En protokol til at inficere<em> Caenorhabditis elegans</em> Med<em> Salmonella typhimurium</em
Summary
C. elegans har vist sig som en ny genetisk model til at studere vært-patogen interaktioner. Her beskriver vi en protokol til at inficere C. elegans med Salmonella typhimurium kombineret med den dobbelt-strenget RNAi interferens teknik til at undersøge, hvilken rolle værtsgener i forsvaret mod Salmonella infektion.
Abstract
I det sidste årti, C. elegans er opstået som et invertebrat organisme for at studere samspillet mellem værter og patogener, herunder værtens forsvar mod gram-negativ bakterie Salmonella typhimurium. Salmonella etablerer vedvarende infektion i tarmen C. elegans og resulterer i tidlig død af inficerede dyr. Der er identificeret en række immunitetsstandarder mekanismer i C. elegans at forsvare sig mod Salmonella-infektioner. Autophagy en evolutionært bevaret lysosomale nedbrydningsvej, har vist sig at begrænse Salmonella replikation i C. elegans og pattedyr. Her er en protokol beskrevet at inficere C. elegans med Salmonella typhimurium, hvor ormene udsættes for Salmonella i en begrænset tid, svarende til salmonellainfektion hos mennesker. Salmonella infektion betydeligt forkorter levetiden for C. elegans </ Em>. Brug af afgørende autofagi genet BEC-1 som et eksempel, kombinerede vi denne infektion metode med C. elegans RNAi fodring tilgang og viste denne protokol kan bruges til at undersøge funktionen af C. elegans værtsgener i forsvaret mod Salmonella infektion. Da C. elegans hele genomet RNAi biblioteker er tilgængelige, protokollen gør det muligt at foretage omfattende screene for C. elegans gener, der beskytter mod salmonella og andre tarmpatogener hjælp genom-dækkende RNAi biblioteker.
Introduction
Den fritlevende jord rundorm Caenorhabditis elegans er en enkel og genetisk medgørlig model organisme bruges til at studere mange biologiske spørgsmål. C. elegans findes overvejende som selvstændige befrugtende hermafroditter. Hanner spontant dannes af ikke-disjunktion af X-kromosomet under gametogenese 1,2. Ved tilstedeværelse af rigelig mad, C. elegans løbende at udvikle gennem fire larvestadier til voksen. Temperatur også indflydelse C. elegans udvikling; hurtigere udvikling er observeret ved højere temperaturer. I laboratoriet C. elegans er dyrkes ved en standard temperatur på 20 ° C på agarplader med seedede bakterie Escherichia coli (stamme OP50) som fødevarer 1,2.
I det sidste årti, C. elegans har vist sig som en hvirvelløse organisme for at studere vært-patogen interaktioner 3-5. I naturen C. elegans spiser bakterier sin nutrient kilde 1,2. Dens normale bakterielle laboratorium mad, OP50, let kan erstattes med andre patogener til at undersøge samspillet mellem C. elegans og helst valgt patogen. Under disse betingelser, tarmen er det primære sted for infektionen. Faktisk har vist en bred vifte af bakterielle patogener, letalt inficere C. elegans 3-5.
Gram-negative bakterie Salmonella er en gastrointestinal patogen, der forårsager menneskelig fødevarebåren sygdom på verdensplan 6,7. C. elegans er en god model vært for Salmonella typhimurium, da denne bakterie replikater og udviser vedvarende tarminfektioner 8-10. C. elegans er blevet anvendt til at identificere både hidtil ukendt og tidligere kendt Salmonella virulensfaktorer 11. Interessant C. elegans immunsystemet succes begrænser Salmonella replikation. Det er blevet rapporteret tidligere at inhibition af autophagy gener gør øget Salmonella replikation i C. elegans, hvilket resulterer i tidlig død af inficerede orme 10. Macroautophagy (herefter kaldet autophagy) er en dynamisk proces, der involverer omlægning af subcellulære membraner til at udskille cytoplasma og organeller til levering til lysosomet for nedbrydningen 12. Autophagy er blevet rapporteret at begrænse Salmonella replikation i C. elegans og pattedyr 10,13.
C. elegans genomet var det første flercellede eukaryote genom sekventeret; det er lydhør over for RNAi behandling 14-16. Desuden kan RNAi administreres effektivt ved at udsætte orme at indtage bakterier indeholdende dobbeltstrenget RNA af målgenet, kaldet RNAi fodring 16,17. Hele genomet RNAi fodring biblioteker er blevet genereret for genom-dækkende RNAi screening 16,18. Heri en salmonellainfektion protocol kobles med RNAi fodring at tillade test C. elegans gener af interesse for deres evne til at beskytte mod Salmonella infektion.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans er en simpel genetisk model organisme, der spiser bakterier som sin næringskilde. Således er det nemt at sætte sin normale bakterielle mad med en tarm patogen til at undersøge samspillet mellem C. elegans og det valgte patogen. Heri beskrives en protokol er beskrevet at kombinere salmonellainfektion og C. elegans RNAi fodring behandling for at undersøge, hvilken rolle værtsgener i forsvaret mod Salmonella infektion. Tidligere infektion protokoller eksponere <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Diane Baronas-Lowell for kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af en FAU Charles E. Schmidt College of Science Seed Grant og en aldrende stipendium fra Ellison Medical Foundation til KJ
Materials
| LB Broth | Fisher | BP9723-500 | |
| XLD agar | EMD Chemicals | 1.05287.0500 | |
| Bacto Agar | Fisher | DF0140-01-0 | |
| Peptone | Fisher | BP1420-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S671-500 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C69-500 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | 12481C50 | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | |
| Petri Dish 95 x 15mm | Fisher | FB0875714G | |
| Petri Dish 60 x 15mm | Fisher | 08-757-13A | |
| Falcon Serological pipet | Fisher | 13-668-2 | |
| Falcon Express Pipet-Aid | Fisher | 13-675-42 | |
| MaxQ6000 shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE6000-7 | |
| Incubator | Percival | I-36DL |
References
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. . C. elegans II. , (1997).
- Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Aballay, A., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans as a host for the study of host-pathogen interactions. Curr Opin Microbiol. 5, 97-101 (2002).
- Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Caenorhabditis elegans: an emerging genetic model for the study of innate immunity. Nat Rev Genet. 4, 380-390 (2003).
- Mylonakis, E., Aballay, A. Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions. Infection and Immunity. 73, 3833-3841 (2005).
- Ford, M. W., et al. A descriptive study of human Salmonella serotype typhimurium infections reported in Ontario from 1990 to 1997. Can J Infect Dis. 14, 267-273 (2003).
- Voetsch, A. C., et al. FoodNet estimate of the burden of illness caused by nontyphoidal Salmonella infections in the United States. Clin Infect Dis. 38 Suppl 3, (2004).
- Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. M. Salmonella typhimurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1539-1542 (2000).
- Alegado, R. A., Tan, M. W. Resistance to antimicrobial peptides contributes to persistence of Salmonella typhimurium in the C. elegans intestine. Cell Microbiol. 10, 1259-1273 (2008).
- Jia, K., et al. Autophagy genes protect against Salmonella typhimurium infection and mediate insulin signaling-regulated pathogen resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14564-14569 (2009).
- Tenor, J. L., McCormick, B. A., Ausubel, F. M., Aballay, A. Caenorhabditis elegans-based screen identifies Salmonella virulence factors required for conserved host-pathogen interactions. Curr Biol. 14, 1018-1024 (2004).
- Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).
- Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
- . The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2, 1-10 (2001).
- Liang, J., Xiong, S., Savage-Dunn, C. Using RNA-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode C elegans. J. Vis. Exp. (72), (2013).
- Fraser, A. G., et al. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).
- Aballay, A., Ausubel, F. M. Programmed cell death mediated by ced-3 and ced-4 protects Caenorhabditis elegans from Salmonella typhimurium-mediated killing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 2735-2739 (2001).
- Melendez, A., et al. Autophagy genes are essential for dauer development and lifespan extension in C. elegans. Science. 301, 1387-1391 (2003).
