Summary
Metabolske forstyrrelser er blant en av de mest vanlige sykdommer hos mennesker. Den genetisk medgjørlig modell organisme D. melanogaster kan anvendes for å identifisere nye gener som regulerer forbrenningen. Dette notatet beskriver en relativt enkel metode som gjør det mulig å studere metabolic rate i fluer ved å måle deres CO 2-produksjon.
Abstract
Stoffskiftesykdommer er et hyppig problem som berører menneskers helse. Derfor forstå mekanismene som regulerer stoffskiftet er en viktig vitenskapelig oppgave. Mange sykdomsfremkallende gener hos mennesker har en flue homologue, gjør Drosophila en god modell for å studere signalveier er involvert i utviklingen av ulike lidelser. I tillegg er tractability av Drosophila forenkler genetiske skjermer for å hjelpe til med å identifisere nye terapeutiske mål som kan regulere stoffskiftet. For å kunne utføre en slik skjerm er nødvendig for en enkel og rask metode for å identifisere endringer i den metabolske tilstand av fluer. Generelt, er karbondioksid produksjons en god indikator på substratet oksydasjon og energiforbruk gi informasjon om metabolsk tilstand. I denne protokollen innfører vi en enkel metode for å måle CO 2 utgang fra fluer. Denne teknikken kan eventuelt hjelpe til med identifisering av genetiske forstyrrelser som påvirker metabolismen.
Introduction
Den biokjemiske Krebs syklus produserer ATP via oksidasjon av acetat avledet fra karbohydrater, fett og proteiner som produserer CO2. I Drosophila, O 2-inngang er direkte korrelert med CO 2-utgang og reflekterer nivået av stoffskiftet en. Således har måling av CO 2-utgang med hell blitt brukt i studier relatert til aldring og metabolisme 2-5. Her vårt laboratorium har endret tidligere designet forsøksoppsett, slik at måling av CO 2-produksjon i opp til atten prøver uten å kreve noen spesialisert utstyr. Andre og vi har tidligere brukt denne metoden for å vise forskjeller i stoffskifte i fluer som er mangelfull i muskeldystrofi assosiert protein, dystroglycan (Dg) 6-8.
O 2 brukes for oksidativ metabolisme omdannes til CO 2, som er utvist som luft avfall. Bygsjon av håndlagede respirometers er beskrevet som gjør det mulig for bestemmelse av hastigheten av O 2 forbrukes. Fluer er plassert i en forseglet beholder med en substans som absorberer utvist CO 2, effektivt eliminere den fra den gassformige fase. Endringen i gassvolum (redusert trykk) er målt ved fortrengning av fluidum i et glass kapillær festet til den lukkede respirometer.
Den største fordelen med denne teknikken over andre er kostnaden. Tidligere studier har målt CO 2 produksjon av Drosophila hjelp gass analysatorer og teknisk avanserte respirometri systemer 1,9. Til tross for den mer komplisert utstyr, er sensitiviteten av metoden beskrevet her lik rapporterte verdier (tabell 1). I tillegg har flere andre grupper brukte varianter av denne teknikken til å bestemme relative stoffskifte i Drosophila 4-6. Derfor kan denne analysen anvendes for å generere reliable, reproduserbare data som er relevante for Drosophila metabolisme uten kjøp av spesialisert utstyr som kan settes opp på noen lab og kan brukes til pedagogiske formål.
Generelt aksepterte teknikker for å bestemme forbrenningen av en organisme, er å måle CO2 produsert, O 2 forbrukes, eller begge deler 3,4,9. Skjønt, kan det antas at en ekvivalent av O 2 genererer en ekvivalent av CO 2, den nøyaktige forhold mellom CO 2 genereres er avhengig av metabolsk substrat benyttet 10. Derfor, for å nøyaktig bestemme den metabolske hastighet i energienheter er det nødvendig å måle både O 2 forbrukes og CO2 produsert. På grunn av dette er fremgangsmåten som er beskrevet her er spesielt relevant for å sammenligne forskjeller i CO 2-produksjon mellom dyr og ikke den absolutte verdi. Vår teknikk integrerer flere dyr CO 2 produksjon i en periode på time (1-2 timer) og således returnerer et gjennomsnitt på dyrenes aktivitet. Dersom det er grunn til å tro at de eksperimentelle dyr er mindre aktiv enn kontrolldyrene målingen kan reflektere forskjellige nivåer av aktivitet, og ikke nødvendigvis metabolisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Utarbeidelse av Respirometers
- Kutt 1000 mL pipette spissen med et barberblad for å tillate innføring av 50 mL kapillær micropipette, prøve å få pipettespissen så rett som mulig.
- Legg et stykke skum inn i pipetten og trykk den ned i pipettespissen.
- Tilsett en liten mengde CO2 absorbent og inneholder den ved en andre del av skum.
- Påfør lim på stedet der micropipette settes inn i pipettespissen.
- La respirometer over natten for å la limet tørker.
En skjematisk en respirometer er vist i figur 1A.
2. Utarbeidelse av målekammeret
- Forbered kammeret løsning ved å blande vann med eosin i et forhold som vil resultere i synlig fargelegging.
- Hell eosin / vann-løsning inn i kammeret.
- Etiketten en av sidene av kammeret med en centimeterskala.
- Merke de enkelte respirometers med en markør.
- Anesthetize fluer ved hjelp av en alternativ metode til CO 2 og plassere 3-5 fluer av den ønskede genotype inne i hver respirometer.
- Tett respirometers tett på toppen ved hjelp av plastilin kitt.
- Tillat fluer å komme seg fra bedøvelsen i ca 15 min.
- Forbered en respirometer uten fluer, som vil bli brukt som stemnings kontroll.
4. Utføre Experiment
- Heng respirometers i kammeret ved å feste et 1,5 ml Eppendorf-rør holder som er åpen på toppen og bunnen på toppen av kammeret.
- Sett respirometers med mikropipette spissen nedover inn i kammeret slik at spissen for å senke inn i den fargede løsningen.
- Legg vaselin mellom lokket dekselet og kammeret for å gi sterkere isolasjon fra temperatur og trykk fluctueringer.
- Lukk lokket og la systemet stabilisere seg i 15 min.
- Ta et fotografi av kammeret å sørge for at væskenivået i hver mikropipette er synlig, og derfor er størrelsen (se eksempel vist i figur 1 B).
- Etter 1-2 timer, ta et nytt bilde.
- Når forsøket er ferdig, fjerner fluene fra respirometers og veie hvis ønskelig, eller overføre dem tilbake til hetteglasset ved behov ytterligere.
5. Analyse av resultater
- Åpen kjøpte bilder ved hjelp ImageJ programvare 11.
- Ved hjelp av skalaen i hvert bilde, sette pixel skalering i programvaren.
- Mål avstanden (elastisitetsmodul) som væsken reiste fra et bestemt referanse plass i bilder tatt ved begynnelsen (d1) og slutten av forsøket (d2). Et skjematisk eksempel er vist i figur 1C.
- Beregne mengden av produsert CO 2 (mL / hr / fly) med formelen:
R = radius av micropipette tube i centimeter
Elastisitetsmodul = avstand væsken har beveget seg opp i mikropipette av prøver måles i centimeter
A C = avstand væsken har beveget seg opp i mikropipette til de negative kontrollprøve (uten fluer)
n = antall fluer som benyttes
h = timer
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å vise at fremgangsmåten er følsom vi målte CO 2-produksjon fra villtype (Oregon R) hann flyr ved 18, 25, og 29 ° C og fluer mutant for Dg. Fluer ble hevet ved 25 ° C og deretter skiftet til den eksperimentelle temperatur i 5 dager før måling. Som forventet for denne ectothermic art, produserte mengden av CO2 øker med temperaturen (figur 2). Vi har i det siste vist at en diett sukkerfri reduserer metabolic rate av både villtype og Dg mutant flyr syv. Tapet av Dg fører til økt metabolisme nivåer (figur 2).
Figur 1. Oppsett for måling av CO 2-produksjon i fluer. A. Skjematisk viser tHan konstruksjonen av de enkelte respirometer. B. fotografi av kammeret i løpet av CO 2-måling. Letters markere posisjonen til respirometers. Vertikale tall indikerer skala i centimeter. C. Skjematisk viser endringene under forsøket. Grønn linje angir referansepunktet (d1), indikerer blå den endelige plasseringen av væsken etter 2 timer (D2). Elastisitetsmodul er avstanden væsken har reist i mikropipette.
Figur 2. CO 2-produksjon i fluer ved ulike temperaturer og i Dg mutanter. Hustemperatur positivt korrelerer med CO 2-produksjon i Drosophila og er betydelig økt i Dg mutanter. Feilfelt angir SEM fra fire individuelle eksperimenter, *** p ≤ 00,01.
| (ML / fly x time) | Utstyr som brukes | Referanse |
| 2-3 CO 2 | CO 2 gass analysator | (Van Voorhies, Khazaeli et al. 2004) |
| 4.68 ± 1.04 CO 2 | CO 2 respirometri system | (Khazaeli, Van Voorhies et al. 2005) |
| 02.09 til 06.02 O 2 | Tilsvar designet respirometers | (Hulbert, Clancy et al. 2004) |
| 2.20 ± 0.15 O 2 | Beskrevet her håndlaget respirometers | (Kucherenko, Marrone et al. 2011) |
| * Tabellverdiene er fra studier som rapporterer numeriske verdier av fluer målt ved 25 ° C |
Tabell 1. Sammenligningav ulike teknikker som brukes for å måle CO 2-produksjon av Drosophila.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen beskriver vi en billig og pålitelig metode for å måle CO2-produksjon i fluer. Vi fant ut at dette eksperimentet er enkel, rask å gjennomføre og genererer reproduserbare data som er i overensstemmelse med andre studier 1, 6, 9. Protokollen skissert her kan enkelt endres til å passe alle laboratorie budsjett og tilgjengelige materialer. Konstruksjonen av hvert enkelt respirometer kan tilpasses så lenge kammeret forblir lufttett. Men jo lenger, tynnere mikropipetter tilby mer presisjon enn kortere. Bruken av det ytre kammer kan være valgfritt så lenge det ikke er noen vesentlige omgivelses-temperatur-og trykkendringer for å kompromittere eksperimentet. Dette kan bestemmes ved analyse av den negative kontroll, og en stor variasjon innen biologiske prøvemålinger. Dessuten kan CO2 absorbent være av en hvilken som helst variasjon, så lenge det ikke er toksisk for fløgner (f.eks, kaliumhydroksid). Det er av største betydning å ha en negativ kontroll for å sikre at teknikken virker på riktig måte. Det vanligste problemet er at respirometer å ikke tettes helt. Hvis dette er tilfelle, så målingen vil være sammenlignbar med den negative kontrollen. Ytterligere problemer kan oppstå på grunn av fluer som ikke har hatt tid til å komme seg etter bedøvelsen eller har omkommet.
Den mest kritiske trinnet i denne protokollen er byggingen av respirometer. Som nevnt ovenfor, må den respirometer være lufttett. Å feste en mikropipette til den større pipette kammeret må skje med riktig lim. En mer gummi-aktig limet har fungert best. Det anbefales å inspisere respirometers under et mikroskop for å observere noen kompromisser i den limte struktur etter ferdigstillelse. I tillegg, er forsegling av respirometer etter at fluene er blitt plassert inne i meget viktig. Bruken av kitt hsom er funnet å fungere best og svikter sjelden. Parafin er blitt funnet å fungere svært dårlig, og bør unngås. Den væske som brukes til å måle gassvolumet er også svært viktig og bør være manometrisk. Vann er derfor det beste valget. Bruken av blekk er ikke anbefalt, fordi det kan herde i kapillarrøret slik at respirometer ubrukelig. Det er også viktig å ikke bruke reproduserende hunner, som vi la merke til at deres CO 2-produksjon kan være svært variabel. I tillegg er en alder av fluene er derfor viktig fluene som blir sammen bør være av samme alder. I vår test brukte vi fem dager gamle hanner. Den genetiske bakgrunnen til fluene er også viktig. Kontroll fluer bør være av samme genetiske bakgrunnen sammenlignet med mutantene. Dataene kan også bli presentert som (mL / t / mg) ved å måle massen av fluene etter at analysen utføres hvis det er betydelige forskjeller i størrelsen av fluer. I våre hender, veier en vill type flue 0,80 ± 0,11 mg (n = 180). Det skal også påpekes at under tidsberegningen av eksperimentet, er verdiene for den gjennomsnittlige forbrenning oppnås. Man har også funnet at det er mulig å måle en enkelt fly, men vi har oppnådd den høyeste presisjon ved hjelp av 3-5 fluer. Den er tilgjengelig i respirometer for fluer plass er nok at de ikke føler seg overbefolket, men på samme tid de ikke har plass til å gå intensivt: derfor defekte geotaxis bør ikke ha noen effekt på nivået av CO 2-produksjon.
Fluer har lenge vært etablert som en av de store modellorganismer for å studere menneskelige sykdommer som er relatert til utviklingsbiologi, cellebiologi, og nevrobiologi. En rekke nyere undersøkelser har vist at fluene kan lett brukes for å studere energi homeostase i tillegg (gjennomgått i 12, 13). Metoden som presenteres her kan lett brukes i genetiske skjermer for å identifisere nye molekylære komponenter muligens involvert i å kontrollere megmetabolske tilstand før du kjøper mer nøyaktig og dyrt utstyr. Så langt de fleste slike skjermer ble gjort bare i cellekultur som indikerer at mer avanserte studier er garantert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Max-Planck Society for å finansiere vår forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BlauBrand IntraMark 50 µl micropipettes | VWR | 612-1413 | |
| Soda Lime | Wako | CDN6847 | |
| Eosine | Sigma | 031M4359 | Any dye that can create visible colorization of liquid can be used |
| Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber | VWR | 21432-761 | Any transparent glass chamber that can be closed with the lid |
| Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit | Flinn | FB1438 | |
| Power Gel Glue | Pritt | ||
| 1 ml pipett tips | Any | ||
| Foam | Any | ||
| Plaesticine Putty | Any | ||
| Scalpel | Any | ||
| Tweezers | Any |
References
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Testing the "rate of living" model: further evidence that longevity and metabolic rate are not inversely correlated in Drosophila melanogaster. J Appl Physiol. 97, 1915-1922 (2004).
- Ross, R. E. Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 46, 1477-1480 (2000).
- van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Selected contribution: long-lived Drosophila melanogaster. lines exhibit normal metabolic rates. J Appl Physiol. 95, 2605-2613 (2003).
- Hulbert, A. J., et al. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 39, 1137-1143 (2004).
- Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. Dopamine modulates metabolic rate and temperature sensitivity in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 7, (2012).
- Takeuchi, K., et al. Changes in temperature preferences and energy homeostasis in dystroglycan mutants. Science. 323, 1740-1743 (2009).
- Kucherenko, M. M., Marrone, A. K., Rishko, V. M., Magliarelli Hde, F., Shcherbata, H. R. Stress and muscular dystrophy: a genetic screen for dystroglycan and dystrophin interactors in Drosophila. identifies cellular stress response components. Developmental Biology. 352, 228-242 (2011).
- Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Wiek, R., Gopfert, M. C., Shcherbata, H. R. Hyperthermic seizures and aberrant cellular homeostasis in Drosophila dystrophic. muscles. Scientific Reports. 1, 47 (2011).
- Khazaeli, A. A., Van Voorhies, W., Curtsinger, J. W. Longevity and metabolism in Drosophila melanogaster: genetic correlations between life span and age-specific metabolic rate in populations artificially selected for long life. Genetics. 169, 231-242 (2005).
- Elia, M. Energy equivalents of CO2 and their importance in assessing energy expenditure when using tracer techniques. The American Journal of Physiology. 260, (1991).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Bharucha, K. N. The epicurean fly: using Drosophila melanogaster. to study metabolism. Pediatric Research. 65, 132-137 (2009).
- Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biology. 11, 38 (2013).
