Un protocole d'infecter<em> Caenorhabditis elegans</em> Avec<em> Salmonella typhimurium</em
Summary
C. elegans a émergé comme un nouveau modèle génétique pour étudier les interactions hôte-pathogène. Ici, nous décrivons un protocole pour infecter C. elegans avec Salmonella typhimurium couplé avec la technique d'interférence double-brin ARNi pour étudier le rôle des gènes de l'hôte dans la défense contre l'infection à Salmonella.
Abstract
Dans la dernière décennie, C. elegans est devenu un organisme invertébré pour étudier les interactions entre hôtes et pathogènes, y compris la défense de l'hôte contre les bactéries gram-négatif bactérie Salmonella typhimurium. Salmonella établit une infection persistante dans l'intestin de C. elegans et entraîne la mort précoce des animaux infectés. Un certain nombre de mécanismes de l'immunité ont été identifiés en C. elegans pour se défendre contre les infections à Salmonella. Autophagy, une voie de dégradation lysosomale évolutif conservé, a été montré pour limiter la réplication de Salmonella dans C. elegans et chez les mammifères. Ici, un protocole est décrit à infecter C. elegans avec Salmonella typhimurium, dans laquelle les vers sont exposés à Salmonella pendant une durée limitée, semblable à une infection à Salmonella chez l'homme. infection à Salmonella raccourcit considérablement la durée de vie de C. elegans </ Em>. Utilisation du gène de l'autophagie essentiel bec-1, par exemple, nous avons combiné cette méthode d'infection à C. elegans ARNi alimentation approche et montré ce protocole peut être utilisé pour examiner la fonction de C. gènes de l'hôte elegans dans la défense contre l'infection à Salmonella. Depuis C. elegans génome des bibliothèques entières de RNAi sont disponibles, ce protocole permet à l'écran complètement pour C. gènes elegans qui protègent contre les salmonelles et d'autres agents pathogènes intestinaux utilisant des bibliothèques de l'ARNi du génome entier.
Introduction
Le nématode du sol vivant librement Caenorhabditis elegans est un organisme simple et génétiquement traitable modèle utilisé pour étudier plusieurs questions biologiques. C. elegans existe dominante comme hermaphrodites auto-fertilisation. Les mâles sont spontanément générées par des non-disjonction du chromosome X durant la gamétogenèse 1,2. En présence d'une alimentation abondante, C. elegans développer en continu à travers quatre stades larvaires à l'âge adulte. La température influe aussi C. développement elegans; On observe un développement plus rapide à des températures plus élevées. En laboratoire, C. elegans est cultivé à une température standard de 20 ° C sur gélose ensemencée avec la bactérie Escherichia coli (souche OP50) que la nourriture 1,2.
Dans la dernière décennie, C. elegans est devenu un organisme invertébré pour étudier les interactions hôte-pathogène 3-5. Dans la nature, C. elegans mange des bactéries comme nutrient la source 1,2. Sa nourriture de laboratoire bactérienne normale, OP50, peut être facilement remplacé par d'autres agents pathogènes d'étudier les interactions entre C. elegans et n'importe quel agent pathogène choisi. Dans ces conditions, l'intestin est le site primaire de l'infection. En effet, une large gamme de pathogènes bactériens a été montré pour infecter léthalement C. elegans 5.3.
La bactérie Salmonella Gram négatif est un agent pathogène gastro-intestinal qui provoque une maladie d'origine alimentaire humaine dans le monde 6,7. C. elegans est un bon hôte de modèle pour Salmonella typhimurium que cette bactérie se réplique et présente infections intestinales persistantes 8-10. C. elegans a été utilisé pour identifier à la fois roman et les facteurs précédemment connu virulence de Salmonella 11. Fait intéressant, l'C. système immunitaire elegans limite efficacement la réplication de la bactérie Salmonella. Il a été rapporté précédemment que inhibition des gènes de l'autophagie rend réplication accrue de Salmonella dans C. elegans, entraînant la mort précoce de vers infectées 10. Macroautophagie (ci-après appelé autophagie) est un processus dynamique impliquant le réarrangement des membranes intracellulaires de séquestrer cytoplasme et des organites pour la livraison vers le lysosome pour dégradation 12. Autophagy a été rapportée pour limiter la réplication de Salmonella dans C. elegans et chez les mammifères 10,13.
Le C. génome elegans a été le premier génome eucaryote multicellulaire séquencé; il est sensible à l'ARNi traitement 14-16. En outre, l'ARNi peut être administré efficacement en soumettant les vers à ingérer des bactéries contenant de l'ARN à double brin du gène cible, connu sous le nom de RNAi alimentation 16,17. Bibliothèques d'alimentation ARNi du génome entier ont été générés pour l'ARNi du génome de dépistage 16,18. Ici, une infection pro Salmonellaprotocole est couplé avec l'ARNi alimentation pour permettre de tester C. gènes elegans d'intérêt pour leur capacité à protéger contre l'infection à Salmonella.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans est un simple organisme modèle génétique qui mange des bactéries comme source d'éléments nutritifs. Ainsi, il est aisé de substituer sa nourriture bactérienne normale avec un agent pathogène intestinal pour enquêter sur les interactions entre C. elegans et l'agent pathogène choisi. Ici, un protocole est décrit à combiner infection à Salmonella et C. elegans ARNi alimentation de traitement pour examiner le rôle des gènes de l'hôte dans la défens…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Diane Baronas-Lowell pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par un Charles E. Schmidt College FAU des sciences Subvention de démarrage et une bourse d'études du vieillissement de la Fondation médicale Ellison à KJ
Materials
| LB Broth | Fisher | BP9723-500 | |
| XLD agar | EMD Chemicals | 1.05287.0500 | |
| Bacto Agar | Fisher | DF0140-01-0 | |
| Peptone | Fisher | BP1420-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S671-500 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C69-500 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | 12481C50 | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | |
| Petri Dish 95 x 15mm | Fisher | FB0875714G | |
| Petri Dish 60 x 15mm | Fisher | 08-757-13A | |
| Falcon Serological pipet | Fisher | 13-668-2 | |
| Falcon Express Pipet-Aid | Fisher | 13-675-42 | |
| MaxQ6000 shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE6000-7 | |
| Incubator | Percival | I-36DL |
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