מדידה של קצב חילוף החומרים ב Published: June 24, 2014 doi: 10.3791/51681

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Andriy S. Yatsenko¹, April K. Marrone¹, Mariya M. Kucherenko¹, Halyna R. Shcherbata¹

¹Max Planck Research Group of Gene Expression and Signaling, Max Planck Institute for Biophysical Chemistry

Summary

הפרעות מטבוליות הן בין אחת המחלות הנפוצות ביותר בבני אדם. אורגניזם המודל גנטי הצייתן ד melanogaster יכול לשמש כדי לזהות גנים רומן שמווסתים את חילוף חומרים. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה יחסית המאפשרת ללמוד את קצב חילוף חומרים בזבובים על ידי מדידת ייצור CO ₂ שלהם.

Abstract

הפרעות מטבוליות הן בעיה שכיחה המשפיעה על בריאות אדם. לכן, הבנת המנגנונים המווסתים את חילוף חומרים היא משימה מדעית חשובה. יש גנים מחלה גורמת רבים בבני האדם homologue לטוס, מה שהופך את דרוזופילה מודל טוב ללמוד מסלולי איתות מעורבים בהתפתחות של הפרעות שונות. בנוסף, העקיבות של דרוזופילה מפשטת מסכי גנטיים כדי לסייע בזיהוי מטרות טיפוליות חדשניות שעשויים לווסת את חילוף החומרים. על מנת לבצע מסך כזה שיטה פשוטה ומהירה לזיהוי שינויים במצב מטבולים של זבובים היא הכרחית. באופן כללי, ייצור פחמן דו חמצני הוא אינדיקטור טוב של הוצאה חמצון המצע והאנרגיה מתן מידע על מצב מטבולים. בפרוטוקול זה אנו מציגים שיטה פשוטה למדידת CO ₂ פלט מזבובים. טכניקה זו יכולה באופן פוטנציאלי לסייע בזיהוי של הפרעות גנטיות המשפיעות על קצב חילוף חומרים.

Introduction

המחזור של Kreb יוכימיים מייצר ATP באמצעות החמצון של אצטט נגזרים מפחמימות, שומנים, חלבונים וייצור CO _2. בדרוזופילה, O ₂ קלט בקורלציה ישירה עם CO ₂ פלט ומשקף את רמת חילוף החומרים ^1. לכן, מדידה של CO פלט ₂ בהצלחה נעשתה שימוש במחקרים הקשורים להזדקנות ואת חילוף חומרים של ^2-5. הנה המעבדה שלנו שינתה הגדרות ניסיוניות תוכננו בעבר, המאפשרת מדידה של ₂ CO בייצור עד שמונה עשר דגימות ללא צורך בציוד מיוחד. אחרים ויש לנו השתמשנו בעבר בשיטה זו כדי להראות הבדלים בקצב חילוף חומרים בזבובים שחסרים בחלבון ניוון השרירים קשור, Dystroglycan (DG) ^6-8.

O ₂ המשמשים לחילוף חומרי חמצוני מומר CO _2, אשר גורש כפסולת בדרכי הנשימה. Construction של respirometers יד מתואר המאפשר לקביעת שיעור O ₂ נצרכים. זבובים ממוקמים במכל אטום בחומר שסופג גורש CO _2, ביעילות לחסל אותו ממצב צבירת הגזים. השינוי בנפח גז (לחץ ירד) נמדד על ידי העקירה של נוזל בנימי זכוכית מחוברת לrespirometer הסגור.

היתרון העיקרי של שיטה זו על פני אחרים הוא העלות. מחקרים קודמים נמדדו CO ₂ על ידי ייצור דרוזופילה באמצעות גז מנתחי מערכות וrespirometry טכני מתקדמות ^1,9. למרות הציוד המורכב יותר, הרגישות של השיטה המתוארת כאן היא דומה לערכים מדווחים (טבלה 1). בנוסף, מספר קבוצות אחרות השתמשו וריאציות של טכניקה זו על מנת לקבוע את קצב חילוף חומרים יחסית בדרוזופילה ^4-6. לכן, assay זה יכול לשמש כדי ליצור reliable, נתונים לשחזור רלוונטיים לחילוף חומרי דרוזופילה ללא רכישת ציוד מיוחד אשר יכולה להיות התקנה בכל מעבדה וניתן להשתמש בם למטרות חינוכיות.

באופן כללי, הטכניקות המקובלות לקבוע את חילוף החומרים של אורגניזם היא למדוד את ה-CO ₂ המיוצרים, O ₂ צרכו, או שניהם ^3,4,9. אמנם, ניתן להניח כי שווה ערך אחד O ₂ מייצר שווה ערך אחד של CO _2, היחס המדויק של CO ₂ שנוצר תלוי במצע חילוף החומרים מנוצלים ^10. לפיכך, על מנת לקבוע את קצב חילוף חומרים ביחידות אנרגיה בצורה מדויקת יש צורך למדוד גם O ₂ ו-CO ₂ צרך הפיק. בשל כך, בשיטה המתוארת כאן היא דווקא רלוונטית להשוואת הבדלים בCO ₂ ייצור בין בעלי חיים ולא הערך המוחלט. הטכניקה שלנו משלבת ייצור CO ₂ של בעלי חיים רבים על פני תקופה של timדואר (1-2 שעות) ולכן חוזרת ממוצעת של פעילותם של בעלי החיים. אם יש סיבה להאמין שחיות ניסוי הן פחות פעילה מאשר חיות בקרת המדידה יכולה לשקף את הרמות שונות של פעילות ולא בהכרח חילוף חומרים.

Protocol

1. הכנת Respirometers

1. חותכים את קצה פיפטה 1,000 μl בסכין גילוח כדי לאפשר החדרה של micropipette נימי 50 μl, לנסות להשיג את קצה פיפטה ישרה ככל האפשר.
2. מניחים פיסת הקצף לתוך פיפטה ולדחוף אותו בקצה פיפטה.
3. להוסיף כמות קטנה של CO ₂ סופגים ולהכיל אותו על ידי פיסת הקצף שנייה.
4. החל דבק במקום שבו micropipette מוכנס לתוך קצה פיפטה.
5. השאר את respirometer לילה כדי לאפשר לדבק להתייבש.
   סכמטי של respirometer מוצג באיור 1 א.

2. הכנה של לשכת המדידה

1. הכן את פתרון התא על ידי ערבוב מים עם eosin ביחס שיגרום לצביעה נראית לעין.
2. יוצקים את פתרון eosin / מים לתוך התא.
3. לייבל אחד הצדדים של החדר עם סולם סנטימטר.

= "Jove_title"> ילדה 3. הצבת זבובים לRespirometers

1. תווית respirometers הבודד עם סמן.
2. הרדימי זבובים באמצעות שיטה חלופית ל-CO ₂ ומקום 3-5 זבובים של הגנוטיפ הרצוי בתוך כל respirometer.
3. לאטום respirometers בחוזקה בראש באמצעות שפכטל פלסטלינה.
4. לאפשר זבובים להתאושש מהרדמה כ 15 דקות.
5. הכן respirometer אחד בלי זבובים, אשר ישמש כשליטה באטמוספרה.

4. ביצוע הניסוי

1. לתלות את respirometers בתא על ידי הצמדת בעל צינור Eppendorf 1.5 מיליליטר כי הוא פתוח בחלק העליון והחלק התחתון בחלק העליון של החדר.
2. הכנס respirometers עם קצה micropipette למטה לתוך התא המאפשר את הקצה לצלול לתוך התמיסה בצבע.
3. הוספת זלין בין כיסוי המכסה והקאמרי כדי לספק בידוד חזק יותר מfluct הטמפרטורה והלחץuations.
4. סגור את המכסה ולאפשר למערכת כדי לאזן במשך 15 דקות.
5. קח את תמונה של החדר ולוודא כי רמת הנוזל בתוך כל micropipette גלויה וכך גם בקנה מידה (ראה דוגמא שמוצגת באיור 1 ב ').
6. לאחר 1-2 hr, לצלם תמונה נוספת.
7. כאשר הניסוי נגמר, להסיר את הזבובים מrespirometers ולשקול אם תרצה בכך או להעביר אותם בחזרה לבקבוקון במידת צורך נוסף.

5. ניתוח התוצאות

1. פתוח רכש תמונות באמצעות תוכנת ImageJ ^11.
2. תוך שימוש בסולם בכל תמונה, להגדיר את קנה המידה פיקסל בתוכנה.
3. מדוד את המרחק (Δd) כי הנוזל נסע מנקודת התייחסות נחושה בתמונות שצולמו בתחילת (ד 1) וסופו של הניסוי (D2). דוגמא סכמטית מוצגת באיור 1 ג.
4. לחשב את כמות מיוצר CO ₂ (μl / שעה / זבוב) עם הנוסחה:

R = רדיוס של צינור micropipette בסנטימטרים
Δd = מרחק הנוזל עבר בmicropipette של דגימות בדיקה נמדד בסנטימטרים
Δc = מרחק הנוזל עבר בmicropipette של מדגם הביקורת השלילית (בלי זבובים)
n = מספר הזבובים המשמשים
= H שעות

Representative Results

על מנת להראות כי השיטה היא רגישה מדדנו CO ₂ ייצור מסוג בר (אורגון R) זכר עף ב18, 25, ו29 מעלות צלזיוס וזבובים שעברו מוטציה לDG. זבובים הועלו ב ° C25 ולאחר מכן עברו לטמפרטורה הניסיונית במשך 5 ימים לפני המדידה. כצפוי למיני ectothermic זה, כמות ה-CO ₂ המיוצרת גדל עם טמפרטורה (איור 2). בעבר הראינו כי דיאטה ללא סוכר מפחיתה את קצב חילוף החומרים של שניהם סוג בר המוטציה Dg עפה ^7. אובדן Dg מוביל לרמות חילוף חומרים מוגברות (איור 2).

איור 1. התקנה למדידה של ₂ ייצור CO בזבובים. א סכמטי המציג tהוא הקמת respirometer הבודד. צילום ב 'של החדר במהלך מדידת CO _2. מכתבים לסמן את המיקום של respirometers. מספרים אנכיים מצביעים על קנה מידה בסנטימטרים. ג סכמטי המציג את השינויים במהלך הניסוי. קו ירוק מציין נקודת התייחסות (ד 1), כחול מציין את המיקום הסופי של הנוזל לאחר 2 שעות (D2). Δd הוא המרחק הנוזלי נסע בmicropipette.

איור 2. ₂ ייצור CO בזבובים בטמפרטורות שונות ובמוטציות DG. טמפרטורת השיכון חיובית בקורלציה עם ₂ ייצור CO בדרוזופילה, והוא גדל באופן משמעותי במוטנטים DG. ברים שגיאה מצביעים SEM מארבעה ניסויים נפרדים, *** p ≤ 0.01.

(X השעה μl / לעוף)	ציוד המשמש	הפניה
2-3 CO 2	מנתח 2 גז CO	(ואן Voorhies, Khazaeli et al. 2004)
4.68 ± 1.04 CO 2	מערכת 2 CO respirometry	(Khazaeli, ואן Voorhies et al. 2005)
2.9-6.2 O 2	respirometers כמו כן נועד	(Hulbert, קלנסי ואח'. 2004)
2.20 ± 0.15 O 2	respirometers כאן בעבודת יד שתואר	(Kucherenko, Marrone et al. 2011)
		* ערכים בטבלה הם ממחקרים בם דווחו ערכים מספריים של זבובים שנמדדו ב ° C25

טבלה 1. השוואהטכניקות שונות של המשמשות למדידת CO ₂ על ידי ייצור דרוזופילה.

Discussion

בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה זולה ואמינה למדידת ₂ ייצור CO בזבובים. מצאנו כי ניסוי זה הוא קל, מהיר לביצוע ומייצר נתונים לשחזור כי הוא בהסכם עם מחקרים אחרים ^{1, 6, 9.} הפרוטוקול המתואר כאן ניתן לשנות בקלות כדי להתאים את חומרי התקציב וזמין של כל מעבדה. הבנייה של כל respirometer הבודד ניתן להתאים כל עוד התא נשאר אטום. עם זאת, ארוך יותר, דק יותר micropipettes מציע יותר דיוק מעל קצר יותר. השימוש בתא החיצוני יכול להיות אופציונלי כל עוד אין שינויי טמפרטורה ולחץ סביבה משמעותיים להתפשר הניסוי. זה יכול להיקבע על ידי ניתוח של הביקורת השלילית ושונות גדולות בתוך מדידות מדגם ביולוגיות. בנוסף, סופג CO ₂ יכול להיות של כל מגוון כל עוד הוא אינו רעיל לfשקרים (למשל, אשלגן הידרוקסידי). זה הוא בעל חשיבות עליונה שיש ביקורת שלילית על מנת להבטיח כי הטכניקה פועלת כהלכה. הבעיה הנפוצה ביותר היא לrespirometer לא להיות אטומה לחלוטין. אם זה המקרה, אז המדידה תהיה דומה לזו של הביקורת השלילית. בעיות נוספות עלולות להתעורר בשל זבובים שלא היו לי הזמן להתאושש מהרדמה או שנספו בשואה.

השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא הבנייה של respirometer. כפי שצוין לעיל, חייב להיות אטום respirometer. הקובץ המצורף של micropipette לתא פיפטה הגדול חייב להיעשות עם הדבק הנכון. דבק כמו גומי יותר עבד הכי טוב. מומלץ לבדוק את respirometers תחת מיקרוסקופ כדי להתבונן פשרות כלשהן במבנה מודבק לאחר השלמת. בנוסף, האיטום של respirometer אחרי הזבובים הוצבו בתוך הוא מאוד חשוב. השימוש בשעתי מרקכנמצא עבודה הטובה ביותר ואינה מצליח לעתים רחוקות. פרפין כבר מצא עבודה בצורה גרועה מאוד ויש להימנע. הנוזל שמשמש למדידת נפח גז הוא גם מאוד חשוב וצריך להיות מונו מטרי. מים ולכן הבחירה הטובה ביותר. השימוש בדיו אינו מומלץ משום שהוא יכול להתקשות בנימים עושה respirometer חסר תועלת. זה גם קריטי שלא להשתמש להתרבות נקבות, כפי ששמנו לב כי ייצור ה-CO ₂ שלהם יכול להיות מאוד משתנה. בנוסף הגיל של זבובים הוא חשוב, ולכן הזבובים כי הם בהשוואה צריכים להיות באותו גיל. בבדיקה שלנו השתמשו זכרים ישנים 5 ימים. הרקע הגנטי של הזבובים הוא גם חשוב. זבובי השליטה צריכים להיות מאותו הרקע הגנטי בהשוואה למוטציות. יכולים להיות גם הציגו את הנתונים כ( μl / שעה / מ"ג) על ידי מדידת המסה של הזבובים לאחר ביצוע assay אם יש הבדלים משמעותיים בגודל של זבובים. בידיים שלנו, זבוב סוג בר אחת שוקל 0.80 ± 0.11 מ"ג (n = 180). כמו כן יש לציין כי במהלך העיתוי של הניסוי, הערכים של קצב חילוף חומרים הממוצע מתקבלים. מצאנו גם כי ניתן למדוד זבוב בודד, אבל אנחנו השגנו את הדיוק הגבוה ביותר באמצעות 3-5 זבובים. השטח הפנוי בrespirometer לזבובים די בכך שהם לא מרגישים צפופים, אבל באותו הזמן אין להם מקום ללכת באופן אינטנסיבי: לכן geotaxis הפגומה לא צריכה להיות כל השפעה על רמת הייצור CO _2.

זבובים כבר מזמן הוקמו כאחד מיצורי המודל העיקריים ללמוד מחלות בבני אדם הקשורים לביולוגיה התפתחותית, ביולוגיה של תא, ונוירוביולוגיה. מספר מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי זבובים יכולים בקלות לשמש כדי לחקור הומאוסטזיס אנרגיה, כמו גם (הנסקרת ב ^{12, 13).} השיטה המוצגת כאן יכולה לשמש בקלות במסכים גנטיים כדי לזהות רכיבים מולקולריים חדשים מעורבים אולי בשליטתימדינת tabolic לפני רכישת ציוד מדויק יותר ויקר. עד כה רוב המסכים אלה נעשו רק בתרבית תאים המצביעים על כך מחקרים מתקדמים יותר הם ערובה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BlauBrand IntraMark 50 µl micropipettes	VWR	612-1413
Soda Lime	Wako	CDN6847
Eosine	Sigma	031M4359	Any dye that can create visible colorization of liquid can be used
Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber	VWR	21432-761	Any transparent glass chamber that can be closed with the lid
Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit	Flinn	FB1438
Power Gel Glue	Pritt
1 ml pipett tips	Any
Foam	Any
Plaesticine Putty	Any
Scalpel	Any
Tweezers	Any