Summary
通过hemispleen注射技术进行肝转移的临床前，小鼠模型。
Abstract
许多小鼠模型已经被开发，研究人类癌症和推进癌症治疗和发展的理解。在这里，临床前，鼠胰腺肿瘤肝转移通过hemispleen注入同系小鼠胰腺肿瘤细胞的模型描述。此模型模拟了许多在转移性疾病患者的肝的临床情况。小鼠持续开发在肝脏允许调查的转移过程中，实验性治疗试验和肿瘤免疫学研究转移。
Introduction
胰腺导管腺癌（PDA）是癌症相关死亡的美国1的第四大死因。的5年生存率为治疗转移性PDA是2-12％1。虽然辅助和新辅助化疗对胰腺癌的效果更明显今天比以往任何时候都仍然是一个迫切需要新的治疗方法。
新颖的治疗学的发展就必须可靠的临床前动物模型。虽然皮下肿瘤模型是直接使用，缺点包括这些肿瘤无法转移和模仿肿瘤进展和微环境见于人类癌症。基因工程化的模型，如遗传工程小鼠含有的Kras和p53敲除中的致癌基因突变（保护团模型）2与KPC模型与YFP谱系示踪（在PKCY模型）3允许在immunocompete天然存在的肿瘤的研究NT小鼠。此外，在肿瘤微环境是不变的和更类似于见于人类肿瘤进展。不幸的是，肿瘤发展的时间是这些模型中，这使得它难以研究实验性疗法中的变量。此外，这些小鼠回交需要显著大量的时间和资金承诺，这并不总是可行的。最后，异种移植小鼠的PDA机型必要免疫功能低下小鼠，改变或缺失的肿瘤微环境。其结果是，在这些临床前模型中显示出实验性疗法的功效通常是在人类临床试验4不能再现。
这hemisplenectomy小鼠模型利用PANC02肿瘤细胞，这是一种高度致瘤性，甲基胆蒽诱导的胰腺肿瘤细胞的C57BL / 6小鼠5,6衍生线。此外，其他的PDA小鼠细胞系从KPC麦克风衍生E可在该模型中使用。 Schulick 等人以前开发的hemisplenectomy技术，创造了结肠癌转移7同系小鼠模型。这hemisplenectomy模型（ 图1），提供一致和平等的肿瘤接种在免疫小鼠贷款本身的新的治疗药物7-10调查。
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Protocol
所有的动物实验符合美国约翰霍普金斯大学的动物护理和使用委员会的指导方针，与动物保持在按照协会的评估和实验室服务的认证（AAALAC）的指导方针。在无菌条件下在手术室中的经历至少每小时15空气交换进行的外科手术过程。所有的仪器是由高压灭菌之前的程序，并再次用70％乙醇中的每个小鼠的过程中，灭菌。预计无法生存的外科手术所有小鼠都CO 2条件下实施安乐死3分钟后颈椎脱位，同时仍然在麻醉状态下。
1，细胞的制备
- 悬浮培养的PANC02细胞在磷酸盐缓冲盐水中以2×10 7个细胞/毫升，并保持在冰上。
2，鼠标准备
- 管理氯胺酮E（100毫克/千克），甲苯噻嗪（10毫克/千克）混合腹腔，以8-12周龄的C57BL / 6雌性小鼠，分次给药。
- 请检查脚趾捏撤回反射被废除，以确保鼠标完全麻醉。
- 施用额外剂量的氯胺酮（100毫克/千克）和赛拉嗪（10毫克/千克），为需要充分麻醉小鼠混合。
- 申请Puralube兽医软膏对小鼠的眼中，以防止干燥时的小鼠是在麻醉状态下。
- 剃鼠的手术区，以避免伤口污染。
- 制备型切口，用70％乙醇中，然后碘的左肋下区域。
- 放置在腹部外科手术铺巾，以保持无菌。
3，剖腹
- 让左肋下切口线与通过皮肤，并通过使用手术刀腹膜左耳。
- 通过应用同步数字p表示通过切口脾沿切口的头部和尾部方面ressure。
- 找到脾血管在脾脏的下结束。
- 将两个豪华中型结扎夹在脾，请小心操作以免损坏脾血管的脾极的中心划分脾。
- 将脾脏的上极放回腹腔，以避免污染。
4，肿瘤注射液
- 拟定150μL磷酸盐缓冲液成26国祥5/8“注射器。
- 拟定100微升PANC02（2×10 6细胞）到相同的注射器的注射过程中保持在任何时候都将注射器在一个直立的位置。
- 浸在70％的乙醇溶液中的针。针被浸在70％的乙醇，以确保无菌。
- 慢慢注入的细胞进入暴露hemispleen是肯定的注射器保持直立在任何时候。该syrin的伞GE应该在任何时候都通过脾胶囊可以观察到，以避免脾下注入细胞。脾血管美白应在注射后观察。
- 提高脾脏和应用脾下一个媒介地平线剪辑闭塞脾血管。
- 将一个小的地平线剪辑胰腺和脾脏血管的最前端部分。
- 通过削减上述地平线短片结扎从hemispleen胰腺和脾脏血管。
- 放置在其'侧的鼠标和灌溉的切口，用蒸馏水。
5，关腹和麻醉恢复期
- 关闭腹膜有4-0跑步针。
- 适用于两到三个皮肤剪辑，关闭皮肤切口。
- 管理0.1毫克/公斤丁丙诺啡或5-10毫克/千克卡洛芬皮下，以减轻手术后疼痛。
- 把鼠标放在一个加热垫的REC安理，直到移动和鼠标演示了普通的呼吸方式。动物从外科手术完全恢复后只返回到其他动物的公司。
6，剖检检查和肝脏的收获
- 介于30至60天以下的手术，小鼠开始显示转移的临床症状和需要安乐死。转移性疾病的需要人道安乐死的症状包括腹部增大，腹水的发展。通过吸入CO 2安乐死的小鼠。
- 下面吸入，进行颈椎脱位。
- 后的动物已被确定为无响应，使一个切口穿过腹膜，露出用剪刀腹部。
- 使用镊子和剪刀，轻轻地割肝出了腹部。
- 放置在OCT化合物中的肝和闪光灯用液氮速冻。储存在肝脏-80℃。可替代地，实况r的在RT被固定在16％中性福尔马林缓冲液中24小时和石蜡包埋。
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Representative Results
PANC02肿瘤细胞注射到hemispleen（ 图1）在小鼠的100％形式肝转移，而如果正确地进行技术肺和腹膜转移都没有观察到。这种技术已在一百多个，独立的实验中使用PANC02细胞的小鼠被执行，并重复地，所有未治疗的小鼠死于与以下的hemisplenectomy过程（ 图2）30到60天之间的肝转移。要获取未处理和处理组之间的统计学意义，还需要每组10只。但是，这个数字将相对于所使用的细胞系和治疗方案而有所不同。当PANC02细胞在该模型中使用的多个肝转移可以在尸检时（ 图3）被观察到。
KPC肿瘤细胞，这是从具有组织特异性的Kras，p53蛋白的转基因小鼠衍生的同系胰腺肿瘤细胞系敲入突变11，也可以在此模型中使用。使用这些细胞的结果相似肝转移（ 图4）。然而，当使用不同的细胞系评估肝脏转移的形成，细胞注射的数量应该滴定，直至所有未治疗的小鼠发展肝转移。 PANC02细胞可被用作阳性对照，以确保正确地进行手术。重要的是，肝脏转移和生存的形成的程度可以根据所使用的细胞株，在一个实验而变化，同时，所有未经处理的小鼠发展肝转移，在一个类似的负担，并从这些转移可重复的时间很短的时间内死亡。因此，在使用这种技术时的肿瘤负荷超声正常化是没有必要的。
未能诱导肝脏转移导致正常出现肝经尸检，这可能表明未正确执行的程序。然而，失败或Delayed形成转移可能会导致以下与阻抑或抑制转移性生长的治疗（ 图5）处理，致使长时间存活。因此，该模型可用于评价对肿瘤生长和转移的形成的各种治疗剂的效果。
因为它在技术上是可行的超声来评估肝脏，小动物超声（ 图6）12可以用来评估在体内形成转移的肝脏。此外，转移瘤的形成，可以进一步通过组织病理学以下剖检（ 图7）检测。
图1原理图中hemisplenectomy模型，它是用来创建胰腺癌肝转移与PANC02肿瘤细胞。
经历PANC02 hemisplenectomy在第0天之后，图2代表C57BL / 6小鼠的存活率示于的Kaplan-Meier曲线组（n = 10）。小鼠在此模型注射PANC02肿瘤细胞将在30和60天后的之间的所有死过程如果防肿瘤治疗不管理。
图3：总检查以下注射PANC02细胞进入hemispleen肝脏揭示肝转移（籼稻泰德箭头）。 请点击这里查看该图的放大版本。
图4。总体检hemispleen注射KPC肿瘤细胞下面进入hemispleen肝脏发现肝转移（黑色箭头），用来取代正常肝实质（白色箭头）。 请点击这里查看该图的放大版本。
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图5大体检查以下有效的干预治疗肝脏。 请点击这里查看该图的放大版本。
图6：使用VEVO 660小动物超声对小鼠的大转移病灶在肝脏（黑色箭头）以下的hemisplenectomy程序肝脏超声检查。 请点击这里查看该图的放大版本。
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图7所PANC02细胞在hemisplenectomy模式形成石蜡包埋肝转移的H＆E染色。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
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Discussion
胰腺癌转移这个临床前鼠模型中，以通过一个hemispleen注射技术肝脏是反映了许多的转移性疾病患者的肝的临床和免疫学条件描述的第一模型。这种模式提供了比其他小鼠模型中的几个优点。首先，与胰腺癌的转基因模型中，只有30％的小鼠发生转移至肝脏和转移瘤的形成时机是相当的变量，该模型提供始终如一获得转移的优势，肝脏中的小鼠100％以统一的时间，使研究人员能够研究转移性疾病在这个设置。此外，这款机型保留了天真hemispleen，以便在可重复的模型外周血免疫分析。此外，在不存在的抗肿瘤治疗，小鼠免于肿瘤进展死在根据初始肿瘤负荷一致的时间点，和存活是一致的从一个试验到下一个。最后，这种模式有多种应用，包括肝转移13，肿瘤免疫学10，和实验治疗试验9的研究。
该技术的关键步骤是将细胞悬浮液制备中，肿瘤细胞注射后，放置在地平线片段，并放置在皮肤片段。以确保成功的手术和避免的结果的电位偏移，过程的关键步骤如下修改可能是必要的。首先，细胞悬浮液的制备过程中，是非常重要的细胞的单个悬浮获得与注入hemispleen。肿瘤细胞的轻微结块会阻塞脾血管及手术过程中导致过早死亡。这可避免在declumping剂重悬细胞，并通过制备前立即注射每个注射器用于注射。此外，对制备过程中注射器，是非常重要的细胞不与磷酸盐缓冲盐水冲洗混合。这可以通过首先在制订磷酸盐缓冲盐水，然后非常缓慢地制订细胞，以避免混合，并保持注射器在任何时候都处于直立位置来实现。第二，在肿瘤细胞注射步骤中，将注射器的斜角应在任何时候都通过脾胶囊观察到，以避免脾下注入细胞。的脾脏和血管增白应在注射后可观察到的，这表明肿瘤细胞已被成功地注入脾脏。在年轻小鼠脾脏较小，这可能是必要的，以注入比风险冲洗的细胞从脾泄漏的一个较小的体积。如果有泄漏之嫌，奠定了老鼠站在他们一边，并缝合小鼠，以帮助去除可能在注射步骤已泄露的任何细胞前洗净，用蒸馏水脾。如果不消除这些细胞会导致在肿瘤的生长，在注射部位，这可能导致死亡之前实现充分转移。三是地平线短片的hemispleen下配售是确保没有出血撤除hemispleen重要。额外的地平线剪辑可用于阻塞血管的必要。该技术的最后关键步骤是安置在皮肤片段。如果将小鼠被以下为生存，可能需要缝合的小鼠的皮肤，而不是使用皮肤片段。偶尔，皮肤剪辑将事先充分愈合的皮肤伤口中，这可能使小鼠易感脱落。皮肤缝合，从腹膜中分离出来，将避免这个问题。
虽然这种技术是非常宝贵的学习转移过程和转移性疾病，这种模式有一些限制。第一，这种模式的再生性质使得它优于转基因和orthotopiC型为研究转移过程与肿瘤微环境的转移部位。然而，由于该模型的性质，只有最后的步骤中转移的过程中，外渗和定植，可以研究。这限制了该模型的实用程序，用于学习的充分转移过程，并且不允许进行调查，该刺激肿瘤细胞的血管内的信号。第二，虽然通过保留一半hemispleen的保留在这些小鼠中完全免疫功能是重要的，在肝中的淋巴细胞的分析包括淋巴细胞与正常肝脏以及从肿瘤微环境，这可能导致在一个偏置表示淋巴细胞肿瘤微环境中的真实免疫状态。这导致更广泛转移到肝脏，使用更侵袭性的肿瘤细胞系可以帮助克服了模型的这一限制。此外，如果转移是在尸检可视化，它可能是possiblE要由正常肝解剖的转移和仅分析在进一步规避这个问题的转移瘤中发现的淋巴细胞。总之，尽管这种模式有几个缺点，它也提供了许多优于其他车型，因此应该使用时学习转移性疾病的肝脏补充这些型号。
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Disclosures
作者没有利益冲突的相关披露。
Acknowledgments
KF和KO是共同第一作者以及堪萨斯州
这项工作是由AHPBA奖学金（堪萨斯州），美国国立卫生研究院K23 CA148964-01（LZ），医学的约翰霍普金斯学院的临床科学家奖（LZ），Viragh基金会和跳过Viragh胰腺癌症中心的约翰霍普金斯大学（EMJ，部分支持LZ），全国胰腺基金会（LZ），在莱夫科夫斯基家族基金会（LZ），美国国立癌症研究所孢子在胃肠道癌症P50 CA062924（EMJ，LZ），在Lustgarten基金会（LZ）和索尔高盛胰腺癌中心补助（KS ，BHE，LZ）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture media and components | will vary depending on cell line | ||
| Phosphate Buffered Saline | Gibco by Life Technologies | 10010-023 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| Curved Operating Scissor | Roboz Surgical Store | RS-6835 | |
| Micro Dissecting Graefe Forceps | Roboz Surgical Store | RS-5130 | |
| Needle holder (regular) | World Precision Instruments, Inc | ||
| 3-0 or 4-0 suture | courtesy of dept of surgery, Johns Hopkins | ||
| Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, small, angled | Teleflex | 137085 | |
| Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, medium, angled | Teleflex | 237115 | |
| Weck Horizon medium ligating clips | Teleflex | 002200 | |
| Weck Horizon small ligating clips | Teleflex | 001200 | |
| Syringe, 1 cc, tb syringe, 3/8" slip tip | Becton Dickinson | 309625 | |
| Syringe, 1 cc, tb syringe, 5/8" slip tip | Becton Dickinson | 309597 | |
| 9 mm Autoclip Applier | Mikron | 427630 | |
| 9 mm Autoclip | Becton Dickinson | 427631 | |
| Heating pad | Sunbeam | CAT93 | |
| 70% Ethanol | sold by numerous vendors | ||
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | 22395DD | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma | X1251 |
References
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