik gentagne gange fra det samme molekyle, selv i forhold, der kan forringe ligase aktivitet.

Den TIRFM setup er vist i figur 1.. En brugerdefineretDesignede modellen stadie er placeret over et Olympus IX61 mikroskop krop. 532 nm og 640 nm lasere indføres fra siden og reflekteres af bittesmå elliptiske spejle ¹⁴ i høj NA målet at opnå en kritisk indfaldsvinkel på dækglasset-vand-grænsefladen. Vi bemærker, at mere udbredt gennem-objektiv TIR hjælp dichroic spejle eller prisme-baserede TIR opsætninger kan også bruges til denne ansøgning FRET. Fluorescens billede dannet af mikroskopet er opdelt i donor-og acceptor-billeder af et dikroisk spejl. De bliver derefter igen afbildet på to halvdele af en EMCCD. Yderligere lang pass emission filtre anvendes til at reducere baggrundssignal.

Temperaturkontrol er vigtig for at erhverve reproducerbare kinetiske data. For temperaturkontrol er målet adskilt fra næsestykket af mikroskopet kroppen til at minimere varmeoverførsel, og vand fra en temperaturstyret chiller / varmelegeme cirkuleres gennem en messing krave, stramt passeromkring den indre metal under målet jakke. Denne opsætning er i stand til at opnå en robust temperaturkontrol på dækglasset overflade mellem 15 og 50 ° C (figur 2). I dette arbejde blev prøven holdes temperaturen ved 24 ° C.

Følgende protokol viser trin-for-trin procedure til DNA-konstruktion, estimering af DNA facon, single-molekyle eksperiment, og J-faktor beslutsomhed.

Protocol

1.. DsDNA Prøveforberedelse

1. Design globalt buede DNA ved at gentage en 10-mer sekvens. For eksempel, 5'-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) ₇ - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 'er et 186-bp buet DNA, hvor X er en tilfældig ekstra base og den sekvens, som flankerer den gentagne 10-mer sekvens er adapter sekvenser.
   BEMÆRK:. I dette eksempel to 10-merer med modsatte præferencer nukleosom dannelse baseret på en storstilet nukleosom belægning undersøgelse af Kaplan et al ¹⁵ blev valgt. Eftersom den spiralformede gentagelse af dsDNA er tæt på 10 bp, vil enhver netto afbøjning af den spiralformede akse 10-mer akkumulere til at producere en form som en cirkelbue (figur 3A). Eftersom den spiralformede periode er tættere på 10,5 bp, er en ekstra base, indsættes efter hver to gentagelser for at holde den krumme struktur plane som muligt. Disse sekvenser kortere end 200 bp kan bestilles fra companies at tilbyde gensyntese service. Det er praktisk at flankere disse sekvenser med fælles adapter sekvenser for de efterfølgende trin. Proceduren er skematiseret i figur 3B.
2. Udføre PCR med primer 1 (GTGCCAGCAACAGATAGC) og primer 2 (/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG). BEMÆRK: Primer 2 mærket med FRET-donor Cy3 ved 5'-enden. En typisk PCR opskrift og cykling protokol er præsenteret i tabel 1 og 2.
3. Udføre PCR med primer 3 (/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC) og primer 4 (CAACAACGAGCTCGAATG). BEMÆRK: Primer 3 er mærket med FRET-acceptor Cy5 gennem rygraden og biotin-linkeren ved 5'-enden. PCR opskrift og cykling protokollen er som ovenfor.
4. Oprense PCR-produkter ved hjælp af en PCR cleanup kit.
5. Bland Cy3-mærkede produkt og Cy5-mærkede produkt i en buffer til streng udveksling (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI pH 7,0, 1 mM EDTA) ved slutkoncentrationer på 0,4 &# 181 M og 0,1 uM, hhv. BEMÆRK: Den overskydende Cy3-DNA øger koncentrationen af ​​duplex transporterer både Cy3 og Cy5 som følge af streng udveksling.
6. Exchange strenge ved hjælp af inkubation ved 98,5 ° C i 2 minutter, gradvis afkøling til 5 ° C med stigningsgrad på 0,1 ° C / sek og inkubering ved 5   ° C i 2 timer.

2.. Gelelektroforese Detect dsDNA Krumningen

1. Hæld polyacrylamidgel ^16,17 ved blanding af acrylamid og bis-acrylamid opløsninger ved 29.2:0.8 forhold på 5% (w / v) i 1X Tris / borat / EDTA (TBE)-buffer ved pH 8,0. Bemærk: 10 ml gel indeholder: 1,217 ml 40% acrylamid, 0,667 ml 2% bis-acrylamid, 1 ml TBE 10X, 100 L ammoniumpersulfat (APS) 10%, 10 L TEMED, og resten er dH ₂ O. Fuld størkning af gelen tager omkring 30 minutter.
2. Indlæse polyacrylamidgel med DNA-prøver og DNA-stige i 1X loading buffer (5% glycerol, 0,03% (w / v) bromphenol blue) og køre gelen ved 5-8 V / cm ved 4 ° C i 45 minutter, eller indtil farvefronten nærmer sig enden af ​​gelen.
3. Farv gelen ved hjælp af 1X TBE-buffer, der indeholder 0,5 g / ml ethidiumbromid i 30 minutter. Identificere de DNA-bånd under UV-belysning. Sammenlign band positioner med størrelsen markør (100 bp DNA-stige) til at beregne de tilsyneladende størrelser af DNA-molekyler. BEMÆRK: Curved DNA bevæger sig generelt langsommere end lige DNA.

3.. Flow Cell Preparation

1. Bor 6-7 par huller langs to modstående kanter af en glasplade (3'' x 1'') ved hjælp af en boremaskine presse og diamant borekroner. Efter boring, gnid slide i strømmende vand for at fjerne synligt glas pulver. BEMÆRK: Hullerne tjener som perfusion ind-og udgange. Under boringen afkøling objektglasset med vand er vigtigt at forhindre revnedannelse.
2. Anbring dias oprejst i en glaskrukke og fyld den med vand. Sonikeres i 15 min og overføre dem til et andet glas dedicated for acetone rengøring. Fyld den med acetone og soniker i 15 min. Glassene skylles med ethanol under anvendelse af en spray flaske og derefter med vand. Læg dem i en krukke polypropylen, fyld den med 5 M kaliumhydroxid og soniker i 15 min. Endelig lydbehandle dias i vand i 15 min. Rengør dækglas (nr. 1, 24 x 40 mm) under anvendelse af den samme protokol. BEMÆRK: Rensede dias og dækglas kan opbevares i _dH2O til lang tids brug.
3. Bland 1 mg biotin-PEG-silan (MW 3400) med 80 mg mPEG-silan (MW 2000) i 340 l 0,1 M natriumbicarbonatopløsning. Bland godt og centrifugeres blandingen kortvarigt at slippe af bobler. BEMÆRK: funktionalisering af overfladen med polyethylenglycol (PEG) til at reducere uspecifik binding af DNA til overfladen.
4. Put 80 L af PEG løsningen på de enkelte dias og sænk forsigtigt et dækglas over det. Vent i 45 minutter. Adskil dækglasset fra slide med en pincet, skyl dem med rigelige mængder _dH2O og lad them tør i fri luft.
5. Placer tynde strimler af dobbelt-stick tape på tværs af dias til at danne kanaler. Juster et dækglas over det og fast trykke dækglasset mod diaset for at danne vandtætte kanaler. Brug 5 minutter epoxy at forsegle kanterne af kanalerne.

4.. Fremstilling af Trolox Solution

1. Put ~ 30 mg Trolox og 10 ml _dH2O i en kolbe og bruge en magnet omrørerstang at røre løsningen i fri luft i 18 timer.
2. Opløsningen filtreres under anvendelse af et 0,2 um filter, og pH justeres til 7 ved tilsætning ~ 6 ul 1 M Tris-base (pH 11). Bemærk: Trolox er en anti-blinke reagens, som er almindeligt anvendt i enkelt molekyle undersøgelser ^18. Den antifading virkning af Trolox kommer fra dens oxiderede derivat, som er til stede i delvist nedbrudt Trolox opløsning ^19. Hurtigt opløse Trolox i methanol eller høj pH Tris opløsning bør undgås på grund af ineffektiv oxidation.

5.. Single-molecule Imaging

1. Injicer 15 pi NeutrAvidin opløsning (0,5 mg / ml) ind i kanalen og vente 2 minutter før skylning med 100 pi af T50-buffer (10 mM Tris-HCI, 50 mM NaCl, pH 7,0).
2. Injicer 50 pi DNA-prøve (50-100 pM) i kanalen. Vent i 5 minutter og skyl ubundet DNA væk med 100 liter T50 buffer. BEMÆRK: DNA-molekyler specifikt vil binde sig til overfladen gennem NeutrAvidin-biotin interaktion.
3. Fyld kanal med imaging buffer, der indeholder et oxygenopfangning ^20, (100 mM PCD, 5 mM PCA, 1 mM Trolox, og 500 mM NaCl).
4. Indstil EMCCD i ramme-overførselstilstand at streame 2 x 2 binned billeder (256 x 256) til computeren ved 25 billeder per sekund.
5. Put fordybelse olie på mikroskop mål og løse flow celle mikroskopbordet hjælp prøvens klip. Grov-justere fokus ved at kigge på laseren refleksion mønster på væggen. Fin-justere fokus ved hjælp af live-visning af fluorescens imaldre på skærmen.
6. Begynd dataopsamling med 532 nm laseren. Check Live View, og juster fokus, hvis det er nødvendigt. Stop dataopsamling, når de fleste molekyler Lysblegede.
   BEMÆRK: I denne facilitet, er en lab-skriftlig C-program til at styre mikroskop og vise levende billeder på skærmen, som de er gemt på harddisken anvendes.

6.. Image Processing og Data Analysis

BEMÆRK: En serie af 256 x 256 billeder tid behandles af en Matlab kode til at generere enkelt-molekyle tid spor af Cy3 og Cy5 intensiteter. Sådan parres pixels mellem donor kanal og acceptor kanal af split-view billede, 6-7 par af Cy3 og Cy5 pletter, hvert par fra det samme molekyle jævnt fordelt over synsfeltet, manuelt plukkes, og en affin transformation beregnes ved hjælp af koordinaterne for disse pletter som ankerpunkter.

1. Ved hjælp af en Matlab script, se gennem alle enkelt-molekyle tid spor that vise flere overgange mellem lav og høj FRET signaler. Identificer de loopes og unlooped stater.
   BEMÆRK: FRET signal er defineret som Cy5 intensitet _(Ia) divideret med summen af Cy3 og Cy5 intensiteter _(Ia + I _d). Looped stat har værdi høj FRET mens unlooped stat har værdi lav FRET. Histogrammet af FRET signaler fra en enkelt molekyle er bimodalt fordelt på grund af reversibel looping og unlooping.
2. Find den tærskel, som adskiller de to fordelinger ved bestemmelse af skæringspunktet mellem de to monterede Gauss kurver.
3. Beregn FRET effektivitet og tildele loopes lande med høj FRET værdier og unlooped stater med lave FRET værdier.
4. Ved hjælp af en Matlab script, analysere det samlede antal af molekyler (N (t)), der sløjfes (ellernåede den høje FRET state) på forskellige tidspunkter bortfalder siden starten af ​​dataopsamling. BEMÆRK: Da en dsDNA molekyle kan starte i enhver kropsbygning af den unlooped tilstand ved starten af ​​dataopsamling, stigningstakten i loopes befolkning afspejler den gennemsnitlige looping rate gennemsnit over indledende konformationer. Uddrag looping sats k _løkke ved at montere N (t) med en eksponentiel funktion: Hvis stiger bifasisk, kan den være forsynet med en dobbelt eksponentiel funktion: I dette tilfælde er k _loop stammer fra: BEMÆRK: Teoretisk overlevelse sandsynlighed for, at en polymer ikke loopes til tiden t er ikke en enkelt eller dobbelt eksponentiel funktion ^12. Eksponentiel fittING bruges som et praktisk middel til at udtrække den gennemsnitlige looping tid.

7.. Bestemmelse af J Factor

BEMÆRK: J faktor repræsenterer, hvor koncentreret ene ende af et dsDNA er omkring den anden ende. Den kan bestemmes ved at interpolere koncentrationen af ​​et segment af DNA, der ville frembringe den samme reaktionshastighed med den anden ende segmentet den målte looping sats. Eksperimentelt er den ene ende segment immobiliseret på overfladen, og den anden ende segmentet indføres ved en vis koncentration ca. Hvis den målte annealing hastighed mellem de to ender er k _anneal, derefter J faktor ²¹ givet ved . Annealing hastighedskonstant (k _anneal = k _annealing / C) er uafhængig af sonden koncentration.

1. Flow 20 ul 30-50 pM biotin-Cy5 oligo (Primer 3) Jegnto en NeutrAvidin-belagt kanal. Skyl kanal med 100 ul T50 at vaske væk ubundne oligos.
2. Forbered imaging buffer som beskrevet i del 5 med tilføjelse af Cy3 oligo (Primer 2) i en endelig koncentration på 50 nM. Flow denne imaging buffer ind i kanalen.
3. Mens du holder 532 nm laser på, kortvarigt dreje 640 nm laseren på at identificere placeringer af overfladebundne Cy5 oligoer. Sluk for 640 nm laser og begynde at overvåge signalet FRET.
   BEMÆRK: Ved hybridisering af en Cy3 oligo til en overflade-bundne Cy5 oligo vil Cy5 fluorescens opstår FRET.
4. Ved hjælp af en Matlab script, analysere antallet af molekyler, der starter i den ubundne tilstand (lav Cy5 intensitet), men senere bliver til udglødet tilstand (høj Cy5 intensitet) som en funktion af tiden fra CY5 intensitet spor.
5. Plot dette antal annealede molekyler versus tid. Monter denne kurve med en enkelt eksponentiel funktion ( (k _anneal).
6. Gentag dette forsøg ved forskellige Cy3 oligo koncentrationer (60, 100, og 180 nm) for at bekræfte linearitet mellem annealing kurs og reaktantkoncentration. Uddrag den anden ordens annealing hastighedskonstant (k _udglødning ) Fra hældningen.
7. Beregn J faktor fra , Hvor k _løkke er looping opgjort i den samme buffer tilstand.

Representative Results

DNA-molekyler, der anvendes til looping studiet består af en duplex region med variabel sekvens og længde og enkelt-strengede udhæng, der supplerer hinanden. De udhæng, som er 7-basen lang, kan anneale til hinanden for at fange den løkke tilstand. Hver udhæng indeholder enten Cy3 eller Cy5, der er forbundet i DNA rygrad gennem amidit kemi. Den Cy5-overhæng er også forbundet med biotin-TEG (15-atom Tetra-Ethylenglycol spacer) for overfladevand immobilisering (se figur 4A). Alle disse modifikationer kan indarbejdes i dsDNA efter en PCR-baseret protokol (protokol 1 og figur 3B). Den valgte længde og sekvens af de udhæng fungerer godt til at fremkalde påviselige og reversible FRET begivenheder i normale eksperimentelle betingelser. Looping og unlooping kinetik DNA loop er følsomme over for den omgivende temperatur, og derfor er en temperaturregulator er afgørende for reproducerbarhed. En sådan controller kan let indarbejdes i mikroskop (figur 2).

Brug TIRFM, anti-korreleret udsving Cy3 (donor) og Cy5 (acceptor) signaler fra overfladeimmobiliseret dsDNA molekyler blev observeret (figur 4B). I loopes tilstand, afstanden mellem to farvestoffer er mindre end 5 nm, hvilket ville resultere i høj Cy5 signal og lav Cy3 signal på grund af høj effektivitet FRET (4A og 4C). Adskillige kontrol eksperimenter blev udført for at bevise, at den høje FRET stat repræsenterer loopes tilstand. Levetiden for den høje FRET tilstand med stigende overhæng længde, hvilket antyder, at den høje FRET tilstand stabiliseres ved baseparring mellem de to udhæng. Levetiden for den høje FRET tilstand også faldt med faldende DNA længde, hvilket er forventet, fordi loop fri energi stiger, når sløjfen bliver mindre ^12. Baseret på dette bevismateriale, høj og lav FRET staTES kan tildeles de loopes og unlooped stater, hhv.

For at teste effekten af ​​iboende krumning af dsDNA om looping blev to 186 bp dsDNAs med forskellige krumninger konstrueret, som er navngivet "straight" (S-DNA) og "buet" (C-DNA) baseret på deres krumning. Den gentagne 10-mer sekvens er TTTATCATCC for C-DNA og TGACAGCAAC for S-DNA. Den samlede krumning af hver af disse dsDNAs blev kontrolleret ved PAGE (polyacrylamidgelelektroforese), som er den mest udbredte metode til at estimere dsDNA krumning ^16,22. Figur 5 viser, at S-DNA løber ligeledes til DNA af samme størrelse i DNA-stige (sammenlign bane 1 og bane 2 i figur 5). På den anden side, C-DNA viser en større tilsyneladende størrelse i forhold til sin modpart i DNA-stige (~ 1.2 større end dens reelle størrelse, se bane 1 og bane 3). Denne observation tyder på, at C-DNA har en større iboende curvature end S-DNA.

Figur 6 viser et repræsentativt fluorescens-tidskurven fra C-DNA (figur 6A) og den tilsvarende FRET spor (figur 6B). Sammenlignet med S-DNA (figur 4B og 4C), C-DNA producerer mere high FRET begivenheder i samme tidsrum; C-DNA loops 4 gange hyppigere end S-DNA under samme erhvervelse tid (figur 7). Dette resultat viser, at iboende krumning af DNA i væsentlig grad kan påvirke looping dynamik.

At udtrække J faktor fra looping sats, er man nødt til at måle koncentrationen-uafhængige anden ordens hastighedskonstant for hybridisering mellem to løsrevne udhæng. En realisering af en sådan måling er vist i figur 8A. Hybridisering af Cy3 oligo til det immobiliserede Cy5 oligo producerer Cy5 intensitet byger grund til at ærgre sig. Fra flere measurements med forskellige Cy3-oligo-koncentrationer (se figur 8B), kan man uddrage i en statistisk robust måde. I vores forsøg blev annealing hastighedskonstanten mellem de to oligoer i 500 mM NaCl bestemt til at være 0,45 ± 0,04 x 10 ⁶ M ^-1 sek ^-1. J faktor blev beregnet ved at dividere looping sats (k _sløjfe) af anden ordens annealing hastighedskonstant (k _'anneal). Det var 61 ± 3 Nm for S-DNA og 265 ± 48 nM for C-DNA. J faktor for S-DNA (figur 9) er i rimelig overensstemmelse med tidligere målinger på tilsvarende længde ^7.

Figur 1.. Objective-typen TIRFM. A) Excitations optik. De 532 nm og 640 nm lasere er kollimeret separat til en similar diameter, fusioneret ind i den samme sti ved en dikroisk spejl, og fokuseret på et lille elliptisk spejl placeret under målet tilbage blænde. Det er vigtigt at benytte en akromatisk linse for at fokusere på at minimere kromatisk aberration. B) Mikroskop optik. Den laterale position af miniature spejl skal finjusteres, så den kan reflektere laserstrålen gennem mål, mens minimalt blokerer fluorescensemission. Derfor skal den monteres på en lille oversættelse fase. En anden spejlet på den modsatte side afspejler den udgående laser for at forhindre det i at komme ind afsløring optik. På billedplanet udenfor mikroskop kroppen, er en justerbar spalte placeret til at beskære billedet til halv størrelse af påvisning område af CCD. Fluorescensemission er delt af et dikroisk spejl i to kanaler og relæet linser danner det andet billede på CCD med 1:1 forstørrelse. En af de reflekterende spejle er drejet lidt til at opveje donorog acceptor billeder. En bandpass og en longpass filtre bruges til at reducere baggrunden i donor-og acceptor-kanaler, hhv. Klik her for at se større billede.

Figur 2.. Temperaturregulering for enkelt-molekyle eksperimenter. Den indstillede temperatur (T _s) er aflæsningen på den vandkøler / varmelegeme. Den faktiske temperatur (T _a) måles ved et termoelement i kontakt med oversiden af dækglasset på mikroskopet. Plottet af de faktiske temperaturer vs seks forskellige indstillede temperaturer (sorte firkanter) viser fremragende linearitet (grøn stiplet linie). Robustheden af ​​controlleren er vist med tilfældige målinger foretaget på senere tidspunkter (røde diamanter). De indsatte er billedet af temperaturen controlling enhed og objektive i deres endelige samling. Den røde linje repræsenterer en hældning på sammenhold. Klik her for at se større billede.

Figur 3.. DNA Design. A) Buet dsDNA. En 10-mer-dsDNA er repræsenteret som et buet slangesegment, og de to enkeltstrenge som stiplede linjer. Den spiralformede akse noget 10-mer-DNA ikke er helt lige, og dermed hver sammenkædning af en sådan 10-mer vil føre til gradvis hældning af den spiralformede akse i samme retning. Denne virkning kan udnyttes til at generere en plan, superspiraldensitet molekyle. B) PCR-baseret fremstilling af dsDNA. Enkeltstrengede DNA er vist som en vandret linje. Deres egentlige krumning er ikke afbildet her. Den centrale segment i repræsenterer sort unik del af DNA-fragmentet. Vist i lysegrå er adapter sekvenser fælles for alle DNA'er anvendt i denne undersøgelse. Primer 1 og 4 annealer til de forreste og bageste adaptere, hhv. Primer 2 mærket med Cy3 ved 5'-enden. Primer 3 har en biotin tag på 5'-enden og et internt forbundet Cy5. De lyseblå regioner Primer 2 og 3 indeholder komplementære sekvenser, der fungerer som klæbrige ender. Enten et plasmid eller genomisk DNA, som indeholder sekvensen af ​​interesse er anvendt som template i to separate PCR-reaktioner. Cy3-mærket dsDNA er fremstillet under anvendelse af primer 1 og 2 og biotinyleret Cy5-mærket DNA fremstilles under anvendelse af primer 3 og 4.. Disse to PCR-produkter opvarmes og afkøles sammen streng udveksling. Dannes Fire forskellige dsDNAs, hvoraf kun den ene indeholder Cy3, Cy5 og biotin. Klik her for at se større billede.

altid ">
Figur 4.. Forsøgsordning. A) Single-molekyle FRET eksperiment. dsDNA molekyler mærket med Cy3 (grøn) på den ene side og Cy5 (rød) på den anden side er immobiliseret på PEG (polyethylenglycol)-overflade. Vendbar looping og unlooping af dsDNAs resulterer i høj FRET (loopes) og lav FRET (unlooped) stater, hhv. B) En typisk enkelt-molekyle tid spor af donor (grøn) og acceptor (rød) fluorescensintensiteter. De høje og lave FRET stater er identificeret som loopes og unlooped stater, hhv. Også indikeret er den første looping tid, der bruges til at beregne looping sats. (Indsat) Zoom-i figur viser anti-korrelation af Cy3 og Cy5 intensiteter. C) En tid spor af FRET effektivitet beregnes fra donor og acceptor intensitet spor i B. Figur 4B og Trong> 4C blev taget fra lige DNA (S-DNA), som beskrevet i hovedteksten. Den lave FRET på 0,2 skyldes direkte excitation af Cy5 ved 532 nm laser, og bekræfter tilstedeværelsen af fluorescens aktiv Cy5. Klik her for at se større billede.

Figur 5. Polyacrylamidgelelektroforese (29.2:0.8 acrylamid / bis-acrylamid, 5% i TBE-buffer, pH 8,0) af syntetiske DNA'er. Fra venstre til højre, banerne indeholder 1 kb markør, det 186 bp Lige DNA og 186 bp Curved DNA. Dette tal er delvist tilpasset fra en tidligere publikation ¹² med tilladelse. Klik her for at se større billede.

_content "fo: keep-together.within-side =" altid ">
Fig. 6. Repræsentative spor fra den buede DNA (C-DNA) (A) og dens tilsvarende spor FRET (B). Sammenligning af intensiteten og FRET spor mellem S-DNA (figur 4B og 4C) og C-DNA (figur 6A og 6B) viser tydeligt, at den buede DNA loops hyppigere end lige DNA i den samme buffer tilstand. (Indsat) Zoom-i figur viser anti-korrelation af Cy3 og Cy5 intensiteter. Klik her for at se større billede.

Fig. 7. Den gennemsnitlige første løkke tidspunkter af lige og buede DNA'er. Hver time blev ekstraheret fra ~ 500 molekyler i 5 forskellige områder. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen af middelværdien (SEM) beregnet ud fra 3 uafhængige forsøg. Klik her for at se større billede.

Figur 8.. Bestemmelse annealing hastighedskonstanten fra oligo hybridisering. A) Skematisk billede af målingen annealing sats. Cy5 primeren er immobiliseret på overfladen, og Cy3 primer er til stede ved 50 til 180 nM. Binding og uforpligtende af Cy3 primeren ved 50 nM forekomme reversibelt og føre til påviselige acceptor bursts, som er vist i det indsatte. B) Annealing rate afhænger lineært af koncentrationen af fri oligo. Hældningen af linjen repræsenterer anden ordens annealing hastighedskonstant (k _'annea l). Klik her for at se større billede.

Figur 9 J faktorer i det lige og buede DNA beregnet i nM J faktor blev bestemt baseret på to measurables:... Looping satsen for dsDNA loop og annealing hastighedskonstanten af de frie komplementære udhæng Klik her for at se større billede .

otte: 25px, bredde: 351px; "> Vand

Component	Volume/50 pi reaktion	Slutkoncentration
36 pi
5x Phusion buffer	10 pi	1x
10 mM dNTP'er	1 pi	200 uM hver
Forward primer (25 uM)	1 pi	0,5 uM
Reverse primer (25 uM)	1 pi	0,5 uM
Phusion varm start DNA-polymerase (2 U / ul)	0,5 pi	0,02 U / pl
Skabelon-DNA	0,5 pi	~ 1 ng

Tabel 1. PCR. Protokollen er optimeret til Phusion DNA-polymerase. Varer bør tilføjes i denne rækkefølge.

"> 95 ° C

Cycle skridt	Temperatur	Tid	Antallet af cyklusser
Indledende denaturering	30 sek	1
Denaturering	95 ° C	5 sek	30
Annealing	60 ° C	10 sek
Forlængelse	72 ° C	15 sec / kb
Final udvidelse	72 ° C	5 min	1
	4 & #176; C	hold

Tabel 2.. PCR cykling instruktioner. Er Annealingstemperaturen bestemmes på grundlag af smeltende temperaturer af primere. Forlængelsestiden er optimeret til Phusion DNA-polymerase.

Discussion

En simpel enkelt molekyle assay baseret på FRET blev anvendt til at studere looping kinetik DNA'er af forskellige iboende former. Buede DNA kan fremstilles ved at gentage en 10-mer sekvens i fase med spiralformede periode på 10,5 bp og deres krumninger kan estimeres ved hjælp af PAGE. Disse dsDNAs er designet med klæbrige ender til at tillade forbigående loop stabilisering. Vi ekstraheret looping sats fra den eksponentielle stigning i antallet af løkkeformede molekyler over tid. Annealing hastighedskonstant mellem de frakoblede klæbrige endesegmenter anvendes til at bestemme koncentrationen ækvivalent af looping sandsynlighedsfordeling, der er kendt som J faktor.

I en ligase-baserede DNA cyklisering assay, måling af sandsynlighed DNA lukning er følsom over for ligase koncentration, og J faktor kan overvurderes, hvis ligase er overdreven ^9. Ikke-specifik binding af DNA-ligase til DNA kan også påvirke looping ^10. Endvidere Ligase aktivitet afhænger af salt og henfalder over tid. Det er således svært at studere DNA looping i forhold suboptimale for ligase aktivitet. I modsætning hertil en FRET-baserede looping analysen er fri fra alle disse bekymringer.

Vores forsøgsprotokol svarer til, at af Vafabakhsh og Ha ¹³ undtagen to vigtige aspekter, som er værd at diskutere. Vafabakhsh og Ha ¹³ bygget deres dsDNA molekyler ved ligering flere syntetiske oligoer. Selvom fejlen (indsættelse, sletning eller substitution) pr nukleotid i oligo syntese er ubetydelig (f 0,181%) ²³ fraktionen af utilsigtede DNA-sekvenser stiger lineært med oligo længde. Derfor kan en 100-bp duplex prøve udarbejdet af denne protokol indeholde op til ~ 33% ufuldkomne dobbelthuse, som kan resultere i højere looping rate ^24. I sammenligning vores protokol anvender polymerasekædereaktion (PCR) til at syntetisere de dsDNA molekyler, som har en meget højere kvalitet end DNA chemosynthesis ^25. Ifølge producentens oplysninger ville high-fidelity-polymerase vi brugte generere en korrekt 100 bp DNA-molekyle på 99,8% sandsynlighed efter 30 cykler af PCR-amplifikation.

En anden vigtig forskel mellem de to undersøgelser er overfladen immobilisering ordningen. I vores undersøgelse, er DNA-molekyler bundet til overfladen gennem deres ender, mens der i protokollen af Vafabakhsh og Ha ^13, er de bundet via en intern base. Det blev forudsagt, at baseret på alene indespærring effekt, kan en internt pinned dsDNA loop oftere end en gratis dsDNA, op til en faktor fem, afhængigt af placeringen af interne pinning ^26.. Derfor, når måle J faktor som en funktion af DNA kontur længde, kan intern pinning introducere uventet variation. Det er også muligt, at den modificerede base med linkeren har en svagere baseparring kapacitet, hvilket kan resultere i en højere looping sats. Men despite disse åbenbare forskelle, de to protokoller producere lignende J faktorer ved 100 bp (~ 3 nM vs ~ 2 nM).

Denne FRET-baserede looping assay lover godt for at studere en bred vifte af fænomener i relation til dsDNA looping inklusive effekten af uoverensstemmelser, rifter eller huller på dsDNA looping ^27, effekten af DNA-bindende proteiner på dsDNA looping, og temperaturafhængighed dsDNA fleksibilitet. Disse emner vil være vanskelig at behandle med det konventionelle ligase-baserede ringslutning. FRET-baserede looping analyse kan også anvendes til at måle J faktor vs kontur længde, som er den standard forhold til at teste polymer modeller. Men den protokol, vi præsenteres her er ikke velegnet til at studere dublering af dsDNA kortere end 100 bp. Under denne længde, dsDNA looping bliver meget langsom, og derfor målte rate vil blive påvirket af andre utilsigtede processer såsom fotoblegning. Man kan accelerere de tilsyneladende looping kinetik af osning høj koncentration salt ([Na ^+]> 500 mm), men fysiologiske relevans af en sådan måling bliver tvivlsom. Derfor vil undersøgelse af dsDNA bøjning længdeskalaer under 100 bp gavn af en fremgangsmåde vinkelret på ringslutnings-baserede assays.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Small DNA FRAG Extract Kit-100PR	VWR	97060-558
Acrylamide 40% solution 500 ml	VWR	97064-522
Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 ml	VWR	97063-948
GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1,000 bp	Fermentas	SM0241
Mini Vertical PAGE System	VWR	89032-300
Syringe filter 0.2 μm CS50	VWR	A2666
Trolox	Sigma-Aldrich	238813-1G	triplet state quencher
Protocatechuic acid (PCA)	Sigma-Aldrich	08992-50MG	oxygen scavenging system
Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD)	Sigma-Aldrich	P8279-25UN	oxygen scavenging system
mPEG-silane, MW 2,000 1 g	Laysan Bio	MPEG-SIL-2000-1g
Biotin-PEG-Silane, MW 3,400	Laysan Bio	Biotin-PEG-SIL-3400-1g
Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein	Invitrogen	A2666
Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	F-540L
Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit	IBI Scientific	IB47020
Premium plain glass microscope slides	Fisher Scientific	12-544-1
VWR micro cover glass, rectangular, no. 1	VWR	48404-456
Fisher Scientific Isotemp 1006S Recirculating Chiller/Heater	Fisher Scientific		temperature control
Objective Cooling Collar	Bioptechs	150303	temperature control
KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage	Semprex	KMI53
High Performance DPSS Laser 532 nm 50 mW	Edmund optics	NT66-968	Cy3 excitation
CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30 mW, Fiber, FC/APC Connector	Coherent	1139604	Cy5 excitation
650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter	Semrock	FF650-Di01-25x36	splitting dichroic
LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, & 543.5 nm lasers, 25 mm	Semrock	LM01-552-25	combining dichroic
Brightline Fluorescence Filter 593/40	Semrock	FF01-593/40-25	Cy3 emission filter
635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm	Semrock	BLP01-635R-25	Cy5 emission filter
EMCCD iXon+	Andor Technology	DU-897E-CS0-#BV
IX51 inverted microscope frame	Olympus
Objective UApo N 100X/1.49 Oil TIRF	Olympus
Immersion oil type-F for fluorescence microscopy	Olympus	IMMOIL-F30CC
2 mm Diameter 45° Rod Lens Aluminum Coated	Edmund optics	54-092	miniature mirror
1/4" Travel Single-Axis Translation Stage	Thorlabs	MS-1	translation of miniature mirror
Ø1" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm	Thorlabs	AC254-200-A	focusing lens
Adjustable Mechanical Slit	Thorlabs	VA100
Dielectric Mirror	Thorlabs	BB1-E02
Ø1" Achromatic Doublet, f = 100 mm	Thorlabs	AC254-100-A	relay lens
Lens Mount for Ø1" Optics	Thorlabs	LMR1
Dichroic Filter Mount	Thorlabs	FFM1
Fixed Cage Cube Platform	Thorlabs	B3C
Kinematic Mount for Ø1" Optics	Thorlabs	KM100
N-BK7 Plano-Convex Lens, Ø1", f = 40 mm	Thorlabs	LA1422-A	collimating lens
N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 15 mm	Thorlabs	LA1222-A	telescope lens
N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 150 mm	Thorlabs	LA1433-A	telescope lens