Summary
Disturbi metabolici sono tra una delle malattie più comuni negli esseri umani. Il modello di organismo geneticamente trattabili D. melanogaster può essere utilizzato per identificare nuovi geni che regolano il metabolismo. Questo documento descrive un metodo relativamente semplice, che permette lo studio del metabolismo in linea misurando la produzione di CO 2.
Abstract
Disturbi metabolici sono un problema frequente che colpisce la salute umana. Pertanto, la comprensione dei meccanismi che regolano il metabolismo è un compito scientifico fondamentale. Molti geni che causano malattie negli esseri umani hanno un omologo mosca, rendendo Drosophila un buon modello per studiare vie di segnalazione coinvolte nello sviluppo di malattie diverse. Inoltre, la trattabilità di Drosophila semplifica schermi genetici per aiutare a identificare nuovi bersagli terapeutici che possono regolare il metabolismo. Per eseguire tale schermata è necessario un metodo semplice e veloce per identificare le variazioni dello stato metabolico di mosche. In generale, la produzione di anidride carbonica è un buon indicatore di ossidazione del substrato ed il dispendio energetico fornire informazioni sullo stato metabolico. In questo protocollo si introduce un metodo semplice per misurare la CO 2 in uscita dalle mosche. Questa tecnica può potenzialmente aiutare nell'identificazione di perturbazioni genetiche che colpiscono tasso metabolico.
Introduction
Il ciclo di Krebs biochimico genera ATP attraverso l'ossidazione di acetato derivata dai carboidrati, grassi e proteine che producono CO 2. In Drosophila, O 2 ingresso è direttamente correlata con CO 2 uscita e riflette il livello di metabolismo 1. Così, la misurazione di CO 2 in uscita è stato usato con successo in studi legati all'invecchiamento e metabolismo 2-5. Qui il nostro laboratorio ha modificato apparati sperimentali progettati in precedenza, consente la misurazione della produzione di CO 2 fino a diciotto campioni senza bisogno di attrezzature specializzate. Altri e abbiamo già utilizzato questo metodo per mostrare le differenze nei tassi metabolici in linea che sono carenti nella distrofia muscolare proteina associata, distroglicano (DG) 6-8.
O 2 utilizzati per il metabolismo ossidativo è convertito in CO 2, che viene espulso come rifiuti respiratorio. La costruzionezione respirometri fatti a mano viene descritto che permette la determinazione del tasso di O 2 consumato. Mosche sono posti in un contenitore sigillato con una sostanza che assorbe espulso CO 2, eliminando efficacemente dalla fase gassosa. La variazione di volume di gas (diminuzione della pressione) è misurata dallo spostamento di liquido in un capillare di vetro attaccato alla respirometro chiuso.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri è il costo. Precedenti studi hanno misurato produzione di CO 2 da Drosophila utilizzando analizzatori di gas e sistemi di RESPIROMETRICO tecnicamente avanzati 1,9. Nonostante l'apparecchiatura più complessa, la sensibilità del metodo qui descritto è simile ai valori riportati (Tabella 1). Inoltre, diversi altri gruppi hanno utilizzato varianti di questa tecnica per determinare i tassi metabolici relativi in Drosophila 4-6. Pertanto, questo test può essere utilizzato per generare attendibilile, i dati riproducibili relativi al metabolismo Drosophila, senza l'acquisto di attrezzature specializzate che può essere installato in qualsiasi laboratorio e può essere utilizzato per scopi didattici.
In generale, le tecniche riconosciute per determinare il metabolismo di un organismo è misurare la CO 2 prodotta, l'O 2 consumato, o entrambi 3,4,9. Anche se, si può presumere che un equivalente di O 2 genera un equivalente di CO 2, il rapporto precisa del CO 2 generata dipende sul substrato metabolico utilizzato 10. Così, per determinare con precisione il tasso metabolico in energia è necessario misurare sia O 2 consumato e CO 2 prodotta. A causa di questo, il metodo qui descritto è specificamente rilevante per confrontare le differenze fra CO 2 produzione tra gli animali e non il valore assoluto. La nostra tecnica si integra aerei animale produzione di CO 2 per un periodo di time (1-2 ore) e quindi restituisce una media di attività degli animali. Se non vi è motivo di ritenere che gli animali sperimentali sono meno attivi rispetto agli animali di controllo la misura potrebbe riflettere i diversi livelli di attività e non necessariamente il metabolismo.
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Protocol
1. Preparazione di Respirometri
- Tagliare la punta della pipetta 1.000 microlitri con una lametta per consentire l'inserimento del capillare micropipetta 50 pl, cercare di ottenere il puntale più diritta possibile.
- Posizionare un pezzo di schiuma nella pipetta e spingerla verso il basso nella punta della pipetta.
- Aggiungere una piccola quantità di CO 2 assorbente e contenere entro un secondo pezzo di schiuma.
- Applicare la colla nel luogo in cui la micropipetta viene inserito nella punta della pipetta.
- Lasciare il respirometro durante la notte per permettere la colla si asciughi.
Uno schema di un respirometro è mostrato nella Figura 1A.
2. Preparazione della camera di misura
- Preparare la soluzione da camera di miscelazione acqua con eosina in un rapporto che si tradurrà in colorazione visibile.
- Versare la soluzione eosina / acqua nella camera.
- Etichettare uno dei lati della camera con una scala centimetro.
- Etichettare le singole respirometri con un pennarello.
- Anestetizzare mosche utilizzando un metodo alternativo di CO 2 e posizionare 3-5 mosche del genotipo desiderato all'interno di ogni respirometro.
- Sigillare le respirometri saldamente in cima utilizzando plastilina stucco.
- Consentire mosche per recuperare da anestesia per circa 15 min.
- Preparare una respirometro senza linea, che sarà utilizzato come controllo atmosferica.
4. Esecuzione dell'esperimento
- Appendere le respirometri nella camera collegando un titolare Eppendorf da 1,5 ml tubo che è aperto nella parte superiore e la parte inferiore alla parte superiore della camera.
- Inserire respirometri con la punta micropipetta giù nella camera che la punta di immergersi nella soluzione colorata.
- Aggiungere vaselina tra il coperchio coperchio e camera per fornire l'isolamento forte dalla temperatura e pressione fluctuations.
- Chiudere il coperchio e lasciare il sistema si stabilizzi per 15 min.
- Prendere una fotografia della camera di fare in modo che il livello di liquido all'interno di ciascuna micropipetta è visibile e quindi è la scala (vedi esempio illustrato nella Figura 1B).
- Dopo 1-2 ore, scattare un'altra foto.
- Quando esperimento è finito, rimuovere le mosche dal respirometri e pesare se desiderato o il trasferimento di nuovo al flaconcino, se necessario ulteriormente.
5. Analisi dei risultati
- Apri immagini acquisite utilizzando il software ImageJ 11.
- Utilizzando la scala in ogni immagine, impostare la scalatura pixel nel software.
- Misurare la distanza (Δd) che il liquido ha viaggiato da un punto di riferimento determinato in immagini scattate all'inizio (d1) e alla fine dell'esperimento (d2). Un esempio schematico è mostrato nella Figura 1C.
- Calcolare la quantità di CO 2 prodotta (ml / h / volo) con la formula:
R = raggio del tubo micropipetta in centimetri
Δd = distanza il liquido è spostato nella micropipetta di campioni di prova misurata in centimetri
Δc = distanza il liquido è spostato nella micropipetta del campione di controllo negativo (senza linea)
n = numero di mosche utilizzati
h = ore
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Representative Results
Al fine di dimostrare che il metodo è sensibile abbiamo misurato la produzione di CO 2 da wild type (Oregon R) maschile vola a 18, 25, e 29 ° C e vola mutante per Dg. Mosche sono state sollevate a 25 ° C e poi spostato alla temperatura sperimentale per 5 giorni prima della misura. Come previsto per questa specie ectotermi, la quantità di CO 2 prodotta aumentata con la temperatura (Figura 2). Abbiamo in passato dimostrato che una dieta priva di zucchero riduce il tasso metabolico sia di tipo selvatico e mutante vola Dg 7. La perdita di Dg porta ad aumento dei livelli metabolici (Figura 2).
Figura 1. Impostazione di misurazione della produzione di CO2 in linea. A. schematica tegli costruzione del respirometro individuo. B. fotografico della camera durante la misurazione di CO 2. Lettere segnano la posizione di respirometri. Numeri verticali indicano scala in centimetri. C. schematica che mostra le variazioni durante l'esperimento. Linea verde indica punto di riferimento (d1), blu indica la posizione finale del liquido dopo 2 ore (d2). Δd è la distanza il liquido ha viaggiato nel micropipetta.
Figura 2. Produzione di CO 2 in linea a diverse temperature e in mutanti Dg. Temperatura Housing correla positivamente con produzione di CO2 in Drosophila ed è significativamente aumentata nei mutanti Dg. Le barre di errore indicano SEM da quattro esperimenti singoli, *** p ≤ 0.01.
| (Pl / fly x ora) | Attrezzatura utilizzata | Riferimento |
| 2-3 di CO 2 | Analizzatore di gas CO 2 | (Van Voorhies, Khazaeli et al. 2004) |
| 4.68 ± 1.04 di CO 2 | CO 2 Sistema respirometria | (Khazaeli, Van Voorhies et al. 2005) |
| 2,9-6,2 O 2 | Respirometri Analogamente progettati | (Hulbert, Clancy et al. 2004) |
| 2.20 ± 0.15 O 2 | Descritto respirometri qui fatti a mano | (Kucherenko, Marrone et al. 2011) |
| * Valori della tabella sono da studi che riportano i valori numerici di mosche misurate a 25 ° C |
Tabella 1. Confrontodelle diverse tecniche utilizzate per misurare la produzione di CO 2 da Drosophila.
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Discussion
In questo protocollo, si descrive un metodo poco costoso ed affidabile per misurare la produzione di CO 2 in mosche. Abbiamo trovato che questo esperimento è facile, rapida da condurre e genera dati riproducibile che è in accordo con altri studi 1, 6, 9. Il protocollo qui descritto può essere facilmente modificato per adattarsi bilancio e disponibili materiali di qualsiasi laboratorio. La costruzione di ogni singolo respirometro può essere adattato finché la camera rimane chiuso ermeticamente. Tuttavia, il più lungo, micropipette sottili offrono più precisione rispetto a quelli brevi. L'uso della camera esterna può essere facoltativo finché ci sono significative variazioni di temperatura e pressione ambiente per compromettere l'esperimento. Questo può essere determinato mediante analisi del controllo negativo e una grande variabilità all'interno misurazioni di campioni biologici. Inoltre, la CO 2 assorbente può essere di qualsiasi varietà finché non è tossico per la fbugie (ad esempio idrossido di potassio). E 'estremamente importante avere un controllo negativo per assicurare che la tecnica funziona correttamente. Il problema più comune è per il respirometro non da sigillare completamente. Se questo è il caso, allora la misura sarà paragonabile a quella del controllo negativo. Ulteriori problemi potrebbero sorgere a causa di mosche che non hanno avuto il tempo per recuperare da anestesia o sono morti.
La fase più critica in questo protocollo è la costruzione del respirometro. Come notato sopra, la respirometro deve essere a tenuta stagna. Il fissaggio della micropipetta per la grande camera pipetta deve essere fatto con la colla corretta. Un adesivo più simile alla gomma ha funzionato meglio. Si consiglia di ispezionare i respirometri al microscopio per osservare compromessi nella struttura incollato dopo il completamento. Inoltre, la tenuta della respirometro dopo linea sono state collocate all'interno è molto importante. L'uso di mastice hcome stato trovato a lavorare meglio e non riesce di rado. Paraffina è stato trovato a lavorare molto male e deve essere evitato. Il liquido che viene utilizzato per misurare il volume di gas è anche molto importante e dovrebbe essere manometrica. L'acqua è quindi la scelta migliore. L'uso di inchiostro non è raccomandato perché può indurire nel capillare rendendo il respirometro inutile. E 'anche fondamentale non usare riprodurre femmine, come abbiamo notato che la loro produzione di CO 2 può essere molto variabile. Inoltre l'età di mosche è importante, quindi in linea che sono confrontati dovrebbero essere della stessa età. Nel nostro test abbiamo utilizzato 5 giorni vecchi maschi. Il background genetico delle mosche è anche importante. Linea di controllo devono essere dello stesso sfondo genetico rispetto a mutanti. I dati possono anche essere presentate come (ml / h / mg), misurando la massa di linea dopo aver eseguito il test se ci sono differenze significative nella dimensione di mosche. Nelle nostre mani, un tipo selvaggio mosca pesa 0,80 ± 0,11 mg (n = 180). Va inoltre sottolineato che, durante la temporizzazione dell'esperimento, si ottengono i valori del tasso metabolico medio. Abbiamo anche trovato che è possibile misurare una mosca individuo, ma abbiamo raggiunto la massima precisione utilizzando 3-5 mosche. Lo spazio disponibile in respirometro per le mosche è sufficiente che essi non si sentono affollata, ma allo stesso tempo non hanno spazio per camminare intensamente: quindi geotassi difettosi non dovrebbero avere alcun effetto sul livello di produzione di CO 2.
Le mosche sono stati a lungo affermato come uno dei principali organismi modello per studiare le malattie umane che sono legati alla biologia dello sviluppo, biologia cellulare e neurobiologia. Un certo numero di studi recenti hanno dimostrato che in linea possono facilmente essere utilizzati per studiare l'omeostasi energetica nonché (recensito in 12, 13). Il metodo qui presentato può essere facilmente utilizzato in schermi genetici per identificare nuovi componenti molecolari possibilmente coinvolti nel controllo della mestato tabolic prima di acquistare attrezzature più accurato e costoso. Finora la maggior parte di questi schermi è stato fatto solo in colture cellulari che indica che gli studi più avanzati sono garantiti.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Max-Planck Society per finanziare la nostra ricerca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BlauBrand IntraMark 50 µl micropipettes | VWR | 612-1413 | |
| Soda Lime | Wako | CDN6847 | |
| Eosine | Sigma | 031M4359 | Any dye that can create visible colorization of liquid can be used |
| Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber | VWR | 21432-761 | Any transparent glass chamber that can be closed with the lid |
| Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit | Flinn | FB1438 | |
| Power Gel Glue | Pritt | ||
| 1 ml pipett tips | Any | ||
| Foam | Any | ||
| Plaesticine Putty | Any | ||
| Scalpel | Any | ||
| Tweezers | Any |
References
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