Summary
الاضطرابات الأيضية هي من بين واحدة من الأمراض الأكثر شيوعا لدى البشر. نموذج كائن لين العريكة وراثيا D. ويمكن استخدام البطن لتحديد الجينات الرواية التي تنظم عملية التمثيل الغذائي. وتصف هذه الورقة طريقة بسيطة نسبيا والتي تسمح بدراسة معدل الأيض في الذباب عن طريق قياس إنتاجها CO 2.
Abstract
الاضطرابات الأيضية هي مشكلة متكررة تؤثر على صحة الإنسان. وبالتالي، فهم الآليات التي تنظم عملية التمثيل الغذائي هي مهمة علمية حاسمة. المرض يسبب العديد من الجينات في البشر لها نديد ذبابة، مما يجعل ذبابة الفاكهة نموذجا جيدا لدراسة مسارات الإشارات المشاركة في تطوير اضطرابات مختلفة. بالإضافة إلى ذلك، فإن قابلية الإستطراق من ذبابة الفاكهة يبسط شاشات الجينية للمساعدة في تحديد الأهداف العلاجية الرواية التي قد تنظم عملية التمثيل الغذائي. من أجل أداء هذه الشاشة طريقة بسيطة وسريعة لتحديد التغيرات في التمثيل الغذائي للدولة من الذباب هو ضروري. بشكل عام، وإنتاج ثاني أكسيد الكربون هو مؤشر جيد للأكسدة الركيزة والطاقة النفقات وتوفير المعلومات حول حالة الأيض. في هذا البروتوكول ونحن نقدم طريقة بسيطة لقياس CO 2 الناتج من الذباب. هذه التقنية يمكن أن يحتمل أن تكون مساعدة في تحديد الاضطرابات الوراثية التي تؤثر على معدل الأيض.
Introduction
دورة البيوكيميائية كريب يولد ATP من خلال الأكسدة من خلات المستمدة من الكربوهيدرات والدهون والبروتينات وإنتاج ثاني أكسيد الكربون 2. في ذبابة الفاكهة، ويرتبط O 2 مدخلات مباشرة مع CO 2 الناتج ويعكس مستوى التمثيل الغذائي 1. وبالتالي، فقد استخدمت بنجاح قياس CO 2 الناتج في الدراسات المتعلقة بالشيخوخة والتمثيل الغذائي 2-5. هنا مختبرنا وتعديل الاجهزة التجريبية المصممة مسبقا، مما يتيح قياس ثاني أكسيد الكربون 2 في إنتاج ما يصل إلى ثمانية عشر عينات دون الحاجة إلى أي معدات متخصصة. الآخرين، ونحن قد استخدمت سابقا هذه الطريقة لإظهار الفروق في معدلات الأيض في الذباب التي تعاني من نقص في البروتين العضلي ضمور المرتبطة بها، Dystroglycan (المديرية العامة) 6-8.
O 2 تستخدم لالأيض المؤكسدة يتم تحويلها إلى CO 2، الذي طرد في حاوية نفايات في الجهاز التنفسي. والإنشاءاتيوصف نشوئها قياس التنفس المصنوعة يدويا التي تسمح لتحديد معدل استهلاك O 2. يتم وضع الذباب في حاوية مغلقة مع المادة التي تمتص ثاني أكسيد الكربون طرد 2، والقضاء بكفاءة من المرحلة الغازية. ويتم قياس التغير في حجم الغاز (الضغط انخفض) عن تشريد السائل في الزجاج الشعرية التي تعلق على مقياس التنفس مغلقة.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة مع الآخرين هو التكلفة. وقد تقاس الدراسات السابقة CO 2 الانتاج بمقدار ذبابة الفاكهة باستخدام محللات الغاز وأنظمة قياس التنفس تقدما من الناحية التقنية 1،9. على الرغم من المعدات أكثر تعقيدا، وحساسية الطريقة الموصوفة هنا يشبه القيم ذكرت (الجدول 1). بالإضافة إلى ذلك، قد استخدمت العديد من المجموعات الأخرى من الاختلافات هذه التقنية لتحديد معدلات التمثيل الغذائي النسبي في ذبابة الفاكهة 4-6. لذلك، هذا الاختبار يمكن استخدامها لتوليد reliabجنيه، والبيانات ذات الصلة استنساخه لذبابة الفاكهة الأيض دون شراء المعدات المتخصصة التي يمكن أن تكون في أي مختبر الإعداد، ويمكن استخدامها لأغراض تعليمية.
بشكل عام، تقنيات مقبولة لتحديد التمثيل الغذائي للكائن الحي هو قياس CO 2 تنتج، وO 2 المستهلكة، أو كليهما 3،4،9. رغم ذلك، فإنه يمكن الافتراض أن ما يعادل واحد من O 2 يولد ما يعادل واحد من ثاني أكسيد الكربون 2، ونسبة دقيقة من CO 2 إنشاؤها تعتمد على الركيزة الأيض تستخدم 10. وبالتالي، لتحديد بدقة معدل الأيض في وحدات الطاقة فمن الضروري قياس كل من O 2 CO 2 المستهلكة والمنتجة. ونتيجة لهذا، فإن الطريقة الموصوفة هنا هو ذات الصلة على وجه التحديد لمقارنة الاختلافات في CO 2 الإنتاج بين الحيوانات وليس قيمة مطلقة. أسلوبنا يدمج متعددة الحيوان CO 2 الإنتاج على مدى فترة من تيمه (1-2 ساعة) وبالتالي إرجاع متوسط النشاط الحيوانات. إذا كان هناك سبب للاعتقاد بأن حيوانات التجارب هي أقل نشاطا من الحيوانات سيطرة القياس يمكن أن تعكس مستويات مختلفة من النشاط وليس بالضرورة عملية التمثيل الغذائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد قياس التنفس
- قطع 1،000 ميكرولتر ماصة مع شفرة حلاقة للسماح بإدخال الشعرية micropipette 50 ميكرولتر، في محاولة للحصول على طرف ماصة كما مستقيم ممكن.
- وضع قطعة من المادة العازلة في ماصة ودفعها لأسفل في تلميح ماصة.
- إضافة كمية صغيرة من ثاني أكسيد الكربون 2 ماصة واحتوائه من قبل القطعة الثانية من الرغوة.
- تطبيق الغراء في المكان الذي يتم إدراج micropipette في تلميح ماصة.
- ترك بين عشية وضحاها مقياس التنفس للسماح للالغراء لتجف.
ويرد التخطيطي لمقياس التنفس في الشكل 1A.
2. إعداد غرفة القياس
- إعداد الحل غرفة عن طريق خلط الماء مع يوزين في نسبة من شأنها أن تؤدي في التلوين مرئية.
- صب الحل يوزين / الماء إلى الغرفة.
- تسمية أحد جانبي الغرفة مع مقياس سنتيمتر.
معشوقة = "jove_title"> 3. وضع الذباب في قياس التنفس
- تسمية قياس التنفس الفردية مع علامة.
- تخدير الذباب باستخدام طريقة بديلة لثاني 2 وتضع 3-5 الذباب من النمط الجيني المطلوب داخل كل مقياس التنفس.
- ختم قياس التنفس بإحكام في أعلى باستخدام المعجون دائنية.
- تسمح الذباب للتعافي من التخدير لحوالي 15 دقيقة.
- إعداد مقياس التنفس واحد دون الذباب، والتي سيتم استخدامها كعنصر التحكم في الغلاف الجوي.
4. المسرحية التجربة
- شنق قياس التنفس في غرفة عن طريق ربط 1.5 مل إيبندورف حامل أنبوب مفتوح على أعلى وأسفل في الجزء العلوي من القاعة.
- إدراج قياس التنفس مع طرف micropipette إلى أسفل داخل غرفة السماح للتلميح إلى يغرق في حل الملونة.
- إضافة الفازلين بين الغطاء غطاء وغرفة لتوفير العزلة أقوى من درجة الحرارة والضغط fluctuations.
- إغلاق الغطاء والسماح للنظام للتوازن لمدة 15 دقيقة.
- التقاط صورة من الغرفة والتأكد من أن مستوى السائل داخل كل micropipette مرئيا وذلك هو المقياس (انظر المثال هو موضح في الشكل 1B).
- بعد 1-2 ساعة، التقاط صورة أخرى.
- عندما يتم الانتهاء من التجربة، وإزالة الذباب من قياس التنفس وتزن إذا رغبت أو نقلها إلى القارورة إذا لزم الأمر أبعد من ذلك.
5. تحليل النتائج
- اكتسبت المفتوحة الصور باستخدام برنامج ImageJ 11.
- باستخدام مقياس في كل صورة، ضبط التحجيم بكسل في البرنامج.
- قياس المسافة (Δd) أن السائل سافر من بقعة إشارة العزم في الصور التي التقطت في بداية (D1) ونهاية التجربة (D2). ويرد مثال التخطيطي في الشكل 1C.
- حساب كمية إنتاج CO 2 (ميكرولتر / ساعة / ذبابة) مع الصيغة:
R = نصف قطر أنبوب micropipette في سم
Δd = المسافة انتقلت السائل حتى في micropipette من عينات اختبار قياس بالسنتيمتر
انتقلت Δc = المسافة السائل حتى في micropipette من العينة السيطرة السلبية (بدون الذباب)
n = عدد من الذباب المستخدمة
ح = ساعات
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
من أجل إظهار أن أسلوب حساس قمنا بقياس CO 2 الإنتاج من النوع البري (ولاية أوريغون R) الذباب الذكور في 18، 25، و 29 درجة مئوية والذباب متحولة عن المديرية العامة. وأثيرت الذباب عند 25 درجة مئوية ومن ثم تحولت إلى درجة حرارة تجريبية لمدة 5 أيام قبل القياس. كما هو متوقع لهذا النوع ectothermic، تنتج كمية من ثاني أكسيد الكربون 2 زيادة مع درجة الحرارة (الشكل 2). قمنا في الماضي أظهرت أن اتباع نظام غذائي السكر الحر يقلل من معدل التمثيل الغذائي في كل من النوع البري والمديرية العامة متحولة الذباب 7. فقدان المديرية العامة يؤدي إلى زيادة مستويات الأيض (الشكل 2).
الشكل 1. الإعداد لقياس ثاني أكسيد الكربون 2 الإنتاج في الذباب. تظهر A. تخطيطي روقال انه بناء على مقياس التنفس الفردية. B. صورة للغرفة خلال قياس أول أكسيد الكربون 2. رسائل بمناسبة موقف قياس التنفس. الأرقام تشير الرأسي في نطاق سنتيمترات. C. تخطيطي يبين التغييرات أثناء التجربة. الخط الأخضر يشير إلى بقعة المرجعية (D1) والأزرق يشير إلى موقف نهائي من السائل بعد 2 ساعة (D2). Δd هي المسافة قد سافر السائل في micropipette.
الشكل 2. يرتبط CO 2 الإنتاج في الذباب عند درجات حرارة مختلفة والمسوخ في المديرية العامة للإسكان درجة الحرارة بشكل إيجابي مع CO 2 الإنتاج في ذبابة الفاكهة، وزيادة كبيرة في المديرية العامة للالمسوخ. أشرطة الخطأ تشير SEM من أربع تجارب فردية، ص ≤ 0 ***.01.
| (ميكرولتر / يطير خ ساعة) | المعدات المستخدمة | مرجع |
| 2-3 CO 2 | CO 2 محلل الغاز | (فان Voorhies، Khazaeli وآخرون 2004) |
| 4.68 ± 1.04 CO 2 | CO 2 نظام قياس التنفس | (Khazaeli، فان Voorhies وآخرون 2005) |
| 2،9-6،2 O 2 | قياس التنفس المصممة بالمثل | (هولبرت، كلانسي وآخرون 2004) |
| 2.20 ± 0.15 O 2 | وصف قياس التنفس هنا اليدوية | (Kucherenko، مارون وآخرون 2011) |
| * القيم الجدول هي من الدراسات أن يقدم تقريرا القيم العددية من الذباب قياسها 25 ° C |
الجدول 1. مقارنةتقنيات مختلفة تستخدم لقياس ثاني أكسيد الكربون 2 الانتاج بمقدار ذبابة الفاكهة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول، ونحن تصف طريقة غير مكلفة ويمكن الاعتماد عليها لقياس ثاني أكسيد الكربون 2 الإنتاج في الذباب. وجدنا أن هذه التجربة هي سهلة وسريعة لإجراء ويولد بيانات قابلة للتكرار وهذا هو في اتفاق مع دراسات أخرى 1، 6، 9. بروتوكول المذكورة هنا يمكن تعديلها بسهولة لتناسب الميزانية المتاحة ومواد أي المختبر. بناء مقياس التنفس كل فرد يمكن تكييفها طالما بقيت في غرفة محكمة الإغلاق. ومع ذلك، فإن أطول، أرق بال micropipettes تقديم المزيد من الدقة على مدى أقصر منها. استخدام الغرفة الخارجي يمكن أن يكون اختياري طالما لا توجد درجة الحرارة والضغط التغييرات المحيطة كبيرة لتقديم تنازلات التجربة. هذا يمكن تحديده من خلال تحليل للسيطرة سلبية وتقلب كبير في قياسات العينات البيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للماصة CO 2 أن يكون من أي طائفة وطالما أنها ليست سامة للوالأكاذيب (على سبيل المثال، وهيدروكسيد البوتاسيوم). فإنه من الأهمية بمكان أن يكون هناك سيطرة سلبية للتأكد من أن هذه التقنية تعمل بشكل صحيح. المشكلة الأكثر شيوعا هو لمقياس التنفس للا تكون مختومة تماما. إذا كان هذا هو الحال، ثم قياس سوف تكون قابلة للمقارنة إلى أن من المراقبة السلبية. يمكن أن تنشأ مشكلات إضافية بسبب الذباب الذي لم يتح لها الوقت للتعافي من التخدير أو لقوا حتفهم.
الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو بناء مقياس التنفس. كما ذكر أعلاه، يجب أن يكون محكم على مقياس التنفس. يجب أن يتم الحجز من micropipette إلى غرفة أكبر مع ماصة الغراء الصحيح. عملت A-مطاطية لاصقة مثل أكثر أفضل. فمن المستحسن لتفقد قياس التنفس تحت المجهر لمراقبة أي تنازلات في هيكل لاصق بعد الانتهاء. بالإضافة إلى ذلك، ختم على مقياس التنفس بعد أن تم وضع الذباب داخل مهم جدا. استخدام المعجون حكما تم العثور على عمل أفضل وفشل بشكل غير منتظم. وقد وجد البارافين للعمل سيئة للغاية ويجب تجنبها. السائل الذي يستخدم لقياس حجم الغاز هو أيضا مهم جدا ويجب أن يكون قياس الحرارة. وبالتالي المياه هو الخيار الافضل. لا ينصح استخدام الحبر لأنه يمكن أن تتصلب في شعري جعل مقياس التنفس عديمة الفائدة. ومن الأهمية بمكان أيضا لعدم استخدام استنساخ الإناث، كما لاحظنا أن إنتاجها CO 2 يمكن أن يكون اختلافا كبيرا. بالإضافة عمر الذباب المهم، وبالتالي فإن الذباب الذي تتم مقارنة يجب أن تكون من نفس الفئة العمرية. في اختبار لدينا استخدمنا الذكور 5 أيام القديمة. الخلفية الوراثية للذباب مهم أيضا. يجب أن يكون الذباب السيطرة على نفس الخلفية الجينية بالمقارنة مع المسوخ. ويمكن أيضا أن تعرض البيانات كما (ميكرولتر / ساعة / ملغ) عن طريق قياس كتلة الذباب بعد أداء فحص ما إذا كانت هناك اختلافات كبيرة في حجم الذباب. في أيدينا، نوع واحد البرية ذبابة يزن 0.80 ± 0.11 ملغ (ن = 180). كما ينبغي الإشارة إلى أنه خلال توقيت التجربة، ويتم الحصول على القيم من متوسط معدل الأيض. وقد وجدنا أيضا أنه من الممكن لقياس ذبابة الفردية، ولكن حققنا أعلى مستوى من الدقة باستخدام 3-5 الذباب. المساحة المتوفرة في مقياس التنفس لذباب يكفي أنهم لا يشعرون مكتظة ولكن في الوقت نفسه أنها لم يكن لديك مساحة على المشي بشكل مكثف: وبالتالي لا ينبغي أن يكون انجذاب بالجاذبية معيبة أي تأثير على مستوى CO 2 الإنتاج.
منذ فترة طويلة أنشئت الذباب باعتباره واحدا من الكائنات الحية نموذج رئيسي لدراسة الأمراض البشرية التي ترتبط البيولوجيا التطورية، بيولوجيا الخلايا، وعلم الأعصاب. وأظهر عدد من الدراسات الحديثة أن الذباب يمكن استخدامها بسهولة لدراسة توازن الطاقة وكذلك (استعرضت في 12، 13). يمكن بسهولة الطريقة المعروضة هنا أن تستخدم في شاشات الجينية لتحديد المكونات الجزيئية الجديدة ربما تشارك في السيطرة على ليالدولة tabolic قبل شراء معدات أكثر دقة ومكلفة. حتى الآن أجريت غالبية هذه الشاشات فقط في الثقافة الخلية تشير إلى أن هناك ما يبرر المزيد من الدراسات المتقدمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
نود أن نشكر جمعية ماكس بلانك لتمويل أبحاثنا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BlauBrand IntraMark 50 µl micropipettes | VWR | 612-1413 | |
| Soda Lime | Wako | CDN6847 | |
| Eosine | Sigma | 031M4359 | Any dye that can create visible colorization of liquid can be used |
| Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber | VWR | 21432-761 | Any transparent glass chamber that can be closed with the lid |
| Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit | Flinn | FB1438 | |
| Power Gel Glue | Pritt | ||
| 1 ml pipett tips | Any | ||
| Foam | Any | ||
| Plaesticine Putty | Any | ||
| Scalpel | Any | ||
| Tweezers | Any |
References
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Testing the "rate of living" model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster. J Appl Physiol. 97, 1915-1922 (2004).
- Ross, R. E. Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 46, 1477-1480 (2000).
- van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Selected contribution: long-lived Drosophila melanogaster. lines exhibit normal metabolic rates. J Appl Physiol. 95, 2605-2613 (2003).
- Hulbert, A. J., et al. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 39, 1137-1143 (2004).
- Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. Dopamine modulates metabolic rate and temperature sensitivity in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 7, (2012).
- Takeuchi, K., et al. Changes in temperature preferences and energy homeostasis in dystroglycan mutants. Science. 323, 1740-1743 (2009).
- Kucherenko, M. M., Marrone, A. K., Rishko, V. M., Magliarelli Hde, F., Shcherbata, H. R. Stress and muscular dystrophy: a genetic screen for dystroglycan and dystrophin interactors in Drosophila. identifies cellular stress response components. Developmental Biology. 352, 228-242 (2011).
- Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Wiek, R., Gopfert, M. C., Shcherbata, H. R. Hyperthermic seizures and aberrant cellular homeostasis in Drosophila dystrophic. muscles. Scientific Reports. 1, 47 (2011).
- Khazaeli, A. A., Van Voorhies, W., Curtsinger, J. W. Longevity and metabolism in Drosophila melanogaster: genetic correlations between life span and age-specific metabolic rate in populations artificially selected for long life. Genetics. 169, 231-242 (2005).
- Elia, M. Energy equivalents of CO2 and their importance in assessing energy expenditure when using tracer techniques. The American Journal of Physiology. 260, (1991).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Bharucha, K. N. The epicurean fly: using Drosophila melanogaster. to study metabolism. Pediatric Research. 65, 132-137 (2009).
- Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biology. 11, 38 (2013).
