Summary
C. Элеганс стала новой генетической модели для изучения хост-патогенных взаимодействий. Здесь мы опишем протокол заразить C. Элеганс с Salmonella Typhimurium в сочетании с техникой помех РНК-интерференции двухцепочечной изучить роль генов хозяина в защите от сальмонеллезной инфекции.
Abstract
В последнее десятилетие, С. Элеганс стала беспозвоночных организма для изучения взаимодействий между хозяевами и патогенов, в том числе защите организма против грамотрицательных бактерий Salmonella Typhimurium. Сальмонелла устанавливает хронической инфекции в кишечнике С. Элеганс и приводит к ранней смерти инфицированных животных. Ряд механизмов иммунитета были выявлены в С. Элеганс защититься от сальмонеллы инфекций. Аутофагия, эволюционно консервативными деградация лизосомного пути, как было показано, ограничить репликацию Salmonella в С. Элеганс и у млекопитающих. Здесь, протокол описывается заразить C. Элеганс с Salmonella Typhimurium, в котором черви подвергаются Salmonella в течение ограниченного времени, подобно сальмонеллезной инфекции у человека. сальмонеллы инфекция значительно сокращает продолжительность жизни C. Элеганс </ EM>. Использование основного гена аутофагии ОЦК-1 в качестве примера, мы объединили этот метод инфекции с C. Элеганс РНК-интерференции кормления подход и показал этот протокол может быть использован для изучения функцию C. Элеганс генов хозяина в защите от сальмонеллезной инфекции. Поскольку С. Элеганс целого генома RNAi библиотеки доступны, этот протокол позволяет всесторонне скрининга С. Элеганс гены, которые защищают от сальмонеллы и других кишечных патогенов с использованием генома RNAi библиотеки.
Introduction
Свободно живущих нематод почвы Caenorhabditis Элеганс является простым и генетически послушный модель организма используется для изучения многих биологических вопросы. С. Элеганс преимущественно существует как самоопыляющихся гермафродитов. Самцы спонтанно генерируется нерасхождения Х-хромосомы во время гаметогенеза 1,2. При наличии обильной пищи, C. Элеганс постоянно развивать через четыре личиночной стадии к взрослым. Температура также влияет на С. развитие Элеганс; быстрое развитие наблюдается при более высоких температурах. В лаборатории С. Элеганс культивируют при стандартной температуре 20 ° С на чашках с сеяной бактерия кишечной палочки (штамм OP50) в качестве пищи 1,2.
В последнее десятилетие, С. Элеганс стала беспозвоночных организма для изучения хост-патогенных взаимодействий 3-5. В природе C. Элеганс питается бактериями, как его Нутриэнт Источник 1,2. Его нормальное бактериальная лаборатория пищевой, OP50, могут быть легко заменены другими патогенами изучить взаимодействие между С. Элеганс и любой выбранной патоген. В этих условиях, кишечник является основной сайт инфекции. В самом деле, широкий спектр бактериальных патогенов, как было показано смертельно заразить C. Элеганс 3-5.
Грамотрицательная бактерия сальмонелла является желудочно-патогенный микроорганизм, который вызывает человеческую болезней пищевого происхождения во всем мире 6,7. С. Элеганс является хорошей моделью хост для Salmonella Typhimurium как эта бактерия размножается и имеет постоянные кишечных инфекций 8-10. С. Элеганс был использован для идентификации как роман и ранее известный Сальмонелла факторов вирулентности 11. Интересно, что С. Элеганс иммунная система успешно ограничивает Salmonella репликацию. Сообщалось ранее, что inhibition генов аутофагии оказывает повышенную репликацию Salmonella в С. Элеганс, в результате ранней смерти зараженных червями 10. Macroautophagy (далее по тексту аутофагии) представляет собой динамичный процесс, включающий перестройку субклеточных мембран поглощать цитоплазму и органеллы для доставки в лизосомы для деградации 12. Аутофагия сообщалось ограничить репликацию Salmonella в С. Элеганс и у млекопитающих 10,13.
С. Элеганс геном был первый многоклеточный генома эукариот последовательность; это ответ на РНК-интерференции лечения 14-16. Кроме того, RNAi можно вводить эффективно при условии червей глотать бактерии, содержащие двухцепочечную РНК гена-мишени, известный как RNAi кормления 16,17. Весь геном РНК-интерференции библиотеки кормления были получены для генома РНК-интерференции скрининга 16,18. Здесь, сальмонеллы инфекция протокол соединен с РНК-интерференции кормления, чтобы тестирование C. Элеганс гены интереса для их способности защиты от сальмонеллезной инфекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. XLD (Ксилоза Лизин Дезоксихолат) Агар Плиты
XLD агар является селективным ростовую среду для Salmonella, которая появляется в виде черных колоний на чашках с агаром XLD. Однако, если нет проблем загрязнения, регулярное LB пластины могут быть заменены.
- Взвесить 5,5 г XLD агар и ресуспендируют в 5 мл деионизированной воды.
- Тщательно перемешать, пока все агар не мокрая. Добавить 95 мл деионизированной воды, пока все комки не будут удалены и среду полностью ресуспендировали.
- Кипятите среду до полного растворения (не автоклав).
- Охлаждают среду при комнатной температуре до 50 ° С
- Налейте 25 агар мл в каждом 95 х 15 мм (диаметр х высота) пластины (плиты запечатанные парафильмом можно хранить при температуре 4 ° С в течение до 1 месяца).
2. Нематода Рост Средний (NGM) РНК-интерференции для кормления Тарелки
Подготовка C. Элеганс NGM пластины была описана ранее 19. Здесь процедура кратко описаны добавить ампициллин антибиотиками и RNAi химического индуктора изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) в средствах массовой информации NGM чтобы питающие пластинки RNAi.
- Растворите 3 г NaCl и 2,5 г бактопептон в 1 л деионизированной воды.
- Добавить 17 г Bacto агар в средствах массовой информации.
- Автоклав носитель в течение 45 мин и охлаждают носители до 50 ° С на водяной бане.
- Добавить следующие растворы: 1 холестерина мл (5 мг / мл в 95% этаноле), 1 мл 1 М CaCl 2, 1 мл 1 М MgSO 4, и 25 мл 1 М калий-фосфатного буфера (рН 6,0). Все хорошо перемешать.
- Добавить 1 мл 1 М IPTG и 500 мкл ампициллин (100 мг / мл в стерильной воде).
- Смешайте раствор и разлить в 60 х 15 мм (диаметр х высота) чашки Петри с использованием помощь пипетки и 25 мл серологические пипетки следующие стерильных процедур. Заполните каждую тарелку с 12 мл агара. Плиты можно хранить при температуре 4 ° С в течение до 1 месяца.
Существенным ген аутофагия ОЦК-1 используется в качестве примера для изучения функции гена хозяина в защите от сальмонеллезной инфекции. Экспериментальные методики, проиллюстрированы на рисунке 1 и в таблице 1. Протокол для приготовления RNAi-обработанных животных инфекции следует, со дня каждой экспериментальной стадии, приведенной в круглых скобках.
- Инокулировать ОЦК-1 RNAi подачу и контроль пустой вектор L4440 RNAi кормления бактерии, помещая чешуйчатого -80 ° С замороженных бактерий в 2 мл LB среды с добавкой 100 мг / мл ампициллина (день 1). Повторите этот шаг один раз в неделю в течение всего эксперимента, чтобы иметь свежие бактерии RNAi. Храните культуру в 4 ° C холодильник, когда не используется.
- Seed 100 мл ночной РНК-интерференции бактериальной культуры на РНК-интерференции пластин. Подготовьте три ОЦК-1 РНК-интерференции и три управления пустой VЭктор RNAi пластины. Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение ночи (день 2).
- Снимите панели RNAi от 37 ° C инкубатора и дайте им остыть до комнатной температуры на скамейке. Возьмите сытых L4 дикого типа N2 гермафродитов и передавать их на BEC-1 РНК-интерференции и контролировать пустой вектор RNAi пластины. Поместите три червей на чашку, на трех экземплярах пластин. В тот же день, подготовить RNAi пластины, как описано в п. 3.2 (День 3).
- Инкубируйте пластин RNAi с червями в инкубаторе 20 ° C для 36-40 ч и передачи червей в свежих соответствующих РНК-интерференции пластинок, полученных в шаге 3.3. После черви передаются, инкубировать пластин в 20 ° C инкубаторе в течение 64 ч (день 4).
4. Подготовьте сальмонеллы для инфекции
- Подряд Сальмонелла -80 ° С замороженные товара на складе 1 XLD агар пластины и инкубировать пластины при температуре 37 ° С в течение ночи (5-й день
- Выберите хорошо изолированный черный Salmonella колонию и привить его в 2 мл LB среды при 37 ° С при встряхивании в течение ночи (День 6).
- Семя 80 мл Сальмонелла ночной культуры на 1 С. Элеганс 60 х 15 мм (диаметр х высота) NGM агар и подготовить 6 пластин в общей сложности. Инкубируйте пластин при комнатной температуре в течение 6 часов. Бактериальная культура должна высохнуть и образуют газон на тарелке (День 7).
5. Infect РНК-интерференции обработанные черви с сальмонеллой
- Трансфер ОЦК-1 РНК-интерференции обращению и контролировать пустой вектор RNAi обращению L4 N2 гермафродитов (потомства червей, созданных на шаге 3), чтобы Salmonella пластин. Наведите 40 червей на чашку на 3 пластины для каждой группы. Выдержите червь пластин при 20 ° С в течение 48 ч (День 7).
- Подготовьте набор свежих RNAi пластин, как описано в шагах 3.1 и 3.2 (День 7 и
- Через 48 ч инфекции, трансфер Salmonella-инфицированных червей в соответствующие РНК-интерференции пластинок, полученных в шаге 5.2 и инкубировать при 20 ° C (День 9).
6. Выживание Анализ
- Оценка выживание червей ежедневно и передать червей к свежим соответствующих РНК-интерференции пластин во время откладки яиц времени. Подготовьте набор свежих RNAi пластин до каждой передаче червя, как описано в шагах 3.1 и 3.2. Прикоснитесь к червя тело (голова, средняя часть и хвост) аккуратно с платиновой проволоки конец плоский. Червь забил, как мертвый, если не наблюдается движение тела червя.
- Оценка выживание червей ежедневно или через день, и передать червей к свежим соответствующих РНК-интерференции пластин два раза в неделю после черви остановить откладывать яйца.
- После того как все черви умирают, бассейн данные выживаемости от трех экземплярах пластин, как один набор данных. Входные данные выживаемости каждой группы в соответствующем статистического программного обеспечения, такие как GraphPad PRISM генерировать кривые выживаемости и выполнять анализ выживаемости Каплана-Мейера. Весь эксперимент повторяется по крайней мере один раз, чтобы подтвердить заключение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
При 20 ° С, средняя продолжительность жизни дикого типа N2 червей 17 дней (фиг. 2A и таблица 2). Salmonella инфекции значительно уменьшает средний срок службы N2 червей до 10,5 дней (р = 0,0002, лог-ранговый критерий) (Фигура 2А ).
Если С. Ген Элеганс играет важную роль в защите от инфекции сальмонеллы, он предсказал, что его ингибирование придаст восприимчивость к сальмонеллезной инфекции. На самом деле, по сравнению с Salmonella-инфицированных управления RNAi обращению N2 животных, средний срок службы Salmonella-инфицированных ОЦК-1 РНК-интерференции обращению N2 червей снизилась с 10,5 до 9 дней (р <0,0001, лог-ранговый тест) (рис. 2B и таблица 2). Максимальная продолжительность жизни резко сокращено на 14 дней (от 24 дней до 10 дней, фиг.2В и таблица 2). Кроме того, будетс-1 РНК-интерференции не имеет очевидное влияние на продолжительности жизни N2 червей, которые не заражены сальмонеллами (р = 0,2593, лог-ранговый критерий) (рис. 2С и табл. 2), что свидетельствует о Заражения сальмонеллой, не BEC-1 лечение RNAi, уменьшает продолжительность жизни Сальмонелла-инфицированных ОЦК-1 РНК-интерференции обращению червей. Кроме того, ОЦК-1 является важным геном в С. Элеганс защита от сальмонеллезной инфекции.
Рисунок 1. Блок-схема экспериментальных процедур.
Рисунок 2. Ингибирование ОЦК-1 гена по РНК-интерференции дает SUSвосприимчивость к сальмонеллезной инфекции в С. Элеганс. переменного тока) Выживание кривые дикого типа N2 животных, получавших либо управления пустым вектором РНК-интерференции или ОЦК-1 гена РНК-интерференции следующем 2-дневного воздействия Salmonella Typhimurium или непатогенных кишечной палочки при 20 ° C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этот показатель.
Таблица 1. Протокол сроки сальмонеллы инфекция.
Таблица 2. Статистический анализпродолжительность жизни данных на рисунке 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
С. Элеганс является простым генетическая модель организм, который питается бактериями качестве источника питательных веществ. Таким образом, можно легко заменить его нормальной бактериальной пищи с кишечным патогеном исследовать взаимодействие между С. Элеганс и выбрали патоген. При этом протокол описывается объединить инфекции Salmonella и С. Элеганс РНК-интерференции кормления лечение изучить роль генов хозяина в защите от сальмонеллезной инфекции. Предыдущие протоколы инфекции подвергайте C. Элеганс червей в патогенных бактерий, включая сальмонеллу в течение своей жизни 20. В настоящем протоколе, сальмонеллы заражает червей в двухдневный срок. не После этого черви больше не подвергается Salmonella. Это сальмонеллы инфекция значительно снижает продолжительность жизни C. Элеганс животных дикого типа. Таким образом, вторглись Сальмонелла повторить внутри червей и убивать животных 10 сальмонеллы имитирует инфекции человеку сальмонеллы, которые должны помочь раскрыть полезную информацию, чтобы понять человека болезней пищевого происхождения, вызванные сальмонеллезной инфекции. Кроме того, этот протокол сочетает в себе лечение кормления RNAi с сальмонеллезной инфекции, что позволяет протестировать любой генов-кандидатов, которые могли бы быть вовлечены в защите организма против инфекции сальмонеллы, особенно когда генетические мутанты не доступны. Ген аутофагия ОЦК-1 как известно, участвует в защите от сальмонеллезной инфекции используется в качестве примера в настоящем исследовании. ОЦК-1 мутации смертельны 21, который предотвращает тестирования свою роль в защите от сальмонеллезной инфекции у взрослых. Использование текущий протокол, было показано, что ингибирование ОЦК-1 на РНК-интерференции дает восприимчивость к сальмонеллезной инфекции в С. Элеганс. В настоящем исследовании, N2 дикие черви типа Feг с L4440 бактерий имеют аналогичную продолжительность жизни как животных, которых кормили с OP50. Животные начинают умирать вокруг 6-й день, а максимальная продолжительность жизни составляет около четырех недель. N2 червей инфицированные сальмонеллами жить несколько дней короче. Напротив, ОЦК-1 RNAi обращению черви заражаются сальмонеллой умирают примерно в два раза быстрее, чем у контрольных животных, хотя дата начала для животных, чтобы умереть в обеих группах только несколько дней друг от друга (рис. 2). Весь эксперимент длится около 1 месяца.
В этом протоколе, координация RNAi кормления и подготовки Salmonella требуется, чтобы РНК-интерференции обработанные L4 стадии гермафродиты подвергаются сальмонеллезной инфекции. Типичный срок от используемого протокола в лаборатории авторов описана в таблице 1. RNAi кормления бактерии получают еженедельно и бактериальная культура хранится при 4 ° С, когда не используется. Следует отметить, что на 7-й день, инфекция начнет 60; ч после Salmonella течение ночи культуры помещают на NGM пластин. В течение этого периода 6 ч, РНК-интерференции обработанные L4 N2 гермафродиты собирают из соответствующих ОЦК-1 и контролировать пустой вектор RNAi пластины. Неинфицированных черви используются в качестве контроля для определения того, сальмонеллы инфекция сокращает продолжительность жизни инфицированных червей и если ОЦК-1 процедура РНК-интерференции имеет никакого влияния на червя жизни.
В настоящее время, выживание С. Элеганс после заражения обычно используется для измерения патогена вирулентность 3-5. Тем не менее, РНК-интерференции ингибирование определенной C. Элеганс гены привести к снижению продолжительности жизни. Таким образом, следует быть осторожным при интерпретации данных. Когда эта ситуация имеет место, различные концентрации индуктора IPTG, RNAi, могут быть проверены, чтобы определить нужную концентрацию, что только влияет на реакцию хозяина к возбудителю инфекции без воздействия на животных жизни. Как сообщалось ранее <SUP> 10, концентрация 1 нМ ИПТГ был успешно использован для изучения роли аутофагии в IGF сигнализации опосредованного сопротивления патогенов в С. Элеганс.
Учитывая, что С. Элеганс генома была последовательность и C. Элеганс RNAi кормления библиотеки были получены 16,18, можно пересмотреть описанный протокол для выполнения генома RNAi скрининга для выявления всех генов хозяина, участвующих в защите против сальмонеллеза. Например, вместо использования медианы выживаемости для измерения вирулентности Salmonella, максимальное выживание используется. Более того, зараженные червями можно стерилизовать путем дополнения таблички с fluorodeoxyuridine, ингибитора синтеза ДНК. Таким образом, передача инфицированных червей не является необходимым, пока еда подается для предотвращения червей от голода. Эти модификации снизит нагрузку на экране высокой пропускной чрезвычайно. Этот тип масштабного исследования могут сHed свет на понимание реакции человека на сальмонеллезной инфекции, как многие биологические пути в С. Элеганс эволюционно сохраняется в организме человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора Дайан Баронас-Лоуэлла за критическое прочтение рукописи. Эта работа была поддержана FAU Charles E. Schmidt колледжа науки семян Грант и стареющего стипендии от Эллисона Медицинский фонд в KJ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth | Fisher | BP9723-500 | |
| XLD agar | EMD Chemicals | 1.05287.0500 | |
| Bacto Agar | Fisher | DF0140-01-0 | |
| Peptone | Fisher | BP1420-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S671-500 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C69-500 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | 12481C50 | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | |
| Petri Dish 95 x 15 mm | Fisher | FB0875714G | |
| Petri Dish 60 x 15 mm | Fisher | 08-757-13A | |
| Falcon Serological pipet | Fisher | 13-668-2 | |
| Falcon Express Pipet-Aid | Fisher | 13-675-42 | |
| MaxQ6000 shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE6000-7 | |
| Incubator | Percival | I-36DL |
References
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
- Brenner, S.
- Aballay, A., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans as a host for the study of host-pathogen interactions. Curr Opin Microbiol. 5, 97-101 (2002).
- Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Caenorhabditis elegans: an emerging genetic model for the study of innate immunity. Nat Rev Genet. 4, 380-390 (2003).
- Mylonakis, E., Aballay, A. Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions. Infection and Immunity. 73, 3833-3841 (2005).
- Ford, M. W., et al. A descriptive study of human Salmonella serotype typhimurium infections reported in Ontario from 1990 to 1997. Can J Infect Dis. 14, 267-273 (2003).
- Voetsch, A. C., et al. FoodNet estimate of the burden of illness caused by nontyphoidal Salmonella infections in the United States. Clin Infect Dis. 38 Suppl 3, (2004).
- Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. M. Salmonella typhimurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1539-1542 (2000).
- Alegado, R. A., Tan, M. W. Resistance to antimicrobial peptides contributes to persistence of Salmonella typhimurium in the C. elegans intestine. Cell Microbiol. 10, 1259-1273 (2008).
- Jia, K., et al. Autophagy genes protect against Salmonella typhimurium infection and mediate insulin signaling-regulated pathogen resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14564-14569 (2009).
- Tenor, J. L., McCormick, B. A., Ausubel, F. M., Aballay, A. Caenorhabditis elegans-based screen identifies Salmonella virulence factors required for conserved host-pathogen interactions. Curr Biol. 14, 1018-1024 (2004).
- Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).
- Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
- The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2, 1-10 (2001).
- Liang, J., Xiong, S., Savage-Dunn, C. Using RNA-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode C elegans. J. Vis. Exp. (72), (2013).
- Fraser, A. G., et al. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
- Stiernagle, T.
- Aballay, A., Ausubel, F. M. Programmed cell death mediated by ced-3 and ced-4 protects Caenorhabditis elegans from Salmonella typhimurium-mediated killing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 2735-2739 (2001).
- Melendez, A., et al. Autophagy genes are essential for dauer development and lifespan extension in C. elegans. Science. 301, 1387-1391 (2003).
