Introduction
SNF2 Familie Chromatin-Remodeling Komplexe umfassen eine zentrale SNF2-ATPase-Untereinheit wie 1,2. Einige SNF2 artigen ATPasen Funktion als einzelne Untereinheit Enzyme, andere Funktion als die katalytische Untereinheit von größeren Multi-Untereinheiten-Komplexen. Aufklärung der molekularen Mechanismen, durch die jede der Untereinheiten von Chromatin-Remodeling-Komplexe beitragen, ihre Tätigkeit erfordert die Fähigkeit, biochemische Assays, die die Umbauprozess auszuführen sezieren.
ATP-abhängige Nukleosom-Remodeling vom menschlichen INO80 Komplex und andere Chromatin-Remodeling-Enzyme können nach einem mehrstufigen Prozess, der mit der Bindung des Enzyms an Nukleosomen Umbau beginnt in Betracht gezogen werden, gefolgt von der Aktivierung der DNA-und / oder Nukleosom-abhängige ATPase, Translokation des Enzyms auf Umbau nukleosomalen DNA und eventuelle Neupositionierung der Nukleosomen 1,2. Das Verständnis der molekularen Details der ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Prozess requires Dissektion der Umbau Reaktion in seine einzelnen Schritte des Wortes der Beiträge der einzelnen Untereinheiten des Chromatin-Remodeling-Komplexes, um jeden Schritt der Reaktion. Solche Analysen erfordern die Fähigkeit zur Analyse Nukleosomen Umbau-und andere Aktivitäten mit definierten molekularen Substrate in vitro.
In einem früheren JOVE Protokoll beschrieben wir Verfahren verwendet werden, um INO80 Chromatin-Remodeling-Komplexe und Subkomplexe mit definierten Untereinheit 3 Kompositionen zu erzeugen. Hier präsentieren wir drei biochemischen Assays, die quantitative Analyse der Nukleosomen-Bindung, DNA und Nukleosomen-ATPase aktiviert, und Nukleosomen Umbau Aktivitäten mit solchen Komplexen assoziiert zu ermöglichen.
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Protocol
1. ATP-abhängigen Nucleosome Remodeling Assays
Zur Messung ATP-abhängige Nukleosom-Remodeling-Aktivitäten, immun INO80 oder INO80 Subkomplexe mit ATP und einem mononucleosomal Substrat, welches eine einzelne Nukleosomen an einem Ende eines 216-bp-, 32 P-markierten DNA-Fragment enthält, angeordnet inkubiert. Die Reaktionsprodukte werden dann einer Elektrophorese in nativen Polyacrylamid-Gelen unterzogen.
- Die 32 P-markierten, "601"-DNA-Fragment zu erzeugen, zu verstärken, aus pGEM-3Z-601 4 a 216 bp DNA-Fragment, enthaltend eine endständige 601 Nukleosomen Positionierungssequenz unter Verwendung der Oligonukleotide 5'-und 5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG als Vorwärts und Rückwärtsprimer.
- Einrichten einer 100 ul PCR-Reaktion, wie in Tabelle 1 beschrieben.
- Die PCR-Reaktionen durchzuführen in einem Thermocycler mit folgendem Programm: 1 min bei 96 ° C, followed von 45 sec bei 94 ° C, 30 sec bei 57 ° C, 60 sec bei 72 ° C für 30 Zyklen; endend mit 7 min bei 72 ° C aufweist.
- Nach der PCR-Reaktion abgeschlossen ist, entfernen Sie die eingebauten Nukleotiden, indem die Reaktionsprodukte durch Nuclease-Free-Spin-Säulen zweimal.
- Versuch 5 ul des gereinigten PCR-Produkts in einem 1,2% Agarose-Gel, um zu bestätigen, dass die PCR-Reaktion erzeugt das gewünschte ~ 216 bp-DNA-Fragment.
- Verdünnen 5 ul des gereinigten PCR-Produkt 20-fach, und messen Sie die DNA-Konzentration mit einem UV-Spektrophotometer. Der Durchschnittsertrag ist ~ 40 ng / ul.
- Messung der Radioaktivität von 1 ul des gereinigten PCR-Produkts in einem Szintillationszähler. Schätzen Sie die Markierungseffizienz durch die Berechnung der cpm / ng. Eine erfolgreiche Markierungsreaktion wird erwartet, ~ 15.000 cpm / ng von 601 DNA-Fragment erhalten.
- HeLa-Zellen übertragen Nukleosomen auf der markierten DNA-601 über eine serielle Verdünnungsmethode 5.
- Mix 2 pmol32 P-markierten 601-DNA-Fragment mit 6 ug von Hela Nukleosomen (hergestellt wie beschrieben 5) in 50 ul eines Puffers, enthaltend 1,0 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF und 1 mM DTT und Inkubation bei 30 ° C für 30 min.
- Sequentiell verdünnt das Gemisch auf 0,8 M, 0,6 M und 0,4 M NaCl durch Verdünnen mit 12,5 ul, 20,8 ul, und 41,6 ul jeweils 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF, und 1 mM DTT, mit einer 30-minütigen Inkubation bei 30 ° C nach jeder Verdünnung.
- Weiteren Verdünnung der Mischung auf 0,2 M und 0,1 M NaCl durch Zugabe von 125 ul und 250 ul des gleichen Puffers, enthaltend 0,1% Nonidet P-40, 20% Glycerin und 200 ug / ml BSA, mit einem 30-minütigen Inkubation bei 30 ° C zwischen den beiden letzten Verdünnungen. Speichern die mononucleosome Substrat bei 4 ° C für bis zu 3 Monate.
- Führen ATP-abhängige Nukleosom Schiebe Reaktionen in einem Gesamtvolumen von 10 ul. Das REAction Komponenten sind in Tabelle 2 aufgeführt. Da die optimale NaCl-Konzentration für INO80 Nukleosom Remodeling-Aktivität ~ 50 mM NaCl (unveröffentlichte Ergebnisse), passen die Gesamtkonzentration von NaCl in jedem Reaktions bis 50 mM, unter Berücksichtigung der Menge von NaCl in geschlossenen Zubereitungen von Nukleosomen und Enzym.
- Vor Beginn der Tests, um die Einrichtung, Guss nativen Polyacrylamid-Gele (18 x 16 cm). Um eine einzelne Gel mit 5% Acrylamid vorzubereiten (Acrylamid: Bisacrylamid 37,5: 1), 0,5 x TBE (45 mM Tris Borat, 1 mM EDTA), 0,01% Ammoniumpersulfat (APS) und 0,001% N, N, N', N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED), mischen Sie die in Tabelle 3 aufgeführten Zutaten. Lassen Sie das Gel für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur polymerisieren.
- In der Zwischenzeit für jede Reaktion durchgeführt werden, verbinden sich in ein vorgekühltes 1,5 ml siliconisierten Mikrozentrifugenröhrchen ~ 20 nM INO80 oder INO80 Unterkomplex (hergestellt wie beschrieben 3) mit einer Menge von EB100 Puffer (
- Einrichten einer Master-Cocktail mit dem Rest der Bestandteile, Skalieren um einen Faktor von "X" (X = Gesamtzahl der Reaktionen +3). Die Menge jedes Bestandteils für eine 10 ul-Reaktion benötigt wird, aufgelistet in Tabelle 5; das Rezept sollte entsprechend der Anzahl von Reaktionen durchgeführt werden skaliert werden. Gut mischen, indem Sie den Schlauch oder durch Auf-und Abpipettieren mit einer Pipetman und drehen Sie das Rohr für ein paar Sekunden in einer Tischmikrozentrifuge.
- Verzichten 5,25 ul des Master-Cocktail zu jedem der Reaktionsgefäße in Schritt 1.3.2. Gut mischen durch Pipettieren von oben und unten. Starten Sie die Reaktionen, die durch ein auf 30 ° C Wärmeblock oder Wasserbad Übertragung Reaktionsröhrchen und Inkubation für 2 Stunden.
- Unterdessen bereiten die "Beseitigung Mix" Cocktail enthält Konkurrenz-DNAund Nukleosomen, Skalieren um einen Faktor von X (X = Gesamtzahl der Reaktionen + 4). Die Menge jeder Zutat benötigt, um 1,5 ul Entfernen Mischung für einen einzigen Reaktion vorzubereiten ist in Tabelle 6; das Rezept sollte abhängig von der Anzahl von Assays durchgeführt werden skaliert werden.
- Beenden Reaktionen durch Zugabe von 1,5 ul der Mischung zu entfernen. Gut mischen, Spin-down, und Inkubation bei 30 ° C für weitere 30 min.
- Inzwischen Vorlauf die native Polyacrylamid-Gel in einer vertikalen Elektrophorese-Einheit bei 100 V für 30 min bei 4 ° C mit 0,5 x TBE als Laufpuffer mit einem magnetischen Rührstab in der unteren Kammer zu konstanten Pufferkreislauf aufrecht zu erhalten.
- , Um die Probe zu laden, fügen 2,5 ul Ladefarbstoff enthält 3x TBE, 30% Glycerin, 0,25% Bromphenolblau, 0,25% Xylencyanol FF. Gut mischen, kurz drehen die Proben, und laden Sie auf das Gel mit Lade Tipps.
- Die Elektrophorese bei 200 V für 4,5 h bei 4 ° C mit Puffer Zirkulation.
- Um das Signal zu erfassen, zu übertragen, um das Gel zu einem Stapel aus zwei Blättern Filterpapier. Wickeln Sie das Filterpapier mit dem Gel auf mit klaren Plastikverpackung, und dann setzen Sie es zu einem Speicherleuchtschirm bei 4 ° C für die gewünschte Zeit.
- Scannen Sie den Bildschirm mit einem Isotop Imaging-Scanner-System und mit einer geeigneten Software die Daten analysieren.
2. Mononucleosome Bindungstests
Um die Bindungsaffinität eines gegebenen INO80 komplex Mononukleosomen Assay, führen einem elektrophoretischen Mobility Shift Assay (EMSA) unter Verwendung der in Schritt 1.2 generiert mononucleosomal Substrat.
- Bis die Reaktion eingestellt Mischungen für Bindungsassays für Nukleosomen Umbau Assays beschrieben, aber lassen Sie die ATP und Entfernen Mix aus den Reaktionen; Inkubieren bei 30 ° C für 30 min.
- Fügen 2,5 ul Beladungsfarbstoff zu jeder Reaktionsmischung und gelten für eine native Polyacrylamidgel, enthaltend 3,5% Acrylamid (Acrylamid: Bis 37,5: 1), 1% Glycerin, 0,5 × TBE, 0,01% APS und 0,001% TEMED.
- Mit 0.5x TBE als Laufpuffer, führen Sie das Gel bei 200 V für 2,5 h bei 4 ° C mit Pufferkreislauf und setzen auf ein Speicherleuchtschirm.
3. DNA und Nukleosomen-abhängige ATPase-Assays
Führen ATPase-Assays in 5 ul Reaktionsmischungen, enthaltend 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 60 mM NaCl, 6,6 mM MgCl 2, 0,8 mM EDTA, 0,015% Nonidet P-40, 2,5% Glycerin, 0,1 mg / ml BSA, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 2 mM ATP, 2 uCi [α- 32 P] ATP (3000 Ci / mmol). Für jedes komplexe INO80 oder die Menge des Komplexes zu prüfen INO80 bis drei Parallelreaktionen, eine mit EB100 Puffer, um DNA-oder Nukleosomen-unabhängige ATPase, ein Set bestehend messen geschlossen zirkuläre Plasmid-DNA (5000 bp, ~ 30 nM) zu messen, werden DNA- abhängige ATPase und eine mit Hela Oligonukleosomen (~ 185 nm), um Nukleosomen-abhängige ATPase messen. Richten Sie alle Reaktionen auf Eis.
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Representative Results
Die Zahlen zeigen repräsentative Ergebnisse von biochemischen Tests zur INO80 Aktivitäten charakterisieren, einschließlich Nukleosomen Schiebe (Abbildung 1) und Bindung (Abbildung 2)-Assays und DNA-oder Nukleosomen-abhängige ATPase-Assays (Abbildung 3).
Die in Figur 1 gezeigte Experiment vergleicht die Fähigkeit von intakten Komplexen durch INO80 FLAG-Ies2 oder FLAG-INO80E gereinigt und INO80 Subkomplexe durch entweder FLAG-Ino80ΔN oder Ino80ΔNΔHSA zu Umbau Mononukleosomen auf einem 216 bp, radioaktiv markierten DNA-Fragment, zusammengebaut zu katalysieren gereinigt. Die Position der Nukleosomen auf dem DNA-Fragment betrifft elektrophoretische Mobilität; seitlich positioniert Nukleosomen laufen schneller im Gel als zentraler positioniert Nukleosomen. Seit INO80 Chromatin-Remodeling-Komplexe bevorzugt Mononukleosomen bewegen in Richtung der Mitte ein Stück DNA 6,7,8, ist die Umgestaltung Aktivität monidurch die Entstehung einer Bevölkerung von Nukleosomen, die verringerte elektrophoretische Mobilität aufweisen überwacht. Am Ende der Reaktion muß ein Überschuß von Hela Oligonukleosomen und Lachssperma-DNA oder eine andere zu der Reaktionsmischung als Kompetitor zugegeben, um jegliche substratgebundenen INO80 oder INO80 Subkomplexe entfernen, da gebundene Umbau Enzym die elektrophoretische Mobilität der Nukleosomen ändern Substrat. Komplexe durch FLAG Ino80ΔN gereinigt fehlen die Metazoen-spezifische Untereinheiten INO80D, INO80E, Amida, MCRS1, NFRKB und UCH37, während Komplexe durch Ino80ΔNΔHSA gereinigt fehlt auch Arp4, Arp8 und YY1. Komplexe durch FLAG-Ies2, FLAG-INO80E und FLAG-Ino80ΔN gereinigt haben ähnliche Aktivitäten, was darauf hinweist, dass die Metazoen-spezifische Untereinheiten sind entbehrlich für Nukleosomen Umbau von der INO80 komplex. Im Gegensatz dazu Komplexe durch FLAG-Ino80ΔNΔHSA gereinigt inaktiv in diesem Test, was anzeigt, dass Remodeling-Aktivität hängt von der HSA-Domäne des ATP INO80ase und / oder dessen Untereinheiten assoziiert.
Die Experimente in Abbildung 2 vergleichen die Nukleosomen Bindungsaktivitäten von INO80 und INO80 Subkomplexe elektrophoretische Mobilität mit Shift-Assays. Diese Assays sind wie die Nukleosomen Remodeling-Assays durchgeführt, mit der Ausnahme, dass es keine Zugabe von Oligonukleosomen und DNA am Ende der Reaktion zu Nukleosom-gebundene Komplexe zu entfernen. Dementsprechend Inkubation von Nukleosomen mit steigenden Mengen von intakten Komplexen INO80 durch INO80E Einheit gereinigt führt zu einer dosisabhängigen Verschwinden der Bande entsprechend frei Mononukleosomen und Auftreten eines neuen "verschoben"-Arten, die in der Nähe des oberen Ende des Gels wandern (Bahnen 6-8). Wenn im Gegensatz dazu Nukleosomen mit kleineren Komplexen, die durch Ino80ΔN gereinigt worden war, und dass eine Teilmenge von Untereinheiten fehlen INO80 inkubiert, wandert die verschobenen Spezies schneller (Spuren 2-5 und 9-11), was darauf hindeutet, daß der relative mobility der supergeshifteten Band wird durch die Größe der Komplexe untersucht bestimmt.
Figur 3 zeigt die Ergebnisse eines Assays, die DNA und Nukleosomen-aktivierte ATPase Aktivitäten zweier verschiedener INO80 Subkomplexe. Die langsamer wandernde Flecken entsprechen den Ausgangs α- 32 P markiertes ATP, und die schneller wandernde Spezies ADP Reaktionsprodukte; Pfeile zeigen die Richtung der Migration Lösungsmittel.
Einer der Komplexe hier untersucht, INO80ΔN umfasst eine INO80 ATPase-Untereinheit, die den normalen C-Terminus des Proteins erstreckt, während der andere, INO80ΔNC, fehlt der C-terminalen Region INO80. Obwohl diese beiden Komplexe sind ansonsten identisch sind, ist die Rate der ATP-Hydrolyse (durch Umwandlung von radioaktiv markiertem ATP in ADP gemessen) größer in Gegenwart INO80ΔNC, was den C-Terminus des INO80 ATPase negativ regulieren ihre Aktivität. Beachten Sie, dass die Rate der ATP-hydrolyse von beiden Komplexe größer in Gegenwart von Nukleosomen als DNA, was auf die INO80 Nukleosom-Remodeling-Komplexe bevorzugen nukleosomalen Substrate für die ATP-Hydrolyse.
In der in der Figur gezeigten Assay gibt es nur eine sehr geringe ATP-Hydrolyse in Reaktionen, die DNA oder Nukleosomen (von nicht nachweisbar bis <5% der in Gegenwart von DNA / Nukleosomen beobachtet) fehlt. Weil die ATPase-Aktivität von INO80 und andere SNF2 Familie Chromatin-Remodeling-Enzyme ist stark von DNA oder Nukleosomen angeregt, würde das Vorhandensein von erheblichen DNA-und / oder Nukleosomen-unabhängige ATPase-Aktivität in den gereinigten Präparate der komplexen INO80 die Anwesenheit von verunreinigenden zellulären vorschlagen DNA oder alternativ nicht-verunreinigenden INO80 ATPasen, die während der Reinigung nicht erfolgreich entfernt wurden. Mehrere Schritte unternommen werden können, zu minimieren Einführung unerwünschter DNA und / oder ATPase während der Reinigung werden.
1) Erhöhung der salt Konzentration (NaCl) in die Bindung und Waschschritte bei der Reinigung. Verwendung von weniger als 200 mM NaCl in der Bindung und Waschschritte ergibt in der Regel Zubereitungen von Remodeling-Komplexen mit inakzeptablen kontaminierender DNA und / oder-ATPasen. Wir routinemäßig reinigen INO80 Komplexe mit einem Puffer, der 450 mM NaCl, um Verunreinigungen zu minimieren (in 3 beschrieben). Wir haben Puffern, die bis zu 1 M NaCl verwendet, um aktive INO80 Komplexe zu reinigen; Jedoch erhält man eine verringerte Ausbeute an aktiven Komplexe unter diesen Bedingungen;
2) Abnahme des Verhältnisses von FLAG Agarose Zelllysat während Immun; Die optimale Menge des FLAG-Agarose sollte durch Titration bestimmt werden;
3) ATP-abhängigen Chaperone während Immun zu FLAG-markierte Proteine gebunden. Diese können oft mit 1 mM ATP in dem Waschpuffer bei Immun entfernt werden;
4) Wir haben erfolgreichy entfernt gefährdend DNA, indem Benzonase bei einer Konzentration von 25 Einheiten / ml während der Inkubation des Extrakts mit FLAG-Agarose-Perlen. ACHTUNG: Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass Benzonase wird während der folgenden Waschschritte entfernt, als Restsubstrat wird DNase DNA oder Nukleosomen während Assays für INO80 Aktivität beeinträchtigen.
Die Interpretation dieser ATPase-Assays könnte im Prinzip dadurch, dass INO80 Chromatin-Remodeling-Komplexe enthalten mehrere potentielle ATPasen, einschließlich der SNF2 artigen Kern ATPase INO80, Actin-ähnliche Proteine ARP5, Arp8, Baf53a, Actin und der AAA + kompliziert ATPasen Tip49a und Tip49b. Trotz der physischen Anwesenheit von mehreren ATPasen, aber frühere Studien haben gezeigt, dass nur Komplexe mit katalytisch aktiven INO80 können DNA-oder Nukleosomen-aktivierten ATP-Hydrolyse zu unterstützen; Komplexe, die das katalytisch inaktiven Form von E653Q INO80 ATPase nicht zu nachweisbaren DNA-oder Nukleosomen-stimulierte ATPase Acti zeigenvität unter allen Bedingungen getestet 8. Somit DNA und / oder Nukleosom-stimulierte ATPase-Aktivität von INO80 oder INO80 Subkomplexe werden hauptsächlich durch die INO80 ATPase-Untereinheit bei.
Abbildung 1 INO80 Nukleosom Umbau Aktivität hängt von der INO80 HSA-Domäne und / oder Untereinheiten assoziiert ist aber unabhängig von der INO80 NTD und Metazoen spezifischen Untereinheiten. Nucleosome Remodeling-Assays wurden mit FLAG-immun Komplexe aus Kernextrakten von Zellinien FLAG Exprimieren durch -markiertes Versionen von Wildtyp-oder mutierte INO80 Untereinheiten. Intakte INO80 Komplexe wurden von Zelllinien, die FLAG-FLAG-oder Ies2 INO80E gereinigt; INO80 Subkomplexe wurden von Zelllinien, die FLAG-FLAG-oder Ino80ΔN Ino80ΔNΔHSA gereinigt. Eine relative Konzentration (rel konz.). Von 1 entspricht ~ 10 nM INO80 komplex.
Figur 2 Nucleosome Bindung durch den INO80 Komplex ist unabhängig von der INO80 NTD und Metazoen spezifischen Untereinheiten. Nucleosome Bindungsassays wurden in Gegenwart von variierenden Mengen der angegebenen FLAG-Komplex immun INO80 geführt. Bindung von INO80 oder INO80 Subkomplexe, um Ergebnisse in der Entstehung der langsam wandernden "Super-verschoben" Banden, die Mononukleosomen stabil durch INO80 oder INO80 Subkomplexe gebunden Mononukleosomen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 3. DNA und Nukleosomen-abhängige ATPase-Assays. TLC (Dünnschichtchromatographie) basierende ATPase-Assays wurden durchgeführt, um die Rate der ATP-Hydrolyse durch INO80 messen Subkomplexe durch gereinigt FLAG-Ino80ΔN (An) oder FLAG-Ino80ΔNC (ΔNC) in die Anwesenheit von sättigenden Mengen an DNA oder Nukleosomen. Assays wurden unter Verwendung von zwei verschiedenen Konzentrationen von jedem Komplex (5 nM und 10 nM) und für drei unterschiedliche Reaktionszeiten. Die ATP-Menge in den Reaktionen hydrolysiert (in pmol) ist unter jeder Platte angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| 67,5 ul | H 2 O |
| 10 ul | 10x PCR-Reaktionspuffer (siehe Materialliste) | </ Tr>
| 1 ul | pGEM-3Z-601 (10 ng / ul) |
| 5 ul | Forward-Primer (10 um) |
| 5 ul | Reverse-Primer (10 um) |
| 0,5 ul | dNTP Stammlösung, die jede der 4 dNTPs 10 mM |
| 1 ul | Taq DNA Polymerase (5 Einheiten / ul) |
| 10 ul | [Α- 32 P] dCTP (6000 Ci / mmol, 3,3 uM) |
Tabelle 1. Reaktionsmischung für die PCR-Amplifikation von radioaktiv markierten "601"-DNA-Fragment.
| 20 nM | INO80 oder INO80 Subkomplexe |
| 2,8 nM | Nukleosomen (bestehend aus einer Mischung von Mononukleosomen auf den 32 P-markierten DNA-Fragment, 601 und HeLa-Zell Nukleosomen) |
| 1 mM | Reinstwasser ATP |
| 20 mM | HEPES-NaOH (pH 7,9) |
| 50 mM | NaCl |
| 5 mM | MgCl 2 |
| 1 mM | Dithiothreitol (DTT) |
| 0,1 mM | Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) |
| 0,1 mg / ml | Rinderserumalbumin (BSA) |
| 5% | Glycerin |
| 0,02% | Nonidet P-40 |
| 0,02% | Triton X-100 |
Tabelle 2. Komponenten von ATP-abhängigen Nukleosomen Umbau-Assays.
| 32,6 ml | H 2 O |
| 5 ml | 40% Acrylamid / Bis (37,5: 1) |
| 2 ml | 10x TBE (900 mM Tris-Borat, 20 mM EDTA) |
| Fügen Sie die folgenden Zutaten unmittelbar vor dem Gießen des Gels: | |
| 0,4 ml | 10% Ammoniumpersulfat |
| 0,1 ml | TEMED |
Tabelle 3. Herstellung von nativen Polyacrylamid-Gel für ATP-abhängige Nukleosomen Umbau-Assays.
| 10 mM | HEPES pH 7,9 |
| 10% | Glycerin |
| 100 mM | NaCl |
| 1,5 mM | MgCl 2 |
| 0,05% | Triton X-100 |
| Fügen Sie unmittelbar vor Gebrauch: | |
| 1 mM | DTT |
| 200 uM | PMSF |
| 1: 1000 Verdünnung | Protease Inhibitor Cocktail (siehe Materialliste) |
Tabelle 4. EB100 Puffer.
| 3,9 ul | H 2 O |
| 1 ul | 10x Remodeling-Puffer (200 mM HEPES-NaOH (pH 7,9), 0,2% NP-40, 0,2% Triton X-100, 50% Glycerin, 50 mM MgCl 2, 1 mg / ml BSA) |
| 0,1 ul | 100 mM ATP |
| 0,01 ul | 1 M DTT |
| 0,01 ul | 100 mM PMSF |
| 0,25 ul | rekonstituiert mononucleosome Substrat aus Schritt 1.2 |
Tabelle 5. Komponenten des Master-Cocktail für ATP-abhängige Nukleosomen Umbau-Assays.
| 0,33 ul | 400 nM Hela Nukleosomen |
| 0,75 ul | 100 nM beschallt Lachssperma-DNA |
| 0,01 ul | 1 M DTT |
| 0,01 ul | 100 mM PMSF |
Tabelle 6. Entfernen Mix-Cocktail.
| 2 ul | H 2 O |
| 0,25 ul | 20x ATPase-Puffer, enthaltend 400 mM Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM NaCl, 132 mM MgCl 2, 16 mM EDTA, 0,3% Nonidet P-40, 50% Glycerin, 2 mg / ml BSA |
| 0,1 ul | 100 uM ATP |
| 0,005 ul | 1 M DTT |
| 0,005 ul | 100 mM PMSF |
| 0,1 ul | [Α- 32 P] ATP (3000 Ci / mmol) |
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Discussion
Um sicherzustellen, dass Nukleosomen Umbau-und ATPase-Aktivitäten, die wir in Tests zu beobachten, hängt von der katalytischen Aktivität des INO80 Komplexe und nicht auf kontaminierende Umbau-und / oder ATPase-Enzyme, die wir routinemßig Assay Nukleosom Umbau-und ATPase-Aktivität der katalytisch inaktiven Versionen INO80 Komplexe, gereinigt parallel mit Wildtyp-INO80 mit dem gleichen Verfahren. Eine negative Kontrollreaktion fehlt ATP sollte auch bei der Untersuchung von Nukleosomen Umbau Aktivität, um das Vorhandensein von kontaminierenden ATP und / oder ATP-unabhängige Umbau-Aktivitäten, die Interpretation von Experimenten Vergleich der Aktivitäten verschiedener Präparate von INO80 komplex oder Subkomplexe erschweren könnte Test durchgeführt werden. Katalytisch inaktiven Versionen von INO80 oder INO80 Subkomplexe sollte keine Nukleosomen Umbau oder ATPase Aktivitäten zeigen. Zusätzlich Detektion DNA-oder Nukleosom-ATPase-Aktivität das Vorhandensein von kontaminierenden ATPase (en) im EnzymE Fraktion. Wenn Aktivität ist immer noch in Gegenwart von katalytisch inaktiven INO80 detektiert, oder wenn es eine wesentliche DNA-oder Nukleosom-ATPase-Aktivität auch nach Optimierung der Reinigung, wie beschrieben in "Repräsentative Ergebnisse" Komplexe können weiter mit zusätzlichen Schritten, wie Ionenaustausch gereinigt werden oder Gelfiltrationschromatografie oder Sedimentation.
Bei der Messung von Nukleosomen Umbau-und ATPase-Aktivitäten, ist es ratsam, Assays für verschiedene Zeiträume und mit mehr als einer Konzentration von INO80 oder INO80 Subkomplexe durchführen, um sicherzustellen, Messungen vorgenommen werden, wenn das Produkt-Zeit und Dosis-Wirkungskurven linear sind. Ebenso sollte Nukleosom-Bindungsassays unter Verwendung von verschiedenen Konzentrationen von INO80 Komplex (e) durchgeführt werden; Andernfalls kann man nicht zuverlässig vergleichen die Aktivitäten verschiedener INO80 Zubereitungen.
Nukleosomen Schiebe-und Bindungstests sollten immer KontrollreaktionenTHAT mononucleosome Substrat gehören allein als einen Marker, um die elektrophoretische Mobilität des Ausgangs Nukleosomen Bevölkerung zu zeigen. Auf diese Weise kann man leicht durch Veränderungen speziell auf die Anwesenheit des Enzymfraktion zu ermitteln. Solche Kontrollreaktionen beurteilen auch die Integrität der rekonstituierten Mononukleosomen.
Um leicht interpretierbare Nukleosomen führen Schiebe-und Bindungsassays, ist es sinnvoll, homogene mononucleosomal Substrate erzeugen; aus diesem Grund, die in diesem Protokoll beschriebenen Assay verwendet Nukleosomen auf einem DNA-Fragment, das eine starke Positionierung Nukleosomen-Sequenz zusammengesetzt. Obwohl die INO80 komplexen neigt dazu, seitlich positioniert Nukleosomen zu einer zentralen Position auf einem DNA-Fragment neu zu positionieren, andere Chromatin-Remodeling-Enzyme, wie der ISWI-haltigen NURF komplexen 9, bewegen Nukleosomen aus zentraler Position zu den Enden der DNA-Fragmente. So wurden während Charakterisierung eines Chromatin-Remodeling-enZyme ist es nützlich, mononucleosome Substrate, in denen die Nukleosomen Positionierungssequenz an unterschiedlichen Orten herzustellen. Alternativ kann ein Substrat, in der Nukleosomen auf DNA-Fragmente ohne Nukleosomen Positionierungssequenz zusammengebaut worden einzusetzen. In diesem Fall wird das Ausgangs Nukleosom Population umfassen eine Mischung von mehr zentral und seitlich positioniert Nukleosomen.
Der ATP-abhängige Nukleosom-Remodeling-Prozess kann zu verschiedenen Ergebnissen führen Umbau, einschließlich vollständiger Nukleosom Verschiebung von der DNA, Nukleosom Bewegung auf der DNA oder vorübergehende Änderungen in Nukleosomen-Struktur, die nicht von Änderungen in den Positionen der Nukleosomen führen kann, sobald die Reaktion ein Gleichgewicht erreicht aber dennoch funktionell signifikant. Die Nukleosomen Schiebe Assay beschrieben, können die ersten beiden Reaktionen zu überwachen, kann aber nicht in der Lage, vorübergehende Veränderungen der Nukleosomen-Struktur zu erkennen. Ein Test, der eine solche vorübergehende alt erkennen kannrationen nutzt die Tatsache, dass nukleosomalen DNA auf der Oberfläche der Nukleosomen Octamer ist weitgehend unzugänglich Schneiden durch ein Restriktionsenzym, während Linker-DNA, die aus der Oberfläche von Nukleosomen Octamer verdrängte Schiebe oder teilweisen Abwickeln nukleosomalen DNA anfällig für Schneid 10,11,12. Ein solcher Assay kann auch besonders nützlich in dem Fall, dass die Nukleosomen Umbau Enzym bindet so fest an sein Substrat, das sie nicht durch Konkurrenz 13 entfernt werden.
Unsere Nukleosomen Schiebe-und Bindungstests messen INO80 Aktivitäten mit mononucleosomal Substrate mit nativen HeLa-Zell Histone vorbereitet. Allerdings kann die Umgestaltung Aktivitäten INO80 oder andere Chromatin-Remodeling-Enzyme im Prinzip durch das Vorhandensein oder Fehlen von bestimmten post-translationale Modifikationen oder Histon-Varianten beeinflusst werden. Darüber hinaus kann Mononukleosomen INO80 komplexe Aktivitäten anders als Di-Nukleosomen zu stimulieren,oder eine Anordnung von Nukleosomen. So können Mess INO80 komplexen Aktivitäten mit komplizierter und vielfältiger nukleosomalen Substrat geben Einblick in den Mechanismus, mit dem Chromatin-Remodeling Komplexe INO80 geregelt sind.
Als Alternative zu der Verwendung von radioaktiv markierten DNA-Fragmente in Nukleosomen Umbau-und Bindungsassays, einige Forscher visualisieren Nukleosomen und / oder DNA durch Anfärben nukleosomalen DNA mit Ethidiumbromid 14; Jedoch geführt Assays mit nicht-radioaktiven Nachweisverfahren erheblich weniger empfindlich als die in diesem Protokoll beschrieben, erfordern typischerweise die Verwendung von wesentlich mehr Enzym sein.
Überwachung der Fortschritte der ATPase-Reaktionen als Funktion der Zeit mit der hier beschriebenen 32 P-basierter Assay erfordert separaten Runden Probenhandhabung und Analyse zu jedem Zeitpunkt. Als Alternative kann der ATPase-Aktivität unter Verwendung von Fluoreszenz-basierten Assays gemessen werden, Die Verfahren, die wir in diesem JOVE Papier beschrieben wurden verwendet, um drei unterschiedliche biochemische Eigenschaften INO80 oder INO80 Subkomplexe im Prozess der ATP-abhängige Nukleosom-Remodeling charakterisieren. Durch die Verwendung von verschiedenen INO80 Subkomplexe oder INO80 Mutanten in diesen Tests ist es möglich, die funktionellen Beiträge verschiedener INO80 Untereinheiten und / oder an den Domänenstrukturen INO80 Nukleosom Remodeling-Aktivität zu zerlegen und zu Schritt (e) bei der Umgestaltung Reaktions definieren, an denen INO80 Einheiten und / oder Bereiche können von Bedeutung sein. Diese Verfahren können für das Studium anderer Nukleosomen Umbau und verbindlich Enzyme und ATPasen w angepasst werdenith sowohl DNA und Nukleosomen-abhängige oder selbständige Tätigkeit. Wir stellen fest, dass die verschiedenen Chromatin-Remodeling-Enzyme können höher oder niedriger intrinsische ATPase oder Nukleosomen Umbau-Aktivitäten als das menschliche INO80 Komplex haben. Daher wird, wenn die Anpassung dieser Protokolle zur Analyse von anderen Chromatin-Remodeling-Enzyme, sollte Enzymkonzentrationen, ATP, DNA oder Nukleosomen und Reaktionszeiten und / oder Temperaturen, um die Assays zu optimieren variieren für den jeweiligen Enzymen untersucht.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| 10x PCR reaction buffer | Roche Applied Science | 11435094001 | |
| Roche Taq DNA Polymerase | Roche Applied Science | 11435094001 | |
| NucAway Nuclease-free Spin Columns | Ambion | Cat. # AM10070 | |
| ultrapure ATP | USB/Affymetrix | 77241 25 UM | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| 40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Amresco | 0254-500ML | |
| Sonicated salmon sperm DNAs | GE Healthcare | 27-4565-01 | |
| 10% ammonium persulfate (APS) | Thermo Scientific | 17874 | |
| benzonase | Novagen | Cat. No. 70664 | |
| dCTP, [α-32P]- 6,000 Ci/mmol | PerkinElmer | BLU013Z250UC | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| Hoefer vertical electrophoresis unit | Hoefer | SE600X-15-1.5 | |
| lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 | |
| Storage Phosphor Screen | Molecular Dynamics | 63-0034-79 | |
| 3MM filter paper | Whatman | 28458-005 | VWR |
| Typhoon PhosphorImager | GE Healthcare | 8600 | |
| ImageQuant software | GE Healthcare | ver2003.02 | |
| TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F | Millipore | 5725-7 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe | Biodex | Model 14C |
References
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes. Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
- Narlikar, G. J., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and functions of ATP-dependent chromatin-remodeling enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
- Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, J. W., Conaway, R. C. Generation and purification of human INO80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes. , (2013).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 276 (1), (1006).
- Owen-Hughes, T., et al. Analysis of nucleosome disruption by ATP-driven chromatin remodeling complexes. Methods Mol. Biol. 119, 319-331 (1999).
- Udugama, M., Sabri, A., Bartholomew, B. The INO80 ATP-dependent chromatin remodeling complex is a nucleosome spacing factor. Mol. Cell Biol. 31 (4), 662-673 (2011).
- Jin, J., et al. A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (1074).
- Chen, L., et al. Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling. Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).
- Hamiche, A., Sandaltzopoulos, R., Gdula, D. A., Wu, C. ATP-dependent histone octamer sliding mediated by the chromatin remodeling complex NURF. Cell. 97 (7), 833-842 (1999).
- Polach, K. J., Widom, J. Restriction enzymes as probes of nucleosome stability and dynamics. Methods Enzymol. 304, 278-298 (1999).
- Anderson, J. D., Thastrom, A., Widom, J. Spontaneous access of proteins to buried nucleosomal DNA target sites occurs via a mechanism that is distinct from nucleosome translocation, Mol.Cell Biol. 22 (20), 7147-7157 (2002).
- Saha, A., Wittmeyer, J., Cairns, B. R. Chromatin remodeling through directional DNA translocation from an internal nucleosomal site. Nature Structural and Molecular Biology. 12 (9), 747-755 (2005).
- Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (33), 13770-13774 (2009).
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes. Nature. 492 (7428), 280-284 (2012).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Direct Webb, M. R. Real-Time Measurement of Rapid Inorganic Phosphate Release Using a Novel Fluorescent Probe and Its Application to Actomyosin Subfragment 1 ATPase, Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
- Luk, E., et al. Stepwise histone replacement by SWR1 requires dual activation with histone H2A.Z and canonical nucleosome. Cell. 143 (5), 725-736 (2010).
