Ett protokoll för att infektera<em> Caenorhabditis elegans</em> Med<em> Salmonella typhimurium</em
Summary
C. elegans har vuxit fram som en ny genetisk modell för att studera värd-patogen interaktioner. Här beskriver vi ett protokoll för att infektera C. elegans med Salmonella typhimurium i kombination med dubbel-strängen RNAi störnings teknik för att undersöka betydelsen av värdgener i försvar mot salmonellainfektion.
Abstract
Under det senaste decenniet, C. elegans har vuxit fram som en ryggradslös organism att studera interaktioner mellan värdar och patogener, inklusive värdförsvaret mot gramnegativa bakterien Salmonella typhimurium. Salmonella etablerar ihärdig infektion i tarmen av C. elegans och leder till tidig död av infekterade djur. Ett antal immunitetsmekanismerna har identifierats i C. elegans för att försvara sig mot salmonellainfektioner. Autophagy, ett evolutionärt bevarat pathway lysosomal nedbrytning, har visats för att begränsa Salmonella replikering i C. elegans och i däggdjur. Här används ett protokoll som beskrivits för att infektera C. elegans med Salmonella typhimurium, där maskarna utsätts för salmonella under en begränsad tid, liknande Salmonella infektion hos människa. salmonellainfektion förkortar avsevärt livslängden på C. elegans </ Em>. Använda väsentliga autophagy genen bec-1 som ett exempel, vi kombinerat denna infektion metod med C. elegans RNAi utfodring förhållningssätt och visade detta protokoll kan användas för att undersöka funktionen av C. elegans värdgener i försvar mot salmonellainfektion. Sedan C. elegans hela genom RNAi biblioteken är tillgängliga, möjliggör detta protokoll att på ett heltäckande screena för C. elegans gener som skyddar mot Salmonella och andra tarm patogener med hjälp av genomet hela RNAi bibliotek.
Introduction
Den fritt levande jord nematoden Caenorhabditis elegans är en enkel och genetiskt tractable modellorganism för att studera många biologiska frågor. C. elegans dominant existerar som själv gödsling hermafroditer. Hanarna är spontant genereras av icke-disjunktion av X-kromosomen under gametogenes 1,2. I närvaro av riklig mat, C. elegans utvecklar kontinuerligt genom fyra larvstadier till vuxna. Temperaturen påverkar också C. elegans utveckling; snabbare utveckling observeras vid högre temperaturer. I laboratoriet, C. elegans odlas vid en standardtemperatur av 20 ° C på agarplattor med seeded bakterien Escherichia coli (stam OP50) som föda 1,2.
Under det senaste decenniet, C. elegans har vuxit fram som en ryggradslös organism att studera värd-patogen interaktioner 3-5. I naturen, C. elegans äter bakterier som dess nutrient käll 1,2. Dess normala bakterielaboratorium mat, OP50, kan lätt ersättas med andra patogener för att undersöka samspelet mellan C. elegans och valfri patogen. Under dessa förhållanden är tarmen den primära platsen för infektionen. I själva verket har ett stort utbud av bakteriella patogener visat sig dödligt infektera C. elegans 3-5.
Den gramnegativa bakterien Salmonella är en mag-patogen som orsakar livsmedelsburna sjukdomar i hela världen 6,7. C. elegans är en bra modell värd för Salmonella typhimurium som denna bakterie replikerar och uppvisar ihållande tarminfektioner 8-10. C. elegans har använts för att identifiera både nya och tidigare kända Salmonella virulensfaktorer 11. Intressant, C. elegans immunförsvar framgångsrikt begränsar Salmonella replikering. Det har tidigare rapporterats att inhibUtgåva av autophagy gener gör ökad Salmonella replikering i C. elegans, vilket leder till tidig död av infekterade maskar 10. Macroautophagy (nedan kallat autophagy) är en dynamisk process som innebär omfördelning av subcellulära membran att binda cytoplasma och organeller för leverans till lysosomen för nedbrytning 12. Autophagy har rapporterats att begränsa Salmonella replikering i C. elegans och i däggdjur 10,13.
The C. elegans genomet var den första flercelliga eukaryota genomet sekvenserat; är mottaglig för RNAi behandling 14-16. Dessutom kan RNAi administreras på ett effektivt sätt genom att utsätta maskar som äter bakterier innehållande dubbelsträngat RNA av målgenen, kallad RNAi utfodring 16,17. Hela genom RNAi bibliotek utfodrings har genererats för genomet hela RNAi screening 16,18. Häri en salmonellainfektion proffsprotokoll är kopplad med RNAi utfodring för att låta testa C. elegans gener av intresse för deras förmåga att skydda mot salmonellainfektion.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans är en enkel genetisk modell organism som äter bakterier som sin näringskälla. Således är det lätt att ersätta dess normala bakterie mat med en intestinal patogen för att undersöka interaktioner mellan C. elegans och vald patogen. Häri ett protokoll beskrivs kombinera Salmonella infektion och C. elegans RNAi utfodring behandling för att undersöka betydelsen av värdgener i försvar mot salmonellainfektion. Tidigare infektionsprotokoll utsätta C. el…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Diane Baronas-Lowell för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöddes av ett FAU Charles E. Schmidt högskolan av vetenskap Seed Grant och en åldrande stipendium från Ellison Medical Foundation till KJ
Materials
| LB Broth | Fisher | BP9723-500 | |
| XLD agar | EMD Chemicals | 1.05287.0500 | |
| Bacto Agar | Fisher | DF0140-01-0 | |
| Peptone | Fisher | BP1420-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S671-500 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C69-500 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | 12481C50 | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | |
| Petri Dish 95 x 15mm | Fisher | FB0875714G | |
| Petri Dish 60 x 15mm | Fisher | 08-757-13A | |
| Falcon Serological pipet | Fisher | 13-668-2 | |
| Falcon Express Pipet-Aid | Fisher | 13-675-42 | |
| MaxQ6000 shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE6000-7 | |
| Incubator | Percival | I-36DL |
References
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. . C. elegans II. , (1997).
- Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Aballay, A., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans as a host for the study of host-pathogen interactions. Curr Opin Microbiol. 5, 97-101 (2002).
- Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Caenorhabditis elegans: an emerging genetic model for the study of innate immunity. Nat Rev Genet. 4, 380-390 (2003).
- Mylonakis, E., Aballay, A. Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions. Infection and Immunity. 73, 3833-3841 (2005).
- Ford, M. W., et al. A descriptive study of human Salmonella serotype typhimurium infections reported in Ontario from 1990 to 1997. Can J Infect Dis. 14, 267-273 (2003).
- Voetsch, A. C., et al. FoodNet estimate of the burden of illness caused by nontyphoidal Salmonella infections in the United States. Clin Infect Dis. 38 Suppl 3, (2004).
- Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. M. Salmonella typhimurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1539-1542 (2000).
- Alegado, R. A., Tan, M. W. Resistance to antimicrobial peptides contributes to persistence of Salmonella typhimurium in the C. elegans intestine. Cell Microbiol. 10, 1259-1273 (2008).
- Jia, K., et al. Autophagy genes protect against Salmonella typhimurium infection and mediate insulin signaling-regulated pathogen resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14564-14569 (2009).
- Tenor, J. L., McCormick, B. A., Ausubel, F. M., Aballay, A. Caenorhabditis elegans-based screen identifies Salmonella virulence factors required for conserved host-pathogen interactions. Curr Biol. 14, 1018-1024 (2004).
- Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).
- Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
- . The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2, 1-10 (2001).
- Liang, J., Xiong, S., Savage-Dunn, C. Using RNA-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode C elegans. J. Vis. Exp. (72), (2013).
- Fraser, A. G., et al. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).
- Aballay, A., Ausubel, F. M. Programmed cell death mediated by ced-3 and ced-4 protects Caenorhabditis elegans from Salmonella typhimurium-mediated killing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 2735-2739 (2001).
- Melendez, A., et al. Autophagy genes are essential for dauer development and lifespan extension in C. elegans. Science. 301, 1387-1391 (2003).
