Ein Protokoll zum Infect<em> Caenorhabditis elegans</em> Mit<em> Salmonella typhimurium</em
Summary
C. elegans hat als neues genetisches Modell zur Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen entstanden. Hier sind wir zu C infizieren beschreiben ein Protokoll elegans mit Salmonella typhimurium in Verbindung mit dem Doppelstrang-RNAi-Interferenz-Technik, um die Rolle der Wirtsgene in der Verteidigung gegen Salmonellen-Infektion zu untersuchen.
Abstract
In den letzten zehn Jahren, C. elegans wurde als wirbellosen Organismus, um Wechselwirkungen zwischen Hosts und Krankheitserregern zu untersuchen entstanden, einschließlich der Wirtsabwehr gegen gram-negative Bakterium Salmonella typhimurium. Salmon stellt eine persistierende Infektion im Darm von C. elegans und führt zu frühen Tod der infizierten Tiere. Eine Anzahl von Immunitätsmechanismen in C identifiziert elegans gegen Salmonellen-Infektionen zu verteidigen. Autophagie ist ein evolutionär konservierten lysosomalen Abbauweg, wurde gezeigt, dass die Salmonellen-Replikation in C zu begrenzen elegans und in Säugern. Hier ist ein Protokoll beschrieben, um C zu infizieren elegans mit Salmonella typhimurium, wobei die Würmer zu Salmon für eine begrenzte Zeit, ähnlich wie Salmonella-Infektion beim Menschen ausgesetzt. Salmonella-Infektion signifikant die Lebensdauer verkürzt C. elegans </ Em>. Mit den wesentlichen Autophagie-Gen bec-1 als Beispiel kombinieren wir diese Infektion mit C. Verfahren elegans RNAi Fütterung Ansatz und zeigte dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Funktion von C zu untersuchen elegans Wirtsgene in der Verteidigung gegen Salmonellen-Infektion. Da C. elegans gesamte Genom RNAi-Bibliotheken zur Verfügung stehen, macht es möglich, dieses Protokoll umfassend Bildschirm für C. elegans Gene, die gegen Salmonellen und andere Krankheitserreger zu schützen, die Darmgenomweiten RNAi-Bibliotheken.
Introduction
Die frei lebenden Nematoden Caenorhabditis elegans Boden ist eine einfache und genetisch manipulierbaren Modellorganismus verwendet, um viele biologische Fragestellungen zu untersuchen. C elegans besteht überwiegend als selbstDünge Hermaphroditen. Männer sind spontan von Nicht-Trennung von dem X-Chromosom während gametogenesis 1,2 erzeugt. In Anwesenheit von reichlich Nahrung, C. elegans kontinuierlich über vier Larvenstadien zum Erwachsenen zu entwickeln. Temperatur beeinflusst auch C. elegans Entwicklung; schnellere Entwicklung bei höheren Temperaturen beobachtet. Im Labor C. elegans ist bei einer Standardtemperatur von 20 ° C auf Agar-Platten mit ausgesät Bakterium Escherichia coli (Stamm OP50) als Lebensmittel 1,2 kultiviert.
In den letzten zehn Jahren, C. elegans wurde als wirbellosen Organismus, Wirt-Pathogen-Interaktionen zu studieren 3-5 entstanden. In der Natur, C. elegans frisst Bakterien als nutrient 1,2 Quelle. Seine normale bakterielle Labor Essen, OP50, kann leicht mit anderen Krankheitserregern ersetzt werden, um die Wechselwirkungen zwischen C untersuchen elegans und jede gewählte Erregers. Unter diesen Bedingungen ist der Darm der primäre Ort der Infektion. In der Tat, eine breite Palette von bakteriellen Krankheitserregern hat sich gezeigt, tödlich infizieren C. elegans 3-5.
Das gram-negative Bakterium Salmonella ist ein Magen-Darm-Erreger, der menschlichen Lebensmittelvergiftungen verursacht weltweit 6,7. C elegans ist ein gutes Modell für die Host-Salmonella typhimurium, wie dieses Bakterium repliziert und zeigt anhaltende Darminfektionen 10.08. C elegans wurde verwendet, um sowohl neue als identifizieren und bisher bekannten Salmon Virulenzfaktoren 11. Interessanterweise ist die C elegans Immunsystem erfolgreich begrenzt Salmonellen-Replikation. Es wurde bereits berichtet, dass INHIBition der Autophagie-Gene macht erhöhte Salmonella-Replikation in C. elegans, was zu frühen Tod der infizierten Würmer 10. Makroautophagie (hierin als Autophagie bezeichnet) ist ein dynamischer Prozess, der die Neuanordnung der subzellulären Membranen Zytoplasma und Organellen für die Lieferung an den Lysosomen zum Abbau 12 zu maskieren. Autophagie wurde berichtet, dass die Salmonellen-Replikation in C zu begrenzen elegans und bei Säugetieren 10,13.
Die C. elegans Genoms war der erste mehrzellige eukaryotische Genom sequenziert; es reagiert auf RNAi-Behandlung 14-16. Außerdem kann RNAi effektiv, indem Würmer, Bakterien, die den doppelsträngigen RNA des Zielgens, wie RNAi Fütterung 16,17 bekannt einnehmen verwaltet werden. Gesamte Genom RNAi Fütterung Bibliotheken für genomweite RNAi Screening 16,18 generiert. Hierbei wird eine Salmonellen-Infektion proProtokoll ist mit RNAi-Zuführung zum Testen C erlauben gekoppelt elegans Gene von Interesse für ihre Fähigkeit, gegen Salmonellen-Infektion zu schützen.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans ist eine einfache genetische Modellorganismus, die Bakterien als Nährstoffquelle isst. Somit ist es einfach, seine normale Bakteriennahrung mit einer Darmerreger ersetzt, um die Wechselwirkungen zwischen C untersuchen elegans und das Pathogen ausgewählt. Hier ein Protokoll beschrieben, um Salmonellen-Infektion und C verbinden elegans RNAi Fütterung Behandlung, um die Rolle der Wirtsgene in der Verteidigung gegen Salmonellen-Infektion zu untersu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Diane Baronas-Lowell für das kritische Lesen des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von einem FAU Charles E. Schmidt College of Science Seed Grant und einer alternden Stipendium der Ellison Medical Foundation unterstützt KJ
Materials
| LB Broth | Fisher | BP9723-500 | |
| XLD agar | EMD Chemicals | 1.05287.0500 | |
| Bacto Agar | Fisher | DF0140-01-0 | |
| Peptone | Fisher | BP1420-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S671-500 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C69-500 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | 12481C50 | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | |
| Petri Dish 95 x 15mm | Fisher | FB0875714G | |
| Petri Dish 60 x 15mm | Fisher | 08-757-13A | |
| Falcon Serological pipet | Fisher | 13-668-2 | |
| Falcon Express Pipet-Aid | Fisher | 13-675-42 | |
| MaxQ6000 shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE6000-7 | |
| Incubator | Percival | I-36DL |
References
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