Introduction
SNF2 परिवार chromatin remodeling परिसरों एक केंद्रीय SNF2 तरह ATPase सबयूनिट 1,2 शामिल हैं. एकल सबयूनिट एंजाइमों के रूप में कुछ SNF2 तरह ATPases समारोह, दूसरों बड़ा बहु सबयूनिट परिसरों का उत्प्रेरक सबयूनिट के रूप में कार्य करते हुए. Remodeling परिसरों उनकी गतिविधियों में योगदान क्रोमेटिन के सब यूनिटों में से प्रत्येक remodeling प्रक्रिया काटना कि जैव रासायनिक assays प्रदर्शन करने की क्षमता की आवश्यकता है जिसके द्वारा आणविक तंत्र elucidating.
मानव INO80 परिसर और अन्य chromatin remodeling एंजाइमों द्वारा एटीपी निर्भर nucleosome remodeling, इसके DNA- और / या nucleosome निर्भर ATPase के सक्रियण द्वारा पीछा किया, nucleosomes को remodeling एंजाइम के बंधन के साथ शुरू होता है कि एक बहु कदम प्रक्रिया के रूप में कल्पना की जा सकती है nucleosomal डीएनए, और nucleosomes 1,2 के अंतिम repositioning पर remodeling एंजाइम का स्थानान्तरण. एटीपी निर्भर chromatin remodeling प्रक्रिया आर के आणविक विवरण को समझनाप्रतिक्रिया के हर कदम को chromatin remodeling जटिल की व्यक्तिगत सब यूनिटों के योगदान के पुनर्गठन अपनी अलग अलग चरणों में प्रतिक्रिया और परिभाषा के विच्छेदन equires. इस तरह के विश्लेषण के लिए इन विट्रो में परिभाषित आणविक substrates का उपयोग nucleosome remodeling और अन्य गतिविधियों का विश्लेषण करने की क्षमता की आवश्यकता होती है.
पिछले एक जौव प्रोटोकॉल में, हम परिभाषित सबयूनिट रचनाओं 3 के साथ INO80 chromatin remodeling परिसरों और subcomplexes उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता प्रक्रियाओं का वर्णन किया. यहाँ, हम, DNA- और nucleosome सक्रिय ATPase, और इस तरह के परिसरों के साथ जुड़े nucleosome remodeling गतिविधियों बंधन nucleosome की मात्रात्मक विश्लेषण कर सकें कि तीन जैव रासायनिक assays प्रस्तुत करते हैं.
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Protocol
1 एटीपी निर्भर nucleosome Remodeling Assays
Nucleosome remodeling गतिविधियों एटीपी निर्भर मापने के लिए, INO80 immunopurified या INO80 subcomplexes एटीपी और एक 216 बी.पी., 32 पी लेबल डीएनए टुकड़ा के एक छोर पर तैनात एक भी nucleosome जिसमें एक mononucleosomal सब्सट्रेट, साथ incubated हैं. प्रतिक्रिया उत्पादों तो देशी पाली acrylamide जैल में वैद्युतकणसंचलन के अधीन हैं.
- 32 पी लेबल, '601' डीएनए टुकड़ा उत्पन्न करने के लिए, से बढ़ाना pGEM-3z-601 4 oligonucleotides रूप 5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG और 5'-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG का उपयोग कर एक अंत तैनात 601 nucleosome स्थिति अनुक्रम युक्त 216 बीपी डीएनए टुकड़ा, आगे और रिवर्स प्राइमरों.
- तालिका 1 में वर्णित के रूप में एक 100 μl पीसीआर प्रतिक्रिया सेट करें.
- निम्नलिखित प्रोग्राम का उपयोग कर एक थर्मल cycler में पीसीआर प्रतिक्रियाओं का पालन: 1 मिनट 96 डिग्री सेल्सियस, followe पर94 डिग्री सेल्सियस, 57 डिग्री सेल्सियस, 30 चक्र के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर 60 सेकंड में 30 सेकंड में 45 सेकंड से डी; 72 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के साथ समाप्त.
- पीसीआर प्रतिक्रिया के समाप्त होने पर, Nuclease मुक्त स्पिन कॉलम के माध्यम से दो बार प्रतिक्रिया उत्पादों से गुजर रहा अनिगमित nucleotides हटा दें.
- पीसीआर प्रतिक्रिया वांछित ~ 216 बीपी डीएनए टुकड़ा उत्पन्न कि पुष्टि करने के लिए एक 1.2% agarose जेल में शुद्ध पीसीआर उत्पाद के 5 μl चलाएँ.
- शुद्ध पीसीआर उत्पाद 20 गुना के 5 μl पतला, और एक यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग डीएनए एकाग्रता को मापने. औसत उपज ~ 40 एनजी / μl है.
- एक जगमगाहट काउंटर में शुद्ध पीसीआर उत्पाद का 1 μl की रेडियोधर्मिता मापने. सीपीएम / एनजी की गणना के द्वारा लेबलिंग दक्षता का अनुमान है. एक सफल लेबलिंग प्रतिक्रिया 601 डीएनए टुकड़ा के ~ 15,000 सीपीएम / एनजी उपज की उम्मीद है.
- एक धारावाहिक कमजोर पड़ने विधि 5 का उपयोग लेबल 601 डीएनए पर हेला सेल nucleosomes स्थानांतरण.
- के 2 pmol मिक्स32 पी लेबल 601 डीएनए टुकड़ा के साथ हेला nucleosomes की 6 ग्राम 1.0 एम NaCl, 10 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 8.0, 1 मिमी EDTA, 0.1 मिमी PMSF, और 1 मिमी युक्त एक बफर के 50 μl में (के रूप में तैयार 5 वर्णित) डीटीटी और 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- क्रमिक रूप से 0.8 मीटर, 0.6 मीटर तक मिश्रण पतला, और 10 मिमी Tris-एचसीएल (8.0 पीएच), 1 मिमी EDTA, 0.1 मिमी PMSF के क्रमश: 12.5 μl, 20.8 μl, और 41.6 μl, साथ कमजोर पड़ने से 0.4 एम NaCl,, और 1 मिमी डीटीटी, प्रत्येक कमजोर पड़ने के बाद 30 डिग्री सेल्सियस पर एक 30 मिनट ऊष्मायन के साथ.
- इसके अलावा एक 30 मिनट ऊष्मायन के साथ तो 0.1% Nonidet पी -40, 20% ग्लिसरॉल, और 200 माइक्रोग्राम / एमएल बीएसए युक्त एक ही बफर के 250 μl, 125 μl के अलावा द्वारा 0.1 एम NaCl को फिर 0.2 एम और मिश्रण पतला और अंतिम दो dilutions के बीच 30 डिग्री सेल्सियस पर. अप करने के लिए 3 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर mononucleosome सब्सट्रेट स्टोर.
- 10 μl की कुल मात्रा में एटीपी निर्भर nucleosome रपट प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन करना. इसकी वजहINO80 nucleosome remodeling गतिविधि के लिए इष्टतम NaCl एकाग्रता चूंकि ction घटकों. 2 टेबल में सूचीबद्ध हैं ~ 50 मिमी NaCl (अप्रकाशित परिणाम) खाते में में निहित NaCl की राशि लेने, 50 मिमी के लिए प्रत्येक प्रतिक्रिया में सोडियम क्लोराइड की कुल एकाग्रता समायोजित nucleosomes और एंजाइम की तैयारी.
- Assays स्थापित करने के लिए शुरू करने से पहले, देशी पाली acrylamide जैल (18 x 16 सेमी) डाली. 5% acrylamide युक्त एक भी जेल तैयार करने के लिए (acrylamide: 37.5 bisacrylamide: 1), 0.5x TBE (45 मिमी Tris borate, 1 मिमी EDTA), 0.01% अमोनियम persulfate (ए पी), और 0.001% एन, एन, N', N'-tetramethylethylenediamine (TEMED),. 3 तालिका में सूचीबद्ध सामग्री मिश्रण जेल आरटी पर कम से कम 2 घंटे के लिए भाजन करने की अनुमति दें.
- प्रत्येक प्रतिक्रिया का प्रदर्शन किया जा करने के लिए इस बीच, एक पूर्व ठंडा siliconized 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब ~ 20 एनएम INO80 या INO80 subcomplex में गठबंधन (EB100 बफर की राशि के साथ (के रूप में तैयार 3 में वर्णित)
- 'एक्स' का एक पहलू से ऊपर स्केलिंग, सामग्री के बाकी के साथ एक मास्टर कॉकटेल सेट अप (जहां प्रतिक्रियाओं की एक्स = कुल संख्या +3). एक एकल 10 μl प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक प्रत्येक घटक की राशि 5 तालिका में सूचीबद्ध किया गया; नुस्खा प्रदर्शन करने की प्रतिक्रियाओं की संख्या के हिसाब से बढ़ाया जाना चाहिए. एक Pipetman साथ ट्यूब दोहन से या ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं और एक benchtop microcentrifuge में कुछ सेकंड के लिए ट्यूब स्पिन.
- कदम 1.3.2 में स्थापित प्रतिक्रिया ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए मास्टर कॉकटेल के 5.25 μl बांटना. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं. एक 30 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक या नहाने के पानी के लिए प्रतिक्रिया ट्यूबों स्थानांतरित करके प्रतिक्रियाओं आरंभ और 2 घंटे के लिए सेते हैं.
- इस बीच, प्रतियोगी डीएनए युक्त कॉकटेल 'मिश्रण को दूर करने' को तैयारऔर nucleosomes, एक्स (प्रतिक्रियाओं 4 के एक्स = कुल संख्या) का एक पहलू से स्केलिंग. एक भी प्रतिक्रिया के लिए मिश्रण को हटाने 1.5 μl तैयार करने की जरूरत प्रत्येक घटक की राशि 6 तालिका में सूचीबद्ध किया गया; नुस्खा प्रदर्शन किया जा assays की संख्या के आधार पर बढ़ाया जाना चाहिए.
- हटाने मिश्रण के 1.5 μl जोड़कर प्रतिक्रियाओं बर्खास्त. , अच्छी तरह मिक्स नीचे स्पिन, और एक आगे 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- इस बीच, लगातार बफर परिसंचरण बनाए रखने के निचले सदन के अंदर एक चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ चल बफर के रूप में 0.5x TBE का उपयोग, 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 100 वी पर एक खड़ी वैद्युतकणसंचलन इकाई में देशी polyacrylamide जेल पूर्व चलाते हैं.
- , नमूना लोड 3x TBE, 30% ग्लिसरॉल, 0.25% Bromophenol ब्लू, और 0.25% Xylene Cyanol एफएफ युक्त लोडिंग डाई के 2.5 μl जोड़ें. संक्षेप में नमूने स्पिन, अच्छी तरह मिक्स, और लदान सुझावों का उपयोग कर जेल पर लोड.
- बफर संचलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 4.5 घंटे के लिए 200 वी पर जेल चलाएँ.
- संकेत का पता लगाने के लिए, फिल्टर पेपर के दो चादरें के ढेर को जेल हस्तांतरण. स्पष्ट प्लास्टिक की चादर का उपयोग शीर्ष पर जेल के साथ फिल्टर पेपर में लपेटकर, और तब इच्छित समय के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक भंडारण फॉस्फर स्क्रीन को बेनकाब.
- एक आइसोटोप इमेजिंग स्कैनर प्रणाली के साथ स्क्रीन स्कैन और उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण.
2 Mononucleosome बंधन Assays
Mononucleosomes के लिए एक दिया INO80 परिसर के बंधन आत्मीयता परख के लिए, 1.2 चरण में उत्पन्न mononucleosomal सब्सट्रेट का उपयोग कर एक Electrophoretic गतिशीलता शिफ्ट परख (EMSA) प्रदर्शन करते हैं.
- प्रतिक्रिया nucleosome remodeling assays के लिए वर्णित लेकिन प्रतिक्रियाओं से एटीपी और हटाने मिश्रण न आना रूप assays बाध्यकारी लिए घोला जा सकता सेट करें; 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- प्रत्येक प्रतिक्रिया मिश्रण को लोडिंग डाई के 2.5 μl जोड़ें, और 3.5% acrylamide (acrylamide युक्त एक देशी polyacrylamide जेल के लिए लागू होते हैं: 3 बीआईएस7.5: 1), 1% ग्लिसरॉल, 0.5x TBE, 0.01% ए पी एस, और 0.001% TEMED.
- बफर चलाने के रूप में 0.5x TBE का प्रयोग, बफर संचलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 2.5 घंटे के लिए 200 वी पर जेल चलाने के लिए और एक भंडारण फॉस्फर स्क्रीन को बेनकाब.
3 DNA- और nucleosome निर्भर ATPase Assays
20 मिमी Tris-एचसीएल (7.5 पीएच), 60 मिमी NaCl, 6.6 मिमी 2 MgCl, 0.8 मिमी EDTA, 0.015% Nonidet पी -40, 2.5% ग्लिसरॉल, 0.1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए, 1 युक्त 5 μl प्रतिक्रिया मिश्रण में ATPase assays के प्रदर्शन मिमी डीटीटी, 0.1 मिमी PMSF, 2 मिमी एटीपी, [α- 32 पी] एटीपी के 2 μCi (3000 Ci / mmol). INO80 परिसर के प्रत्येक INO80 जटिल या राशि के लिए परिपत्र प्लाज्मिड डीएनए को मापने के लिए (5000 बीपी, ~ 30 एनएम) बंद युक्त DNA- या nucleosome स्वतंत्र ATPase, एक को मापने के लिए तीन समानांतर प्रतिक्रियाओं, एक युक्त EB100 बफर की स्थापना assayed हो DNA- निर्भर ATPase, और nucleosome निर्भर ATPase को मापने के लिए एक हेला oligonucleosomes (~ 185 एनएम) युक्त. बर्फ पर सभी प्रतिक्रियाओं को सेट करें.
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Representative Results
आंकड़े nucleosome रपट (चित्रा 1) और बाध्यकारी (चित्रा 2) assays और DNA- या nucleosome निर्भर ATPase assays (चित्रा 3) सहित INO80 गतिविधियों विशेषताएँ इस्तेमाल जैव रासायनिक assays के प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं.
चित्र 1 में दिखाया प्रयोग बरकरार INO80 परिसरों की क्षमता झंडा Ies2 या झंडा INO80E के माध्यम से शुद्ध और INO80 एक 216 बीपी, radiolabeled डीएनए टुकड़ा पर इकट्ठे mononucleosomes के पुनर्गठन को उत्प्रेरित करने के लिए झंडा Ino80ΔN या Ino80ΔNΔHSA या तो के माध्यम से शुद्ध subcomplexes की तुलना करती है. डीएनए टुकड़ा पर nucleosome की स्थिति electrophoretic गतिशीलता को प्रभावित करता है; पार्श्व तैनात nucleosomes तेजी से अधिक केन्द्र तैनात nucleosomes से जेल में चला रहे हैं. INO80 chromatin remodeling परिसरों preferentially डीएनए 6,7,8 के एक टुकड़े के केंद्र की ओर mononucleosomes स्थानांतरित करने के बाद, remodeling गतिविधि मोनी हैelectrophoretic गतिशीलता में कमी आई है कि प्रदर्शन nucleosomes की आबादी के उद्भव से tored. प्रतिक्रिया के अंत में, हेला oligonucleosomes और सामन शुक्राणु या अन्य डीएनए की एक अतिरिक्त बाध्य remodeling एंजाइम nucleosome के electrophoretic गतिशीलता बदल जाएगा, के बाद से किसी भी सब्सट्रेट बाध्य INO80 या INO80 subcomplexes दूर करने के लिए प्रतियोगी के रूप में प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ा जाना चाहिए सब्सट्रेट. Ino80ΔNΔHSA के माध्यम से शुद्ध परिसरों भी Arp4, Arp8, और YY1 कमी करते हुए झंडा Ino80ΔN के माध्यम से शुद्ध परिसर, metazoan विशिष्ट यूनिटों INO80D, INO80E, अमिदा, MCRS1, NFRKB, और UCH37 की कमी है. झंडा Ies2, झंडा INO80E, और झंडा Ino80ΔN के माध्यम से शुद्ध परिसर metazoan विशिष्ट यूनिटों INO80 परिसर से nucleosome remodeling के लिए नगण्य हैं यह दर्शाता है कि इसी तरह की गतिविधियों है. Remodeling गतिविधि Ino80 एटीपी के HSA डोमेन पर निर्भर करता है कि यह दर्शाता है, इसके विपरीत, परिसरों झंडा Ino80ΔNΔHSA के माध्यम से शुद्ध इस परख में निष्क्रिय हैंएएसई और / या उसके संबंधित सब यूनिटों.
चित्रा 2 में प्रयोगों electrophoretic गतिशीलता पारी assays का उपयोग INO80 की गतिविधियों और INO80 subcomplexes बंधन nucleosome की तुलना करें. ये assays nucleosome बाध्य परिसरों को दूर करने के लिए प्रतिक्रिया के समापन पर oligonucleosomes और डीएनए की कोई अतिरिक्त है, सिवाय इसके कि nucleosome remodeling assays के लिए इसी तरह प्रदर्शन कर रहे हैं. तदनुसार, अक्षत INO80 परिसरों की बढ़ती मात्रा के साथ nucleosomes की ऊष्मायन INO80E सबयूनिट के माध्यम से शुद्ध मुक्त mononucleosomes और जेल के शीर्ष के निकट migrates प्रजाति है कि नए 'स्थानांतरित कर दिया' एक की उपस्थिति (गलियों को इसी बैंड की एक खुराक पर निर्भर लापता होने के लिए सुराग 6-8). इसके विपरीत, जब nucleosomes, स्थानांतरित कर दिया प्रजातियों अधिक तेजी से उत्प्रवासित INO80 सब यूनिटों का एक सबसेट कि कमी Ino80ΔN के माध्यम से शुद्ध किया गया था कि छोटे परिसरों के साथ incubated हैं (गलियों 2-5 और 9-11), सुझाव है कि रिश्तेदार भीड़सुपर स्थानांतरित कर दिया बैंड के ility assayed परिसरों के आकार के द्वारा निर्धारित किया जाता है.
चित्रा DNA- और दो अलग INO80 subcomplexes की nucleosome सक्रिय ATPase गतिविधियों की तुलना एक परख के 3 शो का परिणाम है. और धीरे धीरे पलायन स्पॉट शुरू α- 32 पी एटीपी लेबल, और अधिक तेजी से पलायन प्रजातियों ADP प्रतिक्रिया उत्पादों रहे हैं के अनुरूप; तीर विलायक प्रवास की दिशा का संकेत मिलता है.
यहाँ assayed परिसरों में से एक, INO80ΔN, अन्य, INO80ΔNC जबकि, Ino80 सी टर्मिनल क्षेत्र का अभाव है, प्रोटीन की सामान्य सी टर्मिनस तक फैली हुई है कि एक Ino80 ATPase सबयूनिट भी शामिल है. इन दो परिसरों अन्यथा समान हैं, (ADP के लिए रेडियो लेबल एटीपी के रूपांतरण द्वारा मापा) एटीपी hydrolysis की दर नकारात्मक अपनी गतिविधि को विनियमित सकता Ino80 ATPase की सी टर्मिनस, सुझाव INO80ΔNC की उपस्थिति में अधिक से अधिक है. ध्यान दें कि एटीपी hydr की दरदोनों परिसरों से olysis परिसरों एटीपी hydrolysis के लिए nucleosomal substrates पसंद करते हैं remodeling INO80 nucleosome सुझाव, डीएनए से nucleosomes की उपस्थिति में अधिक से अधिक है.
आंकड़े में दिखाया गया परख में, केवल डीएनए या (undetectable से डीएनए / nucleosomes की उपस्थिति में मनाया कि के <5% से लेकर) nucleosomes कि कमी प्रतिक्रियाओं में एटीपी hydrolysis की एक बहुत कम स्तर है. INO80 और अन्य SNF2 परिवार chromatin remodeling एंजाइमों की ATPase गतिविधि जोरदार डीएनए या nucleosomes से प्रेरित है, क्योंकि INO80 परिसर का शुद्ध तैयारी में पर्याप्त DNA- और / या nucleosome स्वतंत्र ATPase गतिविधि की उपस्थिति सेलुलर contaminating की उपस्थिति का सुझाव होगा डीएनए, या वैकल्पिक रूप से, सफलतापूर्वक शुद्धि के दौरान हटाया नहीं गया है कि गैर INO80 ATPases contaminating. कई चरणों शुद्धि के दौरान अवांछित डीएनए और / या ATPase शुरू कम करने के लिए लिया जा सकता है.
1) एस बढ़ाएँशुद्धि के दौरान बाध्यकारी और वाशिंग चरणों में alt एकाग्रता (NaCl). बंधन और वाशिंग चरणों में कम से कम 200 मिमी NaCl का उपयोग आमतौर पर डीएनए और / या ATPases contaminating के अस्वीकार्य स्तर के साथ remodeling परिसरों की तैयारी पैदावार. हम नियमित (3 में वर्णित) contaminants को कम से कम 450 मिमी NaCl युक्त एक बफर का उपयोग INO80 परिसरों शुद्ध. हम सक्रिय INO80 परिसरों को शुद्ध करने के लिए 1 एम NaCl जितना युक्त बफ़र्स का इस्तेमाल किया है; हालांकि, हम इन परिस्थितियों में सक्रिय परिसरों की एक कम उपज प्राप्त;
2) agarose immunopurification दौरान सेल lysate ध्वज का अनुपात कम करें; झंडा agarose के इष्टतम राशि अनुमापन द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए;
3) एटीपी निर्भर संरक्षिकाओं immunopurification दौरान झंडा टैग प्रोटीन के लिए बाध्य रह सकती है. ये अक्सर immunopurification दौरान धोने बफर में 1 मिमी एटीपी शामिल करके हटाया जा सकता है;
4) हम सफल हैवाई / मिलीलीटर झंडा agarose मोती के साथ निकालने की ऊष्मायन के दौरान 25 इकाइयों के एक एकाग्रता में Benzonase शामिल करके डीएनए contaminating हटा दिया. चेतावनी: यह अवशिष्ट DNase INO80 गतिविधि के लिए assays के दौरान सब्सट्रेट डीएनए या nucleosomes नीचा दिखाना होगा के रूप में यकीन Benzonase, बाद में वाशिंग चरणों के दौरान हटा दिया जाता है बनाने के लिए आवश्यक है.
इन ATPase assays की व्याख्या, सिद्धांत रूप में, INO80 chromatin remodeling परिसरों SNF2 तरह कोर ATPase Ino80, actin की तरह प्रोटीन Arp5, Arp8, Baf53a, actin सहित कई संभावित ATPases होते तथ्य यह है कि, और एएए + से जटिल हो सकता है ATPases Tip49a और Tip49b. कई ATPases की भौतिक उपस्थिति के बावजूद, तथापि, पिछले अध्ययनों केवल परिसरों Ino80 DNA- या nucleosome सक्रिय एटीपी hydrolysis का समर्थन कर सकते catalytically सक्रिय युक्त पता चला है कि; Ino80 ATPase की catalytically निष्क्रिय E653Q फार्म युक्त परिसरों detectable DNA- या nucleosome उत्तेजित ATPase acti प्रदर्शन करने में विफलकिसी भी परिस्थितियों में vity 8 का परीक्षण किया. इस प्रकार, DNA- और / या INO80 या INO80 subcomplexes की nucleosome उत्तेजित ATPase गतिविधि मुख्य रूप से Ino80 ATPase सबयूनिट योगदान कर रहे हैं.
चित्रा 1 INO80 nucleosome remodeling गतिविधि Ino80 HSA डोमेन और / या जुड़े सब यूनिटों पर निर्भर करता है लेकिन Ino80 NTD और metazoan विशिष्ट सब यूनिटों से स्वतंत्र है. Nucleosome remodeling assays झंडा व्यक्त सेल लाइनों से तैयार परमाणु अर्क से झंडा immunopurified परिसरों के साथ प्रदर्शन किया गया जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती INO80 सब यूनिटों के -tagged संस्करणों. बरकरार INO80 परिसरों झंडा Ies2 या झंडा INO80E व्यक्त सेल लाइनों से शुद्ध कर रहे थे; INO80 subcomplexes झंडा Ino80ΔN या झंडा Ino80ΔNΔHSA व्यक्त सेल लाइनों से शुद्ध किया गया. 1 के एक रिश्तेदार एकाग्रता (रिलायंस एनर्जी. सान्द्र.) ~ 10 एनएम INO80 परिसर से मेल खाती है.
INO80 परिसर से बाध्यकारी चित्रा 2 nucleosome Ino80 NTD और metazoan विशिष्ट सब यूनिटों से स्वतंत्र है. Nucleosome बाध्यकारी assays के संकेत झंडा immunopurified INO80 परिसर के अलग मात्रा की उपस्थिति में प्रदर्शन किया गया. INO80 या INO80 subcomplexes के बंधन stably INO80 या INO80 subcomplexes से बंधे mononucleosomes को इसी धीमी गति से पलायन "सुपर स्थानांतरित कर दिया" बैंड के उद्भव में परिणाम mononucleosomes लिए. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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चित्रा 3 DNA- और nucleosome निर्भर ATPase assays. टीएलसी (पतली परत क्रोमैटोग्राफी) ATPase assays के माध्यम से शुद्ध subcomplexes INO80 द्वारा एटीपी hydrolysis की दर को मापने के लिए प्रदर्शन किया गया आधारित झंडा Ino80ΔN (ΔN) या झंडा Ino80ΔNC (ΔNC) में डीएनए या nucleosomes की मात्रा saturating की उपस्थिति. Assays प्रत्येक परिसर के दो अलग अलग सांद्रता (5 एनएम और 10 एनएम) और तीन अलग अलग प्रतिक्रिया समय के लिए उपयोग कर प्रदर्शन किया गया. प्रतिक्रियाओं में (pmol में) hydrolyzed एटीपी की राशि प्रत्येक पैनल के तहत संकेत दिया है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
| 67.5 μl | एच 2 ओ |
| 10 μl | 10x पीसीआर प्रतिक्रिया बफर (माल की सूची देखें) | <Tr />
| 1 μl | pGEM-3z-601 (10 एनजी / μl) |
| 5 μl | आगे प्राइमर (10 माइक्रोन) |
| 5 μl | रिवर्स प्राइमर (10 माइक्रोन) |
| 0.5 μl | 10 मिमी 4 dNTPs के प्रत्येक युक्त dNTP शेयर समाधान |
| 1 μl | Taq डीएनए पोलीमरेज़ (5 इकाइयों / μl) |
| 10 μl | [Α- 32 पी] dCTP (6000 Ci / mmol, 3.3 माइक्रोन) |
Radiolabeled '601' डीएनए टुकड़ा की पीसीआर प्रवर्धन के लिए तालिका 1 प्रतिक्रिया मिश्रण.
| 20 एनएम | INO80 या INO80 subcomplexes |
| 2.8 एनएम | (32 पी लेबल 601 डीएनए टुकड़ा और हेला सेल nucleosomes पर mononucleosomes का एक मिश्रण से मिलकर) nucleosomes |
| 1 मिमी | ultrapure एटीपी |
| 20 मिमी | HEPES-NaOH (पीएच 7.9) |
| 50 मिमी | NaCl |
| 5 मिमी | 2 MgCl |
| 1 मिमी | dithiothreitol (डीटीटी) |
| 0.1 मिमी | phenylmethanesulfonyl फ्लोराइड (PMSF) |
| 0.1 मिलीग्राम / एमएल | गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) |
| 5% | ग्लिसरॉल |
| 0.02% | Nonidet पी 40 |
| 0.02% | ट्राइटन X-100 |
एटीपी निर्भर nucleosome remodeling assays तालिका 2 अवयव.
| 32.6 मिलीलीटर | एच 2 ओ |
| 5 मिलीलीटर | 40% acrylamide / बीआईएस (37.5: 1) |
| 2 मिलीलीटर | 10x TBE (900 मिमी त्रिएस borate, 20 मिमी EDTA) |
| जेल डालने का कार्य करने से पहले निम्न सामग्री तुरंत करें: | |
| 0.4 मिलीलीटर | 10% अमोनियम persulfate |
| 0.1 मिलीलीटर | TEMED |
एटीपी निर्भर nucleosome remodeling assays के लिए देशी polyacrylamide जेल की 3 तालिका तैयार करना.
| 10 मिमी | HEPES पीएच 7.9 |
| 10% | ग्लिसरॉल |
| 100 मिमी | NaCl |
| 1.5 मिमी | 2 MgCl |
| 0.05% | TritonX-100 |
| बस से पहले प्रयोग करें: | |
| 1 मिमी | डीटीटी |
| 200 माइक्रोन | PMSF |
| 1: 1,000 कमजोर पड़ने | Protease अवरोध Cocktail (माल की सूची देखें) |
तालिका 4 EB100 बफर.
| 3.9 μl | एच 2 ओ |
| 1 μl | 10x Remodeling बफर (200 मिमी HEPES-NaOH (पीएच 7.9), 0.2% एनपी 40, 0.2% ट्राइटन X-100, 50% ग्लिसरॉल, 50 मिमी 2 MgCl, 1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए) |
| 0.1 μl | 100 मिमी एटीपी |
| 0.01 μl | 1 एम डीटीटी |
| 0.01 μl | 100 मिमी PMSF |
| 0.25 μl | कदम 1.2 से पुनर्गठन mononucleosome सब्सट्रेट |
टेबल एटीपी निर्भर nucleosome remodeling assays के लिए मास्टर कॉकटेल के 5 अवयव.
| 0.33 μl | 400 एनएम हेला nucleosomes |
| 0.75 μl | 100 एनएम sonicated सामन शुक्राणु DNAs |
| 0.01 μl | 1 एम डीटीटी |
| 0.01 μl | 100 मिमी PMSF |
6 तालिका मिश्रण कॉकटेल निकाल रहा है.
| 2 μl | एच 2 ओ |
| 0.25 μl | 400 मिमी Tris-एचसीएल (7.5 पीएच), 200 मिमी NaCl युक्त 20x ATPase बफर, 132 मिमी 2 MgCl, 16 मिमी EDTA, 0.3% Nonidet पी -40, 50% ग्लिसरॉल, 2 मिलीग्राम / एमएल बीएसए |
| 0.1 μl | 100 माइक्रोन एटीपी |
| 0,005 μl | 1 एम डीटीटी |
| 0,005 μl | 100 मिमी PMSF |
| 0.1 μl | [Α- 32 पी] एटीपी (3000 Ci / mmol) |
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Discussion
, और नहीं remodeling और / या ATPase एंजाइम contaminating पर हम assays में निरीक्षण कि nucleosome remodeling और ATPase गतिविधियों INO80 परिसरों का उत्प्रेरक गतिविधि पर निर्भर सुनिश्चित करने के लिए, हम नियमित तौर पर परख nucleosome remodeling और INO80 परिसरों की catalytically निष्क्रिय संस्करणों की ATPase गतिविधि में शुद्ध जंगली प्रकार INO80 उसी प्रक्रिया का उपयोग करने के साथ समानांतर. INO80 जटिल या subcomplexes के विभिन्न तैयारियों की गतिविधियों की तुलना प्रयोगों की व्याख्या उलझा सकता है जो एटीपी और / या एटीपी स्वतंत्र remodeling गतिविधियों contaminating की उपस्थिति के लिए परीक्षण करने के लिए nucleosome remodeling गतिविधि परख जब एटीपी कमी एक नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया भी किया जाना चाहिए. Catalytically INO80 या INO80 subcomplexes के निष्क्रिय संस्करणों कोई nucleosome remodeling या ATPase गतिविधियों का प्रदर्शन करना चाहिए. इसके अलावा, DNA- या nucleosome स्वतंत्र ATPase गतिविधि का पता लगाने के Enzym में ATPase (ओं) contaminating की उपस्थिति का संकेतई अंश. गतिविधि अभी भी catalytically निष्क्रिय Ino80 की उपस्थिति में पता लगाया जाता है या तो पर्याप्त DNA- या nucleosome स्वतंत्र ATPase गतिविधि भी रूप में वर्णित शुद्धि के अनुकूलन के बाद अगर वहाँ 'प्रतिनिधि परिणाम,' परिसरों आगे इस तरह के आयन एक्सचेंज या के रूप में अतिरिक्त कदम का उपयोग कर शुद्ध किया जा सकता है जेल निस्पंदन क्रोमेटोग्राफी या ढाल अवसादन.
Nucleosome remodeling और ATPase गतिविधियों को मापने है, यह उत्पाद समय और खुराक प्रतिक्रिया घटता रैखिक हैं जब माप लिया जा रहा है यह सुनिश्चित करने के लिए समय की लंबाई बदलती के लिए और INO80 या INO80 subcomplexes के एक से अधिक एकाग्रता के साथ assays के प्रदर्शन करने के लिए सलाह दी जाती है. इसी तरह, nucleosome बाध्यकारी assays INO80 परिसर (ते) के कई सांद्रता का उपयोग किया जाना चाहिए; अन्यथा, एक मज़बूती से अलग INO80 तैयारी की गतिविधियों की तुलना नहीं कर सकते हैं.
Nucleosome फिसलने और बाध्यकारी assays हमेशा नियंत्रण प्रतिक्रियाओं को शामिल करना चाहिएकि शुरू कर nucleosome आबादी के electrophoretic गतिशीलता को दिखाने के लिए एक मार्कर के रूप में अकेले mononucleosome सब्सट्रेट शामिल हैं. इस तरह, एक बड़ी आसानी से विशेष रूप से एंजाइम अंश की उपस्थिति के कारण परिवर्तन की पहचान कर सकते हैं. इस तरह के नियंत्रण प्रतिक्रियाओं भी पुनर्गठन mononucleosomes की अखंडता का आकलन करें.
रपट और assays के बंधन आसानी से व्याख्या nucleosome का संचालन करने के लिए, यह समरूप mononucleosomal substrates उत्पन्न करने के लिए उपयोगी है; कारण है कि, इस प्रोटोकॉल में वर्णित परख एक मजबूत nucleosome स्थिति अनुक्रम युक्त डीएनए टुकड़ा पर इकट्ठे nucleosomes का उपयोग करता है. INO80 परिसर में एक डीएनए टुकड़ा पर एक अधिक केंद्रीय स्थिति को पार्श्व तैनात nucleosomes का स्थान करने के लिए जाता है, ऐसे ISWI युक्त NURF जटिल 9 के रूप में अन्य chromatin remodeling एंजाइमों,, डीएनए टुकड़े की छोर की ओर अधिक केंद्रीय पदों से nucleosomes चाल है. इस प्रकार, किसी भी chromatin remodeling के लक्षण वर्णन के दौरान एनयह nucleosome स्थिति अनुक्रम विभिन्न स्थानों पर जो में mononucleosome substrates तैयार करने के लिए उपयोगी है Zyme. वैकल्पिक रूप से, एक nucleosomes एक nucleosome स्थिति अनुक्रम के बिना डीएनए टुकड़े पर इकट्ठा किया गया है जिसमें substrates काम कर सकते हैं. इस मामले में शुरू nucleosome जनसंख्या अधिक केन्द्र और पार्श्व तैनात nucleosomes का एक मिश्रण शामिल होंगे.
एटीपी निर्भर nucleosome remodeling प्रक्रिया प्रतिक्रिया संतुलन तक पहुँच जाता है एक बार nucleosomes की स्थिति में परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व नहीं कर सकते कि डीएनए से पूरा nucleosome विस्थापन, डीएनए पर nucleosome आंदोलन, या nucleosome संरचना में क्षणिक परिवर्तन सहित विभिन्न remodeling परिणामों को जन्म दे सकता लेकिन फिर भी कार्यात्मक महत्वपूर्ण हैं. nucleosome रपट परख पहले दो प्रतिक्रियाओं की निगरानी कर सकते वर्णित है, लेकिन nucleosome संरचना में क्षणिक परिवर्तन का पता लगाने में सक्षम नहीं हो सकता. कुछ ऐसे क्षणिक alt पता लगा सकते हैं कि एक परखerations फिसलने या nucleosomal डीएनए के आंशिक unwinding काटने की संभावना है nucleosome द्वारा octamer सतह से विस्थापित कर दिया गया है कि संयोजक डीएनए, जबकि nucleosome octamer की सतह पर nucleosomal डीएनए एक प्रतिबंध एंजाइम से काटने के लिए काफी हद तक दुर्गम है कि इस तथ्य का लाभ लेता है 10,11,12. Nucleosome remodeling एंजाइम यह प्रतियोगी 13 से हटाया नहीं जा सकता है कि अपने सब्सट्रेट करने के लिए इतना कसकर बांध ऐसी है कि एक परख भी घटना में विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है.
हमारे nucleosome फिसलने और assays देशी हेला सेल हिस्टोन के साथ तैयार mononucleosomal substrates का उपयोग INO80 गतिविधियों को मापने के बंधन. हालांकि, INO80 या अन्य chromatin remodeling एंजाइमों के पुनर्गठन गतिविधियों सिद्धांत में उपस्थिति या विशिष्ट बाद translational संशोधनों या हिस्टोन वेरिएंट की अनुपस्थिति से प्रभावित किया जा सकता है. इसके अलावा, mononucleosomes डि nucleosomes से अलग INO80 परिसर की गतिविधियों को प्रोत्साहित कर सकते हैं,या nucleosomes की एक सरणी. इस प्रकार, अधिक जटिल और विविध nucleosomal सब्सट्रेट का उपयोग को मापने INO80 परिसर की गतिविधियों INO80 chromatin remodeling परिसरों विनियमित रहे हैं जिसके द्वारा तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है.
Nucleosome remodeling और बाध्यकारी assays में radiolabeled डीएनए टुकड़े का उपयोग करने के लिए एक विकल्प के रूप में, कुछ जांचकर्ताओं ethidium ब्रोमाइड के साथ 14 nucleosomal डीएनए धुंधला द्वारा nucleosomes और / या डीएनए कल्पना; हालांकि, assays के आम तौर पर काफी अधिक एंजाइम के उपयोग की आवश्यकता है, इस प्रोटोकॉल में वर्णित एक की तुलना में काफी कम संवेदनशील हो सकता है गैर रेडियोधर्मी तरीकों का पता लगाने का उपयोग किया.
यहाँ वर्णित 32 पी आधारित परख का उपयोग समय के एक समारोह के रूप में ATPase प्रतिक्रियाओं की प्रगति की निगरानी हर समय बिंदु पर नमूना हैंडलिंग और विश्लेषण की अलग दौर की आवश्यकता है. एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में, ATPase गतिविधि प्रतिदीप्ति आधारित assays का उपयोग करके मापा जा सकता है हम इस जौव पत्र में वर्णित प्रक्रियाओं एटीपी निर्भर nucleosome remodeling की प्रक्रिया में INO80 या INO80 subcomplexes के तीन विभिन्न जैव रासायनिक गुण विशेषताएँ इस्तेमाल किया गया है. विभिन्न INO80 subcomplexes या इन assays में INO80 म्यूटेंट का उपयोग करके, यह INO80 nucleosome remodeling गतिविधि के लिए विभिन्न INO80 सब यूनिटों और / या डोमेन संरचनाओं के कार्यात्मक योगदान काटना और remodeling प्रतिक्रिया में कदम (ओं) को परिभाषित करने के लिए संभव है, जिस पर INO80 सब यूनिटों और / या डोमेन महत्वपूर्ण हो सकता है. इन प्रक्रियाओं अन्य nucleosome remodeling के अध्ययन और बाध्यकारी एंजाइम और ATPases W के लिए अनुकूलित किया जा सकताith DNA- और nucleosome आश्रित या स्वतंत्र गतिविधियों दोनों. हम अलग अलग chromatin remodeling एंजाइमों मानव INO80 परिसर से अधिक या कम आंतरिक ATPase या nucleosome remodeling गतिविधियों के लिए हो सकता है कि ध्यान दें. अन्य chromatin remodeling एंजाइमों के विश्लेषण के लिए इन प्रोटोकॉल आदत डाल जब विशेष एंजाइमों का अध्ययन किया जा रहा है के लिए इसलिए, एक assays के अनुकूलन करने के क्रम में एंजाइम, एटीपी, डीएनए या nucleosomes, और प्रतिक्रिया समय और / या तापमान की सांद्रता भिन्न चाहिए.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| 10x PCR reaction buffer | Roche Applied Science | 11435094001 | |
| Roche Taq DNA Polymerase | Roche Applied Science | 11435094001 | |
| NucAway Nuclease-free Spin Columns | Ambion | Cat. # AM10070 | |
| ultrapure ATP | USB/Affymetrix | 77241 25 UM | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| 40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Amresco | 0254-500ML | |
| Sonicated salmon sperm DNAs | GE Healthcare | 27-4565-01 | |
| 10% ammonium persulfate (APS) | Thermo Scientific | 17874 | |
| benzonase | Novagen | Cat. No. 70664 | |
| dCTP, [α-32P]- 6,000 Ci/mmol | PerkinElmer | BLU013Z250UC | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| Hoefer vertical electrophoresis unit | Hoefer | SE600X-15-1.5 | |
| lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 | |
| Storage Phosphor Screen | Molecular Dynamics | 63-0034-79 | |
| 3MM filter paper | Whatman | 28458-005 | VWR |
| Typhoon PhosphorImager | GE Healthcare | 8600 | |
| ImageQuant software | GE Healthcare | ver2003.02 | |
| TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F | Millipore | 5725-7 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe | Biodex | Model 14C |
References
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