Introduction
SnF2 familie kromatin remodeling komplekser indbefatter en central SnF2-lignende ATPase underenhed 1,2. Nogle SnF2-lignende ATPaser funktion som enkelt subunit enzymer, mens andre fungere som den katalytiske underenhed af større multi-subunit-komplekser. Belyse de molekylære mekanismer, som hver af de underenheder af kromatin remodeling komplekser bidrage til deres aktiviteter kræver evnen til at udføre biokemiske analyser, der dissekerer remodeling proces.
ATP-afhængig nukleosom remodellering af den menneskelige INO80 kompleks og andre chromatin remodeling enzymer kan forudses som en multi-trins proces, der begynder med binding af remodeling enzym til nukleosomer, efterfulgt af aktivering af dens DNA- og / eller nukleosom-afhængig ATPase, translokation af ombygningen enzymet på nukleosomal DNA og eventuel repositionering af nucleosomer 1,2. Forståelse af de molekylære detaljer i ATP-afhængig kromatin remodellering proces requires dissektion af ombygningen reaktion i sine enkelte trin og definition af bidrag fra de enkelte underenheder af kromatin remodeling komplekse til hvert trin af reaktionen. Sådanne analyser kræver evnen til at analysere nukleosom ombygninger og andre aktiviteter ved hjælp af definerede molekylære substrater in vitro.
I en tidligere JOVE protokol, vi beskrev procedurer, der anvendes til at generere INO80 kromatin remodeling komplekser og subcomplexes med definerede subunit kompositioner 3. Her præsenterer vi tre biokemiske analyser, der muliggør kvantitativ analyse af nukleosom bindende DNA- og nukleosom aktiveret ATPase, og nukleosom remodeling aktiviteter i forbindelse med sådanne komplekser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ATP-afhængige nukleosom Remodeling assays
Til måling af ATP-afhængig nukleosom remodeling aktiviteter immunooprenset INO80 eller INO80 subcomplexes inkuberes med ATP og en mononucleosomal substrat, som indeholder en enkelt nukleosom placeret ved den ene ende af et 216 bp, 32P-mærket DNA-fragment. Reaktionsprodukterne underkastes derefter elektroforese i native poly-acrylamid-geler.
- For at generere 32P-mærket, 601 'DNA-fragment, forstærke fra pGEM-3Z-601 4 et 216 bp DNA-fragment indeholdende en ende beliggende 601 nukleosom positionering sekvens anvendelse af oligonukleotiderne 5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG og 5'-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG som forward og reverse primere.
- Opsætning af en 100 pl PCR-reaktion som beskrevet i tabel 1.
- Udfør PCR reaktioner i en thermocycler ved hjælp af følgende programmer: 1 min ved 96 ° C, followed fra 45 sekunder ved 94 ° C, 30 sekunder ved 57 ° C, 60 sekunder ved 72 ° C i 30 cykler; slutter med 7 min ved 72 ° C.
- Efter PCR-reaktionen er afsluttet, fjernes de ikke-inkorporerede nukleotider ved passage reaktionsprodukterne to gange gennem Nuclease-Free spinsøjler.
- Kør 5 ul af oprensede PCR-produkt i en 1,2% agarosegel for at bekræfte, at PCR-reaktionen genererede den ønskede ~ 216 bp DNA-fragment.
- Fortynd 5 ul af oprensede PCR-produkt 20-fold, og måle DNA-koncentration ved hjælp af et UV-spektrofotometer. Det gennemsnitlige udbytte er ~ 40 ng / ul.
- Mål radioaktiviteten af 1 ml af det oprensede PCR-produkt i en scintillationstæller. Vurdere mærkningseffekt ved at beregne cpm / ng. En vellykket mærkning reaktion forventes at give ~ 15.000 cpm / ng 601 DNA-fragment.
- Overførsel Hela-celle nukleosomer på det mærkede 601-DNA ved hjælp af en seriefortynding metode 5.
- Bland 2 pmol32P-mærket 601 DNA-fragment med 6 ug Hela nukleosomer (fremstillet som beskrevet 5) i 50 pi af en buffer indeholdende 1,0 M NaCI, 10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF og 1 mM DTT og inkuberes ved 30 ° C i 30 minutter.
- Sekventielt fortyndes blandingen til 0,8 M, 0,6 M og 0,4 M NaCI ved fortynding med 12,5 pi, 20,8 pi, og 41,6 pi af henholdsvis 10 mM Tris-HCI (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF, og 1 mM DTT med en 30 minutters inkubation ved 30 ° C efter hver fortynding.
- Yderligere fortyndes blandingen til 0,2 M og derefter til 0,1 M NaCl ved tilsætning af 125 pi og 250 pi af den samme buffer indeholdende 0,1% Nonidet P-40, 20% glycerol og 200 ug / ml BSA, med en 30 minutters inkubation ved 30 ° C mellem de sidste to fortyndinger. Opbevar mononucleosome substrat ved 4 ° C i op til 3 måneder.
- Udfør ATP-afhængige nukleosom glidende reaktioner i et samlet volumen på 10 ul. ReaKTIONSLINJE komponenter er angivet i tabel 2. Da den optimale NaCI-koncentration for INO80 nukleosom remodeling aktivitet er ~ 50 mM NaCI (ikke offentliggjorte resultater), justeres den samlede koncentration af NaCI i hver reaktion til 50 mM, idet der tages hensyn til mængden af NaCl, der er indeholdt i præparater af nukleosomer og enzym.
- Inden du begynder at oprette analyser, støbt native poly-acrylamid geler (18 x 16 cm). For at fremstille en enkelt gel indeholdende 5% acrylamid (acrylamid: bisacrylamid 37,5: 1), 0,5 x TBE (45 mM Tris-borat, 1 mM EDTA), 0,01% ammoniumpersulfat (APS) og 0,001% N, N, N, N'-tetramethylethylendiamin (TEMED), blande ingredienserne, der er anført i tabel 3. Lad gelen polymerisere i mindst 2 timer ved stuetemperatur.
- I mellemtiden, for hver reaktion, der skal udføres, sammen i en pre-kølet silikoniseret 1,5 ml mikrocentrifugerør ~ 20 nM INO80 eller INO80 subcomplex (fremstillet som beskrevet 3) med et beløb på EB100 buffer (
- Opsætning af en mester cocktail med resten af ingredienserne, skalering op med en faktor på 'X' (hvor X = det samlede antal reaktioner +3). Mængden af hver ingrediens er nødvendig for en enkelt 10 pi reaktion er anført i tabel 5; opskriften skal skaleres op i henhold til antallet af reaktioner, der skal udføres. Bland godt ved at trykke på rør eller ved pipettering op og ned med en Pipetman og spin røret i et par sekunder i en bordplade mikrocentrifuge.
- Dispensér 5,25 pi af master cocktail til hver af reaktionsglassene oprettet i trin 1.3.2. Bland godt ved pipettering op og ned. Start reaktionerne ved at overføre reaktionsrørene til en 30 ° C varmeblok eller et vandbad, og der inkuberes i 2 timer.
- Mellemtiden forbereder 'fjerne mix «cocktail indeholdende konkurrerende DNAog nukleosomer, opskalering med en faktor X (X = det samlede antal reaktioner + 4). Mængden af hver ingrediens er nødvendig for at forberede 1,5 pi fjerne mix til en enkelt reaktion er anført i tabel 6; opskriften skal skaleres op afhængigt af antallet af analyser, der skal udføres.
- Afslut reaktioner ved at lægge 1,5 ul af fjerne mix. Bland godt, spin ned og inkuberes ved 30 ° C i yderligere 30 minutter.
- I mellemtiden, præ-køre nativ polyacrylamidgel i en vertikal elektroforeseenhed ved 100 V i 30 minutter ved 4 ° C under anvendelse af 0,5 x TBE som flydende buffer med en magnetisk omrører inde i det nedre kammer til at opretholde konstant puffer omsætning.
- For at indlæse prøven, tilsættes 2,5 pi lastning farvestof indeholdende 3x TBE, 30% glycerol, 0,25% bromphenolblåt, og 0,25% XylenCyanol FF. Bland godt, kort spinde prøverne, og læg på gelen ved hjælp Tip til ilægning.
- Kør gel ved 200 V i 4,5 timer ved 4 ° C med puffer omsætning.
- For at detektere det signal, overføres gelen til en stabel af to lag filtrerpapir. Filteret omvikles papir med gelen på toppen ved hjælp af klar plast wrap, og derefter udsætte det for en Storage phosphor screen ved 4 ° C for den ønskede tid.
- Scan skærmen med en isotop billedbehandling scanner systemet og analysere data ved hjælp af passende software.
2. Mononucleosome Bindingsassays
For at analysere bindingsaffiniteten af en given INO80 kompleks for mononucleosomes udføre en elektroforetisk mobilitet (EMSA) med mononucleosomal substrat genereret i trin 1.2.
- Opsæt reaktionen blandinger til bindingsassays som beskrevet for nukleosom remodeling analyser, men udelader ATP og fjerne mix fra reaktionerne; inkuberes ved 30 ° C i 30 minutter.
- Tilføj 2,5 ul lastning farvestof til hver reaktionsblanding, og gælder for en indfødt polyacrylamidgel indeholdende 3,5% acrylamid (acrylamid: bis 37.5: 1), 1% glycerol, 0,5 x TBE, 0,01% APS og 0,001% TEMED.
- Brug 0,5x TBE som flydende buffer, køre gelen ved 200 V i 2,5 timer ved 4 ° C med buffer cirkulation og udsættes for en Storage phosphor screen.
3. dna-og nukleosom afhængige ATPase assays
Udfør ATPase assays 5 pi reaktionsblandinger indeholdende 20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 60 mM NaCI, 6,6 mM MgCl2, 0,8 mM EDTA, 0,015% Nonidet P-40, 2,5% glycerol, 0,1 mg / ml BSA, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 2 mM ATP, 2 uCi [α- 32P] ATP (3000 Ci / mmol). For hver INO80 kompleks eller mængden af INO80 kompleks, der skal analyseres oprettet tre parallelle reaktioner, hvoraf den ene indeholder EB100 buffer til at måle DNA- eller nukleosom-uafhængig ATPase, en indeholdende lukket cirkulært plasmid-DNA (5000 bp, ~ 30 nM) til at måle dna- afhængig ATPase, og en med Hela oligonucleosomes (~ 185 nM) til måling nukleosom-afhængig ATPase. Opsæt alle reaktioner på is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tallene viser repræsentative resultater af biokemiske assays, der anvendes til at karakterisere INO80, herunder nukleosom glidende (figur 1), og binding (figur 2) assays og DNA- eller nukleosom-afhængig ATPase-assays (figur 3).
Den i figur 1 viste eksperiment sammenligner evnen af intakte INO80 komplekser renses ved FLAG-Ies2 eller FLAG-INO80E og INO80 subcomplexes renses ved enten FLAG-Ino80ΔN eller Ino80ΔNΔHSA at katalysere omdannelse af mononucleosomes samles på et 216 bp radiomærket DNA-fragment. Positionen af nukleosom på DNA-fragmentet påvirker elektroforetisk mobilitet; sideværts positionerede nukleosomer køre hurtigere i gelen end mere centralt placerede nukleosomer. Da INO80 kromatin remodeling komplekser fortrinsvis bevæge mononucleosomes mod midten af et stykke DNA 6,7,8, remodeling aktivitet er monitored af fremkomsten af en population af nukleosomer der udviser nedsat elektroforetisk mobilitet. Ved slutningen af reaktionen, skal et overskud af Hela oligonucleosomes og laksesperma eller andet DNA tilsættes til reaktionsblandingen som konkurrent for at fjerne eventuelle substrat-bundne INO80 eller INO80 subcomplexes, da bundet remodeling enzym vil ændre den elektroforetiske mobilitet nukleosom substrat. Komplekser renset gennem FLAG Ino80ΔN mangler metazoan-specifikke underenheder INO80D, INO80E, Amida, MCRS1, NFRKB og UCH37, mens komplekser renset gennem Ino80ΔNΔHSA mangler også Arp4, Arp8 og YY1. Komplekser oprenset gennem FLAG-Ies2, FLAG-INO80E, og FLAG-Ino80ΔN har lignende aktiviteter, hvilket indikerer, at de metazoan-specifikke underenheder kan undværes til nukleosom ombygning af INO80 kompleks. I modsætning hertil renses komplekser gennem FLAG-Ino80ΔNΔHSA er inaktive i dette assay indikerer, at remodeling aktivitet afhænger af HSA domæne af Ino80 ATPASE og / eller dets associerede underenheder.
Forsøgene i figur 2 sammenligner nukleosom bindende aktiviteter INO80 og INO80 subcomplexes anvender elektroforetisk mobilitet skift assays. Disse assays udføres på samme måde som nukleosom remodeling assays, bortset fra at der er ingen tilsætning af oligonucleosomes og DNA ved afslutningen af reaktionen at fjerne nukleosom-bundne komplekser. Følgelig inkubation af nukleosomer med stigende mængder af intakte INO80 komplekser oprenses gennem INO80E underenheden fører til en dosisafhængig forsvinden af båndet svarende til frie mononucleosomes og fremkomsten af en ny "forskudt" arter, der migrerer nær toppen af gelen (bane 6-8). I modsætning hertil, når nukleosomer inkuberes med mindre komplekser, som var blevet oprenset gennem Ino80ΔN og der mangler en delmængde af INO80 underenheder, de forskudte arter migrerer hurtigere (bane 2-5 og 9-11), hvilket antyder, at den relative hobility af den super-skiftede bånd bestemmes af størrelsen af komplekserne analyseret.
Figur 3 viser resultater af en analyse at sammenligne dna- og nukleosom-aktiverede ATPase aktiviteter to forskellige INO80 subcomplexes. De langsommere migrerende pletter svarer til udgangspunktet α- 32P-mærket ATP og de hurtigere migrerende arter ADP reaktionsprodukter; Pilene angiver retningen af migration opløsningsmiddel.
En af komplekserne analyseret her INO80ΔN indeholder et Ino80 ATPase-underenhed, der strækker sig til proteinet normale C-terminale ende, mens den anden, INO80ΔNC mangler den C-terminale region Ino80. Selv om disse to komplekser er ellers identisk, satsen for ATP-hydrolyse (målt ved omdannelse af radioaktivt mærket ATP til ADP) er større i nærværelse af INO80ΔNC, hvilket tyder på C-terminalen af Ino80 ATPase kan have en negativ regulere dets aktivitet. Bemærk, at hastigheden af ATP hydrolysis af begge komplekser er større i nærværelse af nukleosomer end DNA, hvilket tyder på INO80 nukleosom remodeling komplekser foretrækker nukleosomale substrater for ATP hydrolyse.
I assayet er vist i figuren, er der kun et meget lavt niveau af ATP hydrolyse i reaktioner, som mangler DNA eller nukleosomer (varierende fra upåviselige til <5%, der blev observeret i tilstedeværelsen af DNA / nucleosomer). Fordi ATPase aktivitet INO80 og andre SnF2 familie chromatin remodeling enzymer kraftigt stimuleret af DNA eller nukleosomer, vil tilstedeværelsen af betydelige DNA- og / eller nukleosom uafhængigt ATPase-aktivitet i oprensede præparater af INO80 kompleks antyder tilstedeværelsen af kontaminerende cellulære DNA, eller alternativt, kontaminerende non-INO80 ATPaser, som ikke blev fjernet under rensningen. Kan tages flere skridt til at minimere indføre uønsket DNA og / eller ATPase under oprensningen.
1) Øge skoncentration højde (NaCl) i de bindende og vaske trin under oprensningen. Brug af mindre end 200 mM NaCl i binding og vasketrinene giver normalt præparater af remodeling komplekser med uacceptable niveauer af kontaminerende DNA og / eller ATPaser. Vi rutinemæssigt rense INO80 komplekser ved hjælp af en buffer indeholdende 450 mM NaCI for at minimere kontaminanter (beskrevet i 3). Vi har brugt buffere indeholdende så meget som 1 M NaCI for at oprense aktive INO80 komplekser; Men vi får en nedsat udbytte af aktive komplekser under disse betingelser;
2) Reducer forholdet mellem FLAG agarose til cellelysat under immunrensning; den optimale mængde af FLAG-agarose bør bestemmes ved titrering;
3) ATP-afhængige chaperoner kan forblive bundet til FLAG-mærkede proteiner under immunrensning. Disse kan ofte fjernes ved at inkludere 1 mM ATP i vaskebuffer under immunooprensning;
4) Vi har lykkedesy fjernet kontaminerende DNA ved at inkludere benzonase ved en koncentration på 25 enheder / ml under inkubation af ekstrakten med FLAG-agaroseperler. ADVARSEL: Det er vigtigt at sørge for benzonase fjernes under de efterfølgende vasketrin, da resterende DNase vil forringe substrat DNA eller nukleosomer under assays for INO80 aktivitet.
Fortolkningen af disse ATPase assays kunne i princippet blive kompliceret af det faktum, at INO80 kromatin remodeling komplekser indeholder flere potentielle ATPaser, herunder SnF2-lignende kerne ATPase Ino80, actin-lignende proteiner Arp5, Arp8, Baf53a, actin og AAA + ATPaser Tip49a og Tip49b. På trods af den fysiske tilstedeværelse af flere ATPaser har dog tidligere undersøgelser vist, at kun komplekser indeholdende katalytisk aktive Ino80 kan støtte DNA- eller nukleosom aktiveret ATP hydrolyse; komplekser, der indeholder det katalytisk inaktive E653Q form af Ino80 ATPase udviser ikke påviselig DNA- eller nukleosom-stimuleret ATPase-aktivity under alle forhold testede 8. Således er DNA- og / eller nukleosom-stimuleret ATPaseaktivitet af INO80 eller INO80 subcomplexes hovedsageligt bidrager med Ino80 ATPase underenhed.
Figur 1. INO80 nukleosom remodeling aktivitet afhænger Ino80 HSA domæne og / eller associerede underenheder, men er uafhængig af Ino80 NTD og metazoan-specifikke underenheder. Nukleosom remodeling assays blev udført med FLAG-immunooprenset komplekser fra nukleare ekstrakter fremstillet fra cellelinier, der udtrykker FLAG tagged versioner af vildtype eller mutant INO80 underenheder. Intakte INO80 komplekser blev oprenset fra cellelinier, der udtrykker FLAG-Ies2 eller FLAG-INO80E; INO80 subcomplexes blev oprenset fra cellelinjer, der udtrykker FLAG-Ino80ΔN eller FLAG-Ino80ΔNΔHSA. En relativ koncentration (rel. Konc.) På 1 svarer til ~ 10 nM INO80 kompleks.
Figur 2. nukleosom binding af INO80 kompleks er uafhængig af Ino80 NTD og metazoan-specifikke underenheder. Nukleosom bindingsanalyser blev udført i nærvær af varierende mængder af den angivne FLAG-immunooprenset INO80 kompleks. Binding af INO80 eller INO80 subcomplexes at mononucleosomes resultater i fremkomsten af langsomt migrere "super-flyttet" bånd svarende til mononucleosomes stabilt bundet af INO80 eller INO80 subcomplexes. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 "src =" / filer / ftp_upload / 51721 / 51721fig3highres.jpg "/>
Figur 3. DNA- og nukleosom afhængige ATPase assays. TLC (tyndtlagskromatografi) -baseret ATPase-assays blev udført for at måle hastigheden af ATP hydrolyse af INO80 subcomplexes renses ved FLAG-Ino80ΔN (AN) eller FLAG-Ino80ΔNC (ΔNC) i tilstedeværelse af mættende mængder af DNA eller nukleosomer. Assays blev udført ved anvendelse af to forskellige koncentrationer af hvert kompleks (5 nM og 10 nM) og for tre forskellige reaktionstider. Mængden af ATP hydrolyseres (i pmol) i reaktionerne er angivet under hvert panel. Klik her for at se en større version af dette tal.
| 67,5 pi | H2O |
| 10 ul | 10x PCR-buffer (se Materialer List) | </ Tr>
| 1 pi | pGEM-3Z-601 (10 ng / ul) |
| 5 mikroliter | fremadrettet primer (10 um) |
| 5 mikroliter | revers primer (10 um) |
| 0,5 pi | dNTP stamopløsning indeholdende 10 mM af hver af de 4 dNTP'er |
| 1 pi | Taq-DNA-polymerase (5 enheder / pl) |
| 10 ul | [Α- 32P] dCTP (6000 Ci / mmol, 3,3 uM) |
Tabel 1. reaktionsblanding til PCR-amplifikation af radioaktivt mærket "601" DNA-fragment.
| 20nM | INO80 eller INO80 subcomplexes |
| 2,8 nM | nukleosomer (bestående af en blanding af mononucleosomes på 32P-mærkede 601-DNA-fragment og Hela-celle nukleosomer) |
| 1 mM | ultrarent ATP |
| 20 mM | HEPES-NaOH (pH 7,9) |
| 50 mM | NaCl |
| 5 mM | MgCl2 |
| 1 mM | dithiothreitol (DTT) |
| 0,1 mM | phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) |
| 0,1 mg / ml | bovint serumalbumin (BSA) |
| 5% | glycerol |
| 0,02% | Nonidet P-40 |
| 0,02% | Triton X-100 |
Tabel 2. Komponenter af ATP-afhængig nukleosom remodeling assays.
| 32,6 ml | H2O |
| 5 ml | 40% acrylamid / bis (37,5: 1) |
| 2 ml | 10x TBE (900 mM Tris-borat, 20 mM EDTA) |
| Følgende ingredienser tilsættes umiddelbart før hælde gelen: | |
| 0,4 ml | 10% ammoniumpersulfat |
| 0,1 ml | TEMED |
Tabel 3. Fremstilling af nativ polyacrylamidgel for ATP-afhængig nukleosom remodeling assays.
| 10 mM | HEPES, pH 7,9 |
| 10% | glycerol |
| 100 mM | NaCl |
| 1,5 mm | MgCl2 |
| 0,05% | Triton X-100 |
| Tilføj lige før brug: | |
| 1 mM | DTT |
| 200 uM | PMSF |
| 1: 1000 fortynding | Proteasehæmmer Cocktail (se Materialer List) |
Tabel 4. EB100 puffer.
| 3,9 pi | H2O |
| 1 pi | 10x Remodeling buffer (200 mM HEPES-NaOH (pH 7,9), 0,2% NP-40, 0,2% Triton X-100, 50% glycerol, 50 mM MgCl2, 1 mg / ml BSA) |
| 0,1 pi | 100 mM ATP |
| 0.01 pi | 1 M DTT |
| 0.01 pi | 100 mM PMSF |
| 0,25 pi | rekonstitueret mononucleosome underlag fra Trin 1.2 |
Tabel 5. Komponenter i master cocktail for ATP-afhængige nukleosom remodeling analyser.
| 0.33 pi | 400 nM Hela nukleosomer |
| 0,75 pi | 100 nM sonikeret laksesperm DNA'er |
| 0.01 pi | 1 M DTT |
| 0.01 pi | 100 mM PMSF |
Tabel 6. Fjernelse mix cocktail.
| 2 pi | H2O |
| 0,25 pi | 20x ATPase-buffer indeholdende 400 mM Tris-HCI (pH 7,5), 200 mM NaCI, 132 mM MgCl2, 16 mM EDTA, 0,3% Nonidet P-40, 50% glycerol, 2 mg / ml BSA |
| 0,1 pi | 100 uM ATP |
| 0.005 pi | 1 M DTT |
| 0.005 pi | 100 mM PMSF |
| 0,1 pi | [Α- 32 P] ATP (3000 Ci / mmol) |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at sikre at nukleosom remodeling og ATPase-aktiviteter, vi observerer i assays afhænger af den katalytiske aktivitet af INO80 komplekser, og ikke på kontaminerende remodeling og / eller ATPase-enzymer, vi rutinemæssigt assay nukleosom remodeling og ATPase-aktivitet af katalytisk inaktive versioner af INO80 komplekser oprenses i parallelt med vildtype INO80 efter samme procedure. En negativ kontrol reaktion mangler ATP skal også udføres, når analyse nukleosom remodeling aktivitet at teste for tilstedeværelsen af kontaminerende ATP og / eller ATP-uafhængige remodeling aktiviteter, der kunne vanskeliggøre fortolkning af eksperimenter sammenligne aktiviteterne i forskellige tilberedninger af INO80 komplekse eller subcomplexes. Katalytisk inaktive versioner af INO80 eller INO80 subcomplexes skal udvise nogen nukleosom remodellering eller ATPase-aktiviteter. Desuden påvisning af DNA- eller nukleosom-uafhængig ATPaseaktivitet indikerer tilstedeværelsen af kontaminerende ATPase (r) i enzyme fraktion. Hvis aktiviteten stadig detekteres i nærvær af katalytisk inaktiv Ino80 eller hvis der er væsentlig DNA- eller nukleosom-uafhængig ATPaseaktivitet selv efter at optimere oprensning som beskrevet i "Repræsentative resultater," komplekser kan renses yderligere ved hjælp af yderligere trin, såsom ionbytning eller gelfiltreringskromatografi eller gradient sedimentation.
Ved måling nukleosom remodeling og ATPase aktiviteter, er det tilrådeligt at udføre analyser for kortere eller længere tid og med mere end én koncentration INO80 eller INO80 subcomplexes at sikre målinger bliver taget, når produkt-tid og dosis-respons kurver er lineær. Tilsvarende bør nukleosom bindingsassays udføres under anvendelse af flere koncentrationer af INO80 kompleks (r); ellers kan man ikke pålideligt sammenligne aktiviteter af forskellig INO80 præparater.
Nukleosom glidende og bindingsassays bør altid omfatte kontrol reaktionerder omfatter mononucleosome substrat alene som en markør til at vise den elektroforetiske mobilitet af udgangsmaterialet nukleosom befolkning. På denne måde kan man nemt identificere ændringer som følge specifikt til tilstedeværelse af fraktionen enzym. Sådanne kontrolforanstaltninger reaktioner også vurdere integriteten af de rekonstituerede mononucleosomes.
For at kunne gennemføre let fortolkelige nukleosom glidende og bindende assays, er det nyttigt at generere homogene mononucleosomal substrater; derfor assayet beskrevet i denne protokol anvender nukleosomer samles på et DNA-fragment indeholdende en stærk nukleosom positionering sekvens. Selvom INO80 komplekset har tendens til at flytte sig sideværts placerede nukleosomer til en mere central placering på et DNA-fragment, andre chromatin remodeling enzymer, såsom ISWI-holdige NURF kompleks 9 flytte nukleosomer fra flere centrale positioner mod enderne af DNA-fragmenter. Således ved karakteriseringen af en chromatin remodeling dazyme det er nyttigt at fremstille mononucleosome substrater, hvor nukleosom positionering sekvens er på forskellige steder. Alternativt kan man anvende substrater, hvor nukleosomer er blevet samlet på DNA-fragmenter uden et nukleosom positionering sekvens. I dette tilfælde vil udgangsmaterialet nukleosom befolkning omfatte en blanding af mere centralt og lateralt placerede nukleosomer.
ATP-afhængige nukleosom remodeling proces kan føre til forskellige remodeling udfald, herunder fuldstændig nukleosom forskydning fra DNA, nukleosom bevægelse på DNA eller forbigående ændringer i nukleosom struktur, som ikke kan føre til ændringer i holdninger nukleosomer Når reaktionen når ligevægt men ikke desto mindre er funktionelt signifikant. Den nukleosom glidende beskrevne analyse kan overvåge de to første reaktioner, men kan ikke være i stand til at detektere forbigående ændringer i nukleosom struktur. En analyse, der kan opdage nogle sådanne forbigående altvejelser drager fordel af det faktum, at nukleosomal DNA på overfladen af nukleosom octamer er stort set utilgængelig for skæring af et restriktionsenzym, der linker-DNA, som er blevet fordrevet fra octameren overfladen ved nukleosom glidende eller delvis afvikling af nukleosomal DNA er modtagelige for at skære 10,11,12. En sådan analyse kan også være særligt nyttige i tilfælde af, at nukleosom remodeling enzymet bindes så fast til dets substrat, at det ikke kan fjernes ved konkurrent 13.
Vores nukleosom glidende og bindende assays måler INO80 aktiviteter ved hjælp mononucleosomal substrater tilberedt med indfødte Hela celle histoner. Dog kan remodeling aktiviteter INO80 eller andre kromatin remodellering enzymer i princippet blive påvirket af tilstedeværelse eller fravær af specifikke post-translationelle modifikationer eller histon-varianter. Desuden kan mononucleosomes stimulere INO80 komplekse aktiviteter anderledes end di-nukleosomer,eller en vifte af nucleosomer. Således kan måle INO80 komplekse aktiviteter ved hjælp af mere komplicerede og forskelligartede nukleosomal substrat give indsigt i den mekanisme, hvormed INO80 kromatin remodeling komplekser reguleres.
Som et alternativ til anvendelse af radioaktivt mærkede DNA-fragmenter i nukleosom remodellering og bindingsassays nogle forskere visualisere nukleosomer og / eller DNA ved farvning nukleosomal DNA med ethidiumbromid 14; dog assays udført ved anvendelse af ikke-radioaktive påvisningsmetoder kan være betydeligt mindre følsom end den, der beskrives i denne protokol, der typisk kræver brug af betydeligt mere enzym.
Overvågning af udviklingen af ATPase-reaktioner som en funktion af tid ved hjælp af 32P-assay beskrevet her kræver separate runder af prøvehåndtering og analyse ved hvert tidspunkt. Som en alternativ fremgangsmåde kan måles ATPase-aktivitet ved hjælp af fluorescens-baserede assays De procedurer, vi beskrevet i dette JOVE papir er blevet anvendt til at karakterisere tre forskellige biokemiske egenskaber INO80 eller INO80 subcomplexes i færd med ATP-afhængig nukleosom remodellering. Ved hjælp af forskellige INO80 subcomplexes eller INO80 mutanter i disse assays, er det muligt at dissekere de funktionelle bidrag fra forskellige INO80 underenheder og / eller domæne strukturer til INO80 nukleosom remodeling aktivitet og definere trin (r) i remodeling reaktionen ved hvilken INO80 underenheder og / eller domæner kan være vigtigt. Disse procedurer kan tilpasses til undersøgelse af andre nukleosom remodellering og bindende enzymer og ATPaser wed både DNA- og nukleosom-afhængige eller uafhængige aktiviteter. Vi bemærker, at forskellige kromatin remodeling enzymer kan have højere eller lavere iboende ATPase eller nukleosom remodeling aktiviteter end den menneskelige INO80 kompleks. Derfor, når tilpasning af disse protokoller til analyse af andre chromatin remodeling enzymer bør man variere koncentrationen af enzymet ATP DNA eller nukleosomer, og reaktionstemperaturer gange og / eller for at optimere de assays til de særlige enzymer, der undersøges.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| 10x PCR reaction buffer | Roche Applied Science | 11435094001 | |
| Roche Taq DNA Polymerase | Roche Applied Science | 11435094001 | |
| NucAway Nuclease-free Spin Columns | Ambion | Cat. # AM10070 | |
| ultrapure ATP | USB/Affymetrix | 77241 25 UM | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| 40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Amresco | 0254-500ML | |
| Sonicated salmon sperm DNAs | GE Healthcare | 27-4565-01 | |
| 10% ammonium persulfate (APS) | Thermo Scientific | 17874 | |
| benzonase | Novagen | Cat. No. 70664 | |
| dCTP, [α-32P]- 6,000 Ci/mmol | PerkinElmer | BLU013Z250UC | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| Hoefer vertical electrophoresis unit | Hoefer | SE600X-15-1.5 | |
| lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 | |
| Storage Phosphor Screen | Molecular Dynamics | 63-0034-79 | |
| 3MM filter paper | Whatman | 28458-005 | VWR |
| Typhoon PhosphorImager | GE Healthcare | 8600 | |
| ImageQuant software | GE Healthcare | ver2003.02 | |
| TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F | Millipore | 5725-7 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe | Biodex | Model 14C |
References
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes. Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
- Narlikar, G. J., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and functions of ATP-dependent chromatin-remodeling enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
- Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, J. W., Conaway, R. C. Generation and purification of human INO80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes. , (2013).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 276 (1), (1006).
- Owen-Hughes, T., et al. Analysis of nucleosome disruption by ATP-driven chromatin remodeling complexes. Methods Mol. Biol. 119, 319-331 (1999).
- Udugama, M., Sabri, A., Bartholomew, B. The INO80 ATP-dependent chromatin remodeling complex is a nucleosome spacing factor. Mol. Cell Biol. 31 (4), 662-673 (2011).
- Jin, J., et al. A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (1074).
- Chen, L., et al. Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling. Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).
- Hamiche, A., Sandaltzopoulos, R., Gdula, D. A., Wu, C. ATP-dependent histone octamer sliding mediated by the chromatin remodeling complex NURF. Cell. 97 (7), 833-842 (1999).
- Polach, K. J., Widom, J. Restriction enzymes as probes of nucleosome stability and dynamics. Methods Enzymol. 304, 278-298 (1999).
- Anderson, J. D., Thastrom, A., Widom, J. Spontaneous access of proteins to buried nucleosomal DNA target sites occurs via a mechanism that is distinct from nucleosome translocation, Mol.Cell Biol. 22 (20), 7147-7157 (2002).
- Saha, A., Wittmeyer, J., Cairns, B. R. Chromatin remodeling through directional DNA translocation from an internal nucleosomal site. Nature Structural and Molecular Biology. 12 (9), 747-755 (2005).
- Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (33), 13770-13774 (2009).
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes. Nature. 492 (7428), 280-284 (2012).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Direct Webb, M. R. Real-Time Measurement of Rapid Inorganic Phosphate Release Using a Novel Fluorescent Probe and Its Application to Actomyosin Subfragment 1 ATPase, Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
- Luk, E., et al. Stepwise histone replacement by SWR1 requires dual activation with histone H2A.Z and canonical nucleosome. Cell. 143 (5), 725-736 (2010).
