Summary
Los trastornos metabólicos se encuentran entre una de las enfermedades más comunes en los seres humanos. El modelo de organismo genéticamente manejable D. melanogaster se puede utilizar para identificar nuevos genes que regulan el metabolismo. Este artículo describe un método relativamente sencillo que permite el estudio de la tasa metabólica en las moscas de la medición de su producción de CO 2.
Abstract
Trastornos metabólicos son un problema frecuente que afecta a la salud humana. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos que regulan el metabolismo es una tarea científica fundamental. Muchos de los genes que causan enfermedades en los seres humanos tienen un homólogo mosca, haciendo Drosophila un buen modelo para estudiar las vías de señalización implicadas en el desarrollo de diferentes trastornos. Además, la maleabilidad de Drosophila simplifica pantallas genéticos para ayudar en la identificación de nuevas dianas terapéuticas que puedan regular el metabolismo. Con el fin de realizar una pantalla de este tipo es necesario un método sencillo y rápido para identificar los cambios en el estado metabólico de las moscas. En general, la producción de dióxido de carbono es un buen indicador de los gastos de oxidación del sustrato y la energía que proporciona información sobre el estado metabólico. En este protocolo se introduce un método simple para medir el CO 2 de salida de las moscas. Esta técnica potencialmente puede ayudar en la identificación de las perturbaciones genéticos que afectan la tasa metabólica.
Introduction
El ciclo bioquímico de Krebs genera ATP a través de la oxidación de acetato derivado de los carbohidratos, las grasas y las proteínas que producen CO 2. En Drosophila, O 2 de entrada está directamente relacionada con la producción de CO 2 y refleja el nivel de metabolismo 1. Por lo tanto, la medición de CO 2 de salida ha utilizado con éxito en los estudios relacionados con el envejecimiento y el metabolismo de 2-5. Aquí nuestro laboratorio ha modificado montajes experimentales previamente diseñados, lo que permite la medición de la producción de CO 2 en un máximo de dieciocho muestras sin necesidad de equipo especializado. Otros y hemos utilizado anteriormente este método para mostrar las diferencias en las tasas metabólicas en las moscas que son deficientes en la proteína de la distrofia muscular asociada, Distroglicano (Dg) 6-8.
O 2 utilizado para el metabolismo oxidativo se convierte en CO 2, que es expulsado como residuos respiratoria. La construcciónción de respirómetros hechas a mano se describe que permite la determinación de la tasa de O 2 consumido. Las moscas se colocan en un recipiente sellado con una sustancia que absorbe CO 2 expulsado, eliminando de manera eficiente desde la fase gaseosa. El cambio en el volumen de gas (disminución de la presión) se mide por el desplazamiento de fluido en un capilar de vidrio unido a la respirómetro cerrado.
La principal ventaja de esta técnica sobre otros es el costo. Estudios previos han medido la producción de CO2 por Drosophila utilizando analizadores de gases y sistemas de respirometría técnicamente avanzados 1,9. A pesar de el equipo más complejo, la sensibilidad del método descrito aquí es similar a los valores reportados (Tabla 1). Además, varios otros grupos han utilizado variaciones de esta técnica para determinar las tasas metabólicas relativas en Drosophila 4-6. Por lo tanto, este ensayo se puede usar para generar reliable, datos reproducibles relevantes para el metabolismo de Drosophila sin la compra de equipo especializado que puede ser configurado en cualquier laboratorio y se puede utilizar con fines educativos.
En general, las técnicas aceptadas para determinar el metabolismo de un organismo es medir el CO 2 producido, el O 2 consumido, o ambos 3,4,9. Aunque, se puede suponer que un equivalente de O 2 genera un equivalente de CO 2, la relación precisa de CO 2 generado es dependiente sobre el sustrato metabólico utilizado 10. Por lo tanto, para determinar con precisión la tasa metabólica en unidades de energía que es necesario medir ambos O 2 consumido y CO 2 producido. Debido a esto, el método descrito aquí es específicamente relevante para la comparación de las diferencias en la producción de CO 2 entre los animales y no el valor absoluto. Nuestra técnica se integra animales CO producción múltiple 2 durante un período de timE (1-2 horas) y por lo tanto devuelve un promedio de la actividad de los animales. Si hay razones para creer que los animales de experimentación son menos activos que los animales de control de la medición podría reflejar diferentes niveles de actividad y no necesariamente el metabolismo.
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Protocol
1. Preparación de respirómetros
- Corte la punta de la pipeta 1.000 l con una hoja de afeitar para permitir la inserción de los capilares de la micropipeta 50 l, tratar de conseguir la punta de la pipeta lo más recto posible.
- Coloque un pedazo de espuma en la pipeta y presione hacia abajo en la punta de la pipeta.
- Agregue una pequeña cantidad de absorbente de CO 2 y de contenerlo por una segunda pieza de espuma.
- Aplicar el pegamento en el lugar donde se inserta la micropipeta en la punta de la pipeta.
- Deje el respirómetro durante la noche para permitir que el pegamento se seque.
Un diagrama esquemático de un respirómetro se muestra en la Figura 1A.
2. Preparación de la cámara de medición
- Preparar la solución de cámara de mezclando agua con eosina en una relación que se traducirá en la coloración visible.
- Verter la solución de eosina / agua en la cámara.
- Etiqueta de uno de los lados de la cámara con una escala de centímetros.
- Etiquetar los respirómetros individuales con un marcador.
- Anestesie moscas utilizando un método alternativo a CO 2 y colocar 3-5 moscas del genotipo deseado dentro de cada respirómetro.
- Selle las respirómetros firmemente en la parte superior el uso de masilla de plastilina.
- Permitir que las moscas se recuperen de la anestesia durante aproximadamente 15 min.
- Preparar una respirómetro sin moscas, que se utilizó como control atmosférica.
4. Realización del experimento
- Cuelgue las respirómetros en la cámara uniendo un soporte de tubo Eppendorf de 1,5 ml que está abierto en la parte superior y la parte inferior en la parte superior de la cámara.
- Inserte respirómetros con la punta de la micropipeta hacia la cámara que permite que la punta se sumerja en la solución de color.
- Añadir vaselina entre la cubierta de la tapa y la cámara para proporcionar aislamiento más fuerte de temperatura y presión fluctluaciones.
- Cierre la tapa y deje que el sistema se equilibre durante 15 min.
- Tome una fotografía de la cámara de asegurarse de que el nivel de líquido dentro de cada micropipeta es visible y también lo es la escala (véase el ejemplo mostrado en la Figura 1B).
- Después de 1-2 horas, tomar otra foto.
- Cuando se termina el experimento, eliminar las moscas de respirómetros y sopesar si se desea o transferirlos de nuevo al frasco si es necesario más.
5. Análisis de los resultados
- Abrir las imágenes adquiridas utilizando el software ImageJ 11.
- Utilizando la escala en cada imagen, ajuste la escala de píxeles en el software.
- Medir la distancia (Dd) que el líquido viajó desde un punto de referencia determinado en las imágenes tomadas al principio (d1) y al final del experimento (d2). Un ejemplo de esquema se muestra en la figura 1C.
- Calcular la cantidad de CO2 producido (l / h / mosca) con la fórmula:
R = radio del tubo micropipeta en centímetros
Dd = distancia que el líquido se ha movido en la micropipeta de muestras de ensayo se mide en centímetros
? C = distancia que el líquido se ha movido en la micropipeta de la muestra de control negativo (sin moscas)
n = número de moscas utilizadas
h = horas
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Representative Results
Con el fin de demostrar que el método es sensible que mide la producción de CO 2 de tipo salvaje (Oregon R) macho vuela a 18, 25 y 29 ° C y las moscas mutantes para Dg. Las moscas se elevaron a 25 ° C y luego se desplazan a la temperatura experimental durante 5 días antes de la medición. Como era de esperar para esta especie ectotérmico, la cantidad de CO 2 producido aumentó con la temperatura (Figura 2). Hemos en el pasado muestran que una dieta libre de azúcar reduce la tasa metabólica de ambos de tipo salvaje y mutante vuela Dg 7. La pérdida de Dg conduce a aumento de los niveles metabólicos (Figura 2).
Figura 1. Configuración para la medición de la producción de CO 2 en las moscas. A. Esquema que muestra tque la construcción de la respirómetro individual. B. La fotografía de la cámara durante la medición de CO 2. Cartas marcan la posición de respirómetros. Verticales indican los números de la escala en centímetros. C. Esquema que muestra los cambios durante el experimento. La línea verde indica punto de referencia (d1), el azul indica la posición final del líquido después de 2 horas (d2). Dd es la distancia que el líquido ha viajado en la micropipeta.
Figura 2. Producción de CO 2 en las moscas a diferentes temperaturas y en los mutantes Dg. Temperatura del cuerpo se correlaciona positivamente con la producción de CO 2 en Drosophila y se incrementa de manera significativa en los mutantes Dg. Las barras de error indican SEM de cuatro experimentos individuales, *** p ≤ 00.01.
| (L / fly x horas) | Equipo utilizado | Referencia |
| 2-3 de CO 2 | CO 2 analizador de gas | (Van Voorhies, Khazaeli et al. 2004) |
| 4,68 ± 1,04 CO 2 | CO 2 Sistema respirometría | (Khazaeli, Van Voorhies et al. 2005) |
| 2.9 a 6.2 O 2 | Del mismo modo respirómetros diseñados | (Hulbert, Clancy et al. 2004) |
| 2,20 ± 0,15 O 2 | Descritos respirómetros aquí artesanales | (Kucherenko, Marrone et al. 2011) |
| * Los valores de la tabla son los estudios que informan de los valores numéricos de las moscas de medida a 25 ° C |
Tabla 1. Comparaciónde las diferentes técnicas que se utilizan para medir la producción de CO 2 por Drosophila.
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Discussion
En este protocolo, se describe un método de bajo costo y confiable para medir la producción de CO 2 en las moscas. Hemos encontrado que este experimento es fácil, rápido de realizar y genera datos reproducible que está de acuerdo con otros estudios 1, 6, 9. El protocolo descrito aquí se puede modificar fácilmente para adaptarse a presupuesto y materiales disponibles de cualquier laboratorio. La construcción de cada respirómetro individuo puede adaptarse, siempre y cuando la cámara permanece hermético. Sin embargo, cuanto más tiempo, micropipetas más delgados ofrecen más precisión sobre los más cortos. El uso de la cámara exterior puede ser opcional siempre y cuando no hay cambios de temperatura y presión ambientales significativos a comprometer el experimento. Esto puede ser determinado por análisis del control negativo y una gran variabilidad dentro de las mediciones de muestras biológicas. Además, el absorbente de CO 2 puede ser de cualquier variedad con tal de que no es tóxico para el Fmentiras (por ejemplo, hidróxido de potasio). Es de suma importancia contar con un control negativo para asegurar que la técnica funciona correctamente. El problema más común es que el respirómetro de no ser sellado completamente. Si este es el caso, entonces la medición será comparable a la del control negativo. Otros problemas pueden surgir debido a las moscas que no han tenido tiempo para recuperarse de la anestesia o han perecido.
El paso más crítico en este protocolo es la construcción de la respirómetro. Como se señaló anteriormente, el respirómetro debe ser hermético. La unión de la micropipeta a la cámara de pipeta más grande debe hacerse con el pegamento correcta. Un adhesivo más parecido a la goma ha funcionado mejor. Se recomienda inspeccionar los respirómetros bajo un microscopio para observar cualquier compromiso en la estructura pegada después de su finalización. Además, el sellado de la respirómetro después de moscas se han colocado en el interior es muy importante. El uso de masilla hcomo ha encontrado para trabajar mejor y no con poca frecuencia. La parafina se ha encontrado para trabajar muy mal y debe ser evitado. El líquido que se utiliza para medir el volumen de gas es también muy importante y debe ser manométrica. Por lo tanto, el agua es la mejor opción. No se recomienda el uso de la tinta, ya que puede endurecerse en el capilar haciendo que el respirómetro inútil. También es fundamental no utilizar la reproducción de las hembras, ya que nos dimos cuenta de que su producción de CO 2 puede ser muy variable. Además de la edad de moscas es importante, por lo tanto, las moscas que se comparan deben ser de la misma edad. En nuestra prueba hemos utilizado machos 5 días de edad. La base genética de las moscas también es importante. Las moscas de control deben ser del mismo fondo genético en comparación con los mutantes. Los datos también se pueden presentar como (l / h / mg) mediante la medición de la masa de las moscas después de realizar el ensayo si hay diferencias significativas en el tamaño de las moscas. En nuestras manos, una mosca de tipo salvaje pesa 0,80 ± 0,11 mg (n = 180). También hay que señalar que, durante la temporización del experimento, se obtienen los valores de la tasa metabólica media. También hemos encontrado que es posible medir una mosca individual, pero hemos logrado la más alta precisión utilizando 3-5 moscas. El espacio disponible en respirómetro para las moscas es suficiente que no se sienten hacinamiento, pero al mismo tiempo no tienen espacio para caminar intensamente: por lo tanto, geotaxis defectuosos no deben tener ningún efecto sobre el nivel de producción de CO 2.
Las moscas de largo se han establecido como uno de los principales organismos modelo para el estudio de enfermedades humanas que están relacionados con la biología del desarrollo, biología celular, y la neurobiología. Un número de estudios recientes han demostrado que las moscas pueden ser fácilmente utilizados para estudiar la homeostasis de energía, así (revisado en 12, 13). El método que aquí se presenta se puede utilizar fácilmente en pantallas genéticas para identificar nuevos componentes moleculares posiblemente implicados en el control de la meEstado tabolic antes de comprar un equipo más preciso y caro. Hasta ahora, la mayoría de tales pantallas se realiza sólo en el cultivo celular que indica que se requieren estudios más avanzados.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a la Sociedad Max-Planck para la financiación de nuestra investigación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BlauBrand IntraMark 50 µl micropipettes | VWR | 612-1413 | |
| Soda Lime | Wako | CDN6847 | |
| Eosine | Sigma | 031M4359 | Any dye that can create visible colorization of liquid can be used |
| Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber | VWR | 21432-761 | Any transparent glass chamber that can be closed with the lid |
| Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit | Flinn | FB1438 | |
| Power Gel Glue | Pritt | ||
| 1 ml pipett tips | Any | ||
| Foam | Any | ||
| Plaesticine Putty | Any | ||
| Scalpel | Any | ||
| Tweezers | Any |
References
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