Introduction
SNF2 complessi di rimodellamento della cromatina famiglia includono un centro SNF2-come ATPasi subunità 1,2. Alcune funzioni ATPasi SNF2-come come enzimi singole subunità, mentre altri funzionano come la subunità catalitica di grandi complessi multi-subunità. Chiarire i meccanismi molecolari attraverso i quali ciascuna delle subunità dei complessi di rimodellamento della cromatina contribuiscono alla loro attività richiede la capacità di effettuare saggi biochimici che sezionano il processo di rimodellamento.
ATP-dipendente rimodellamento dei nucleosomi dal complesso INO80 umano e di altri enzimi rimodellamento della cromatina può essere immaginato come un processo multi-step che inizia con il legame dell'enzima rimodellamento di nucleosomi, seguita dall'attivazione del suo DNA e / o nucleosoma-dipendente ATPasi, traslocazione dell'enzima rimodellamento sul DNA nucleosomal, ed eventuale riposizionamento dei nucleosomi 1,2. Comprendere i dettagli molecolari del ATP-dipendente processo di rimodellamento della cromatina requires dissezione della reazione rimodellamento nelle sue singole fasi e la definizione dei contributi delle singole subunità del complesso rimodellamento della cromatina per ogni fase della reazione. Tali analisi richiedono la capacità di analizzare il rimodellamento dei nucleosomi e altre attività utilizzando substrati molecolari definite in vitro.
In un protocollo JOVE precedente, abbiamo descritto le procedure utilizzate per generare INO80 complessi di rimodellamento della cromatina e Sottocomplessi con composizioni subunità definite 3. Qui, vi presentiamo tre saggi biochimici che permettono l'analisi quantitativa del legame, DNA e nucleosomi attivato ATPasi, e le attività di rimodellamento nucleosoma associati a tali complessi nucleosoma.
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Protocol
1 ATP-dipendenti nucleosoma ritocca saggi
Per misurare ATP-dipendente attività nucleosoma rimodellamento, immunopurified INO80 o Sottocomplessi INO80 vengono incubati con ATP e un substrato mononucleosomal, che contiene un singolo nucleosoma posizionato ad una estremità di un frammento di DNA di 216 bp, 32 P-marcato. I prodotti di reazione vengono quindi sottoposti ad elettroforesi in gel di poli-acrilammide native.
- Per generare il P-marcato, '601' frammento di DNA 32, amplificare da pGEM-3Z-601 4 un frammento di DNA 216 bp contenente un 601 nucleosoma sequenza di posizionamento finale in posizione, utilizzando gli oligonucleotidi 5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG e 5'-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG come avanti e retromarce primer.
- Impostare un 100 microlitri reazione di PCR come descritto nella Tabella 1.
- Eseguire le reazioni PCR in un termociclatore con il seguente programma: 1 min a 96 ° C, followed da 45 sec a 94 ° C, 30 sec a 57 ° C, 60 sec a 72 ° C per 30 cicli; termina con 7 min a 72 ° C.
- Dopo la reazione di PCR, rimuovere i nucleotidi non incorporati facendo passare i prodotti di reazione per due volte attraverso le colonne di spin priva di nucleasi.
- Eseguire 5 ml di prodotto purificato PCR in un gel di agarosio 1,2% per confermare che la reazione di PCR generato il ~ 216 bp frammento di DNA desiderato.
- Diluire 5 ml di prodotto di PCR purificato 20 volte, e misurare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro UV. La resa media è ~ 40 ng / ml.
- Misurare la radioattività di 1 ml di prodotto purificato PCR in un contatore a scintillazione. Stimare l'efficienza di etichettatura calcolando il cpm / ng. Una reazione di marcatura di successo si prevede di cedere ~ 15.000 cpm / ng di 601 frammento di DNA.
- Trasferimento nucleosomi cellule Hela sul marcato 601 DNA utilizzando un metodo di diluizione in serie 5.
- Mescolare 2 pmol di32 P-601 frammento di DNA marcato con 6 mg di nucleosomi Hela (preparato come descritto 5) in 50 ml di un tampone contenente 1,0 M di NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF, e 1 mM DTT e incubare a 30 ° C per 30 min.
- Sequenziale diluire la miscela a 0,8 M, 0,6 M e 0,4 M di NaCl per diluizione con 12,5 ml, 20,8 ml, e 41,6 ml, rispettivamente, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF, e 1 mM DTT, con 30 minuti di incubazione a 30 ° C dopo ogni diluizione.
- Diluire ulteriormente la miscela a 0,2 M e 0,1 M di NaCl per aggiunta di 125 ml e poi 250 ml dello stesso tampone contenente 0,1% di Nonidet P-40, 20% glicerolo, e 200 mg / ml BSA, con 30 min di incubazione a 30 ° C tra le ultime due diluizioni. Conservare il substrato mononucleosome a 4 ° C per un massimo di 3 mesi.
- Eseguire reazioni nucleosoma scorrevole ATP-dipendenti in un volume totale di 10 microlitri. La reaction componenti sono elencati nella Tabella 2. Poiché la concentrazione ottimale di NaCl per INO80 attività nucleosoma rimodellamento è ~ 50 mM NaCl (risultati non pubblicati), regolare la concentrazione totale di NaCl in ogni reazione a 50 mm, tenendo conto della quantità di NaCl contenuta in preparazioni di nucleosomi ed enzimi.
- Prima di iniziare a creare i saggi, espressi poli-acrilammide gel nativi (18 x 16 cm). Per preparare un singolo gel contenente il 5% di acrilammide (acrilammide: bisacrilammide 37.5: 1), 0.5x TBE (Tris 45 mM borato, 1 mM EDTA), 0,01% di ammonio persolfato (APS), e il 0,001% N, N, N, N'-tetramethylethylenediamine (TEMED), mescolare gli ingredienti elencati nella tabella 3. Lasciare polimerizzare il gel per almeno 2 ore a temperatura ambiente.
- Nel frattempo, per ogni reazione da eseguire, unire in un pre-raffreddata siliconato provetta da 1,5 ml microcentrifuga ~ 20 nM INO80 o INO80 subcomplesso (preparato come descritto 3) con una quantità di tampone EB100 (
- Impostare un cocktail master con il resto degli ingredienti, scaling up di un fattore 'X' (dove X = numero totale di reazioni +3). La quantità di ogni ingrediente necessario per una singola reazione di 10 microlitri è elencato nella Tabella 5; la ricetta dovrebbe essere aumentato a seconda del numero di reazioni da eseguire. Mescolare bene toccando il tubo o pipettando su e giù con un Pipetman e far girare il tubo per alcuni secondi in una microcentrifuga da banco.
- Dispensare 5,25 ml di cocktail master per ciascuna delle provette di reazione istituito nel punto 1.3.2. Mescolare bene pipettando su e giù. Iniziate le reazioni con il trasferimento di provette di reazione in un bagno a 30 ° C blocco di calore o acqua e incubare per 2 ore.
- Nel frattempo, preparare 'la rimozione mix' cocktail contenente concorrente DNAe nucleosomi, scaling up di un fattore X (X = numero totale di reazioni + 4). La quantità di ogni ingrediente necessario per preparare 1,5 microlitri rimozione di mix per una singola reazione è elencato nella Tabella 6; la ricetta dovrebbe essere aumentato a seconda del numero di test da eseguire.
- Terminate le reazioni con l'aggiunta di 1,5 ml di miscela rimozione. Mescolare bene, centrifugare, e incubare a 30 ° C per altri 30 min.
- Nel frattempo, pre-eseguire il gel di poliacrilammide nativo in una unità di elettroforesi verticale a 100 V per 30 minuti a 4 ° C, usando TBE 0.5x come tampone di corsa con un ancoretta magnetica all'interno della camera inferiore per mantenere costante la circolazione del buffer.
- Per caricare il campione, aggiungere 2,5 ml di loading dye contenenti 3x TBE, 30% glicerolo, 0,25% blu di bromofenolo, e lo 0,25% xilene Cyanol FF. Mescolare bene, far girare brevemente i campioni, e caricare sul gel con punte di carico.
- Attivare il gel a 200 V per 4,5 ore a 4 ° C con circolazione tampone.
- Per rilevare il segnale, trasferire il gel ad una pila di due fogli di carta da filtro. Avvolgere la carta da filtro con il gel sulla parte superiore con involucro di plastica trasparente, e poi esporlo a uno schermo di archiviazione al fosforo a 4 ° C per il tempo desiderato.
- Scansione lo schermo con un sistema di scanner di imaging isotopi e analizzare i dati utilizzando un software adatto.
2 Mononucleosome saggi Binding
Per saggiare l'affinità di legame di un dato complesso INO80 per mononucleosomes, effettuare uno spostamento di mobilità elettroforetica Assay (EMSA) utilizzando il substrato mononucleosomal generato nel passaggio 1.2.
- Impostare la reazione Miscele per saggi di legame come descritto per i test di rimodellamento nucleosoma ma omettere l'ATP e il mix di rimuovere dalle reazioni; incubare a 30 ° C per 30 min.
- Aggiungere 2,5 ml di loading dye per ciascuna miscela di reazione, e si applicano a un gel di poliacrilammide nativo contenente 3,5% di acrilammide (acrilammide: 3 bis7.5: 1), 1% glicerolo, TBE 0.5x, 0,01% APS, e il 0,001% TEMED.
- Utilizzando TBE 0.5x come tampone di corsa, eseguire il gel a 200 V per 2,5 ore a 4 ° C con la circolazione del buffer ed esporre a una schermata di archiviazione fosforo.
3. DNA-e Nucleosome-dipendenti ATPasi saggi
Eseguire saggi ATPasi in miscele di reazione 5 microlitri contenenti 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 60 mM NaCl, 6,6 mM MgCl 2, 0.8 mM EDTA, 0,015% Nonidet P-40, 2,5% glicerolo, 0,1 mg / ml di BSA, 1 DTT mM, 0,1 mM PMSF, 2 mM ATP, 2 μCi di [α- 32 P] ATP (3.000 Ci / mmol). Per ogni complesso INO80 o la quantità di complessi INO80 da dosare istituire tre reazioni parallele, uno contenente tampone EB100 per misurare DNA o nucleosoma-indipendente ATPasi, uno contenente chiuso DNA plasmide circolare (5.000 bp, ~ 30 nM) per misurare il DNA ATPasi dipendente, e uno contenente Hela oligonucleosomes (~ 185 nM) per misurare nucleosoma-dipendente ATPasi. Impostare tutte le reazioni su ghiaccio.
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Representative Results
Le figure mostrano risultati rappresentativi di saggi biochimici utilizzati per caratterizzare attività INO80, tra cui nucleosoma scorrevole (figura 1) e vincolante (Figura 2) saggi e DNA o saggi ATPasi nucleosoma-dipendente (Figura 3).
L'esperimento mostrato in Figura 1 confronta la capacità di complessi INO80 intatti purificato attraverso FLAG-Ies2 o FLAG-INO80E e INO80 Sottocomplessi purificato attraverso sia FLAG-Ino80ΔN o Ino80ΔNΔHSA di catalizzare rimodellamento di mononucleosomes montati su un 216 bp, frammento di DNA radioattivo. La posizione del nucleosoma sul frammento di DNA influisce mobilità elettroforetica; lateralmente nucleosomi posizionati più veloci nel gel di nucleosomi posizionati più centralmente. Dal INO80 complessi di rimodellamento della cromatina preferenzialmente mononucleosomes muovono verso il centro di un pezzo di 6,7,8 DNA, l'attività di rimodellamento è monisbranati dalla comparsa di una popolazione di nucleosomi che mostrano una diminuita mobilità elettroforetica. Al termine della reazione, un eccesso di oligonucleosomes Hela e sperma di salmone o di altro DNA deve essere aggiunto alla miscela di reazione come concorrente per rimuovere eventuali INO80 o INO80 Sottocomplessi substrato-bound, in quanto legato rimodellamento enzima cambierà la mobilità elettroforetica del nucleosoma substrato. Complessi purificati attraverso Ino80ΔN FLAG mancano le subunità specifica-metazoi INO80D, INO80E, Amida, MCRS1, NFRKB, e UCH37, mentre complessi purificati attraverso Ino80ΔNΔHSA mancano anche Arp4, Arp8, e YY1. Complessi purificati attraverso FLAG-Ies2, FLAG-INO80E, e FLAG-Ino80ΔN hanno attività analoghe, che indica che le subunità specifica-metazoi sono indispensabili per il rimodellamento dei nucleosomi dal complesso INO80. Al contrario, i complessi purificati attraverso FLAG-Ino80ΔNΔHSA non sono attive in questo saggio, che indica che l'attività di rimodellamento dipende dal dominio HSA della INO80 ATPase e / o le sue subunità associate.
Gli esperimenti in figura 2 confronta la attività di INO80 e INO80 Sottocomplessi utilizzando saggi di mobilità elettroforetica turno vincolante nucleosoma. Questi test vengono eseguiti in modo simile ai test di rimodellamento nucleosoma, salvo che non vi è alcuna aggiunta di oligonucleosomes e DNA al termine della reazione per rimuovere complessi nucleosoma-bound. Di conseguenza, l'incubazione di nucleosomi con quantità crescenti di complessi INO80 intatti purificato attraverso la subunità INO80E porta ad una scomparsa dose-dipendente della banda corrispondente a mononucleosomes liberi e comparsa di un nuovo 'spostato' specie che migra vicino alla parte superiore del gel (corsie 6-8). Al contrario, quando nucleosomi vengono incubati con complessi più piccoli che erano stati purificati attraverso Ino80ΔN e che mancano di un sottoinsieme di subunità INO80, la specie spostate migra più rapidamente (corsie 2-5 e 9-11), suggerendo che la relativa mobilità della banda super-variata viene determinata dalla dimensione dei complessi saggiati.
La Figura 3 mostra i risultati di un test confrontando il DNA e nucleosoma attivato attività ATPasi di due diverse Sottocomplessi INO80. Le macchie più lentamente migrazione corrispondono alla partenza α- 32 P etichettato ATP, e le specie più rapidamente che migrano sono prodotti di reazione ADP; le frecce indicano la direzione di migrazione solvente.
Uno dei complessi analizzati qui, INO80ΔN, comprende una subunità INO80 ATPasi che si estende al normale C-terminale della proteina, mentre l'altro, INO80ΔNC, manca della regione C-terminale INO80. Anche se questi due complessi sono identiche, il tasso di idrolisi (misurata mediante conversione di ATP radio-marcato a ADP) è maggiore in presenza di INO80ΔNC, suggerendo la C-terminale della INO80 ATPasi può regolare negativamente la sua attività. Si noti che il tasso di ATP hydrolysis da entrambi i complessi è maggiore in presenza di nucleosomi di DNA, suggerendo il nucleosoma INO80 rimodellamento complessi preferiscono substrati nucleosomal per idrolisi dell'ATP.
Nel test mostrato in figura, c'è solo un livello molto basso di idrolisi nelle reazioni prive di DNA o nucleosomi (dai rilevabile a <5% di quella osservata in presenza di DNA / nucleosomi). Poiché l'attività ATPasi di INO80 e di altri enzimi di rimodellamento della cromatina SNF2 famiglia è fortemente stimolato da DNA o nucleosomi, la presenza di una sostanziale DNA e / o attività ATPasi nucleosoma-indipendente nelle preparazioni purificate del complesso INO80 suggerirebbe la presenza di contaminanti cellulare DNA, o in alternativa, contaminando ATPasi non INO80 che non sono stati rimossi con successo durante la purificazione. Diverse misure possono essere prese per ridurre al minimo l'introduzione di DNA indesiderati e / o ATPasi durante la purificazione.
1) Aumentare le sconcentrazione alt (NaCl) nei passi vincolanti e lavaggio durante la purificazione. L'uso di NaCl inferiore a 200 mm nel legare e fasi di lavaggio di solito produce preparazioni di complessi di rimodellamento con livelli inaccettabili di contaminazione del DNA e / o ATPasi. Noi abitualmente purificare complessi INO80 utilizzando un tampone contenente 450 mM NaCl per ridurre al minimo i contaminanti (descritto in 3). Abbiamo usato tamponi contenenti il più 1 M NaCl per purificare complessi INO80 attivi; tuttavia, si ottiene un rendimento diminuito di complessi attivi in queste condizioni;
2) Diminuire il rapporto di FLAG agarosio al lisato cellulare durante immunopurification; la quantità ottimale di FLAG-agarosio dovrebbe essere determinata mediante titolazione;
3) accompagnatori ATP-dipendenti possono rimanere legato alle proteine FLAG-tagged durante immunopurification. Questi possono spesso essere rimossi includendo 1 mM ATP nel buffer di lavaggio durante immunopurification;
4) Abbiamo di successoy Rimosso contaminazione del DNA includendo benzonasi ad una concentrazione di 25 unità / ml durante l'incubazione di estratto con perline FLAG-agarosio. ATTENZIONE: E 'essenziale assicurarsi che benzonasi viene rimosso durante le fasi di lavaggio successive, come DNasi residua degradare DNA substrato o nucleosomi durante il test per l'attività INO80.
L'interpretazione di questi test ATPasi potrebbe, in linea di principio, essere complicata dal fatto che i complessi INO80 rimodellamento della cromatina contengono diversi ATPasi potenziale, compreso il SNF2-come nucleo ATPasi INO80, actina-come le proteine ARP5, Arp8, Baf53a, actina, e la AAA + ATPasi Tip49a e Tip49b. Nonostante la presenza fisica di più ATPasi, tuttavia, studi precedenti hanno dimostrato che solo i complessi contenenti cataliticamente attivo INO80 può supportare DNA o nucleosomi attivato ATP idrolisi; complessi contenenti la forma E653Q cataliticamente inattiva di INO80 ATPasi non riescono a esporre DNA rilevabile o nucleosoma-ATPasi stimolata actività in qualsiasi condizione testato 8. Così, DNA e / o attività ATPasi nucleosoma-stimolata di INO80 o Sottocomplessi INO80 vengono conferiti principalmente dalla subunità INO80 ATPasi.
Figura 1 INO80 attività nucleosoma rimodellamento dipende dal dominio INO80 HSA e / o subunità associate, ma è indipendente dal INO80 NTD e subunità specifica-metazoi. Saggi rimodellamento dei nucleosomi sono stati effettuati con complessi FLAG-immunopurified da estratti nucleari ottenuti da linee cellulari che esprimono FLAG versioni -tagged di tipo selvatico o subunità INO80 mutanti. Complessi INO80 intatte sono stati purificati da linee cellulari che esprimono FLAG-Ies2 o FLAG-INO80E; Sottocomplessi INO80 sono stati purificati da linee cellulari che esprimono FLAG-Ino80ΔN o FLAG-Ino80ΔNΔHSA. Una concentrazione relativa (rel. Conc.) Di 1 corrisponde a ~ 10 nM complesso INO80.
Figura 2 nucleosomi vincolante dal complesso INO80 è indipendente dal INO80 NTD e subunità specifica-metazoi. Nucleosoma saggi di legame sono stati eseguiti in presenza di quantità variabili della indicata complesso INO80 FLAG-immunopurified. Il legame di INO80 o Sottocomplessi INO80 per mononucleosomes risultati nella nascita di bande lenta migrazione "super-spostato" corrispondenti a mononucleosomes stabilmente vincolati da INO80 o Sottocomplessi INO80. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3 "src =" / files / ftp_upload / 51721 / 51721fig3highres.jpg "/>
Figura 3 DNA e saggi ATPasi nucleosoma-dipendenti. TLC (cromatografia su strato sottile) a base di saggi ATPasi sono stati eseguiti per misurare il tasso di idrolisi da INO80 Sottocomplessi purificato attraverso FLAG-Ino80ΔN (ΔN) o FLAG-Ino80ΔNC (ΔNC) in la presenza di saturare quantità di DNA o nucleosomi. I saggi sono stati eseguiti utilizzando due diverse concentrazioni di ciascun complesso (5 nM e 10 nM) e per i tre tempi di reazione diversi. La quantità di ATP idrolizzata (in pmol) nelle reazioni è indicata sotto ogni pannello. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| 67,5 ml | H 2 O |
| 10 microlitri | 10x PCR tampone di reazione (vedi Materiali List) | </ Tr>
| 1 ml | pGEM-3Z-601 (10 ng / ml) |
| 5 ml | primer forward (10 micron) |
| 5 ml | primer reverse (10 micron) |
| 0,5 microlitri | soluzione madre contenente dNTP 10 mM ciascuno dei 4 dNTP |
| 1 ml | Taq DNA polimerasi (5 unità / ml) |
| 10 microlitri | [Α- 32 P] dCTP (6.000 Ci / mmol, 3,3 mM) |
Tabella 1 mix di reazione per l'amplificazione PCR del frammento radioattivo '601' DNA.
| 20 nM | INO80 o INO80 Sottocomplessi |
| 2.8 nM | nucleosomi (costituiti da una miscela di mononucleosomes sui 32 P-marcato 601 frammento di DNA e cellule Hela nucleosomi) |
| 1 mM | ultrapura ATP |
| 20 mM | HEPES-NaOH (pH 7.9) |
| 50 mM | NaCl |
| 5 mM | MgCl 2 |
| 1 mM | ditiotreitolo (DTT) |
| 0,1 mm | phenylmethanesulfonyl fluoruro (PMSF) |
| 0,1 mg / ml | albumina di siero bovino (BSA) |
| 5% | glicerina |
| 0,02% | Nonidet P-40 |
| 0,02% | Triton X-100 |
Tabella 2 Componenti del nucleosoma ATP-dipendente rimodellamento saggi.
| 32,6 ml | H 2 O |
| 5 ml | 40% acrilamide / Bis (37,5: 1) |
| 2 ml | 10x TBE (Tri 900 mms-borato, 20 mM EDTA) |
| Aggiungere i seguenti ingredienti immediatamente prima di versare il gel: | |
| 0,4 ml | 10% persolfato di ammonio |
| 0,1 ml | TEMED |
Tabella 3 Preparazione di gel di poliacrilammide nativo per nucleosoma rimodellamento test ATP-dipendente.
| 10 mM | HEPES pH 7.9 |
| 10% | glicerina |
| 100 mM | NaCl |
| 1,5 mm | MgCl 2 |
| 0,05% | TritonX-100 |
| Aggiungere poco prima dell'uso: | |
| 1 mM | DTT |
| 200 micron | PMSF |
| 1: 1.000 diluizione | Inibitore della proteasi Cocktail (vedi Materiali List) |
Tabella 4 buffer di EB100.
| 3.9 ml | H 2 O |
| 1 ml | 10x rimodellamento Buffer (200 mM HEPES-NaOH (pH 7,9), 0,2% NP-40, 0,2% Triton X-100, 50% glicerolo, 50 mM MgCl 2, 1 mg / ml BSA) |
| 0,1 microlitri | ATP 100 mM |
| 0.01 microlitri | 1 M DTT |
| 0.01 microlitri | PMSF 100 mM |
| 0.25 microlitri | substrato mononucleosome ricostituito dal punto 1.2 |
Tabella 5 Componenti del cocktail master per nucleosoma rimodellamento test ATP-dipendente.
| 0.33 microlitri | 400 nucleosomi nM Hela |
| 0,75 ml | 100 Nm di salmone sonicati DNA dello sperma |
| 0.01 microlitri | 1 M DTT |
| 0.01 microlitri | PMSF 100 mM |
Tabella 6 Rimozione cocktail mix.
| 2 microlitri | H 2 O |
| 0.25 microlitri | 20x ATPasi Buffer contenente 400 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 200 mM, 132 mM MgCl 2, 16 mM EDTA, 0,3% Nonidet P-40, 50% glicerolo, 2 mg / ml di BSA |
| 0,1 microlitri | 100 mM ATP |
| 0.005 ml | 1 M DTT |
| 0.005 ml | PMSF 100 mM |
| 0,1 microlitri | [Α- 32 P] ATP (3.000 Ci / mmol) |
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Discussion
Per garantire che il rimodellamento dei nucleosomi e le attività ATPasi che osserviamo nei test dipendono l'attività catalitica di complessi INO80, e non sulla contaminazione di rimodellamento e / o enzimi ATPasi, abbiamo nucleosomi regolarmente test rimodellamento e l'attività ATPasica di versioni cataliticamente inattive di complessi INO80, purificata in parallelo con wild type INO80 utilizzando la stessa procedura. Una reazione di controllo negativo manca ATP dovrebbe essere eseguita quando saggiando l'attività di rimodellamento dei nucleosomi per verificare la presenza di contaminanti ATP e / o attività di rimodellamento ATP-indipendenti, che potrebbe complicare l'interpretazione degli esperimenti a confronto le attività delle diverse preparazioni di complesso INO80 o Sottocomplessi. Cataliticamente versioni inattive di INO80 o Sottocomplessi INO80 devono presentare nessun rimodellamento dei nucleosomi o attività ATPasi. Inoltre, la rilevazione di DNA o nucleosoma-indipendente ATPasi indica la presenza di contaminanti ATPasi (s) in enzimae frazione. Se l'attività viene ancora rilevato in presenza di attività catalitica INO80 o se vi è sostanziale DNA o attività ATPasi nucleosoma-indipendente anche dopo l'ottimizzazione purificazione come descritto in 'Rappresentante dei risultati,' complessi possono essere ulteriormente purificati mediante ulteriori misure quali lo scambio ionico o cromatografia di gel filtrazione o sedimentazione gradiente.
Quando la misurazione rimodellamento nucleosoma e attività ATPasi, si consiglia di effettuare saggi per diversi periodi di tempo e con più di una concentrazione della INO80 o Sottocomplessi INO80 per garantire misure vengono prese quando il prodotto-time e curve dose-risposta è lineare. Allo stesso modo, vincolante nucleosoma test devono essere eseguiti utilizzando diverse concentrazioni di complesso INO80 (ES); in caso contrario, non si può confrontare in modo affidabile le attività delle diverse preparazioni INO80.
Nucleosoma scorrevole e saggi di legame dovrebbe sempre includere reazioni di controlloche includono mononucleosome substrato da solo come un indicatore per mostrare la mobilità elettroforetica della popolazione a partire nucleosoma. In questo modo, si può facilmente identificare variazioni dovute specificamente alla presenza della frazione enzima. Tali reazioni di controllo anche valutare l'integrità dei mononucleosomes ricostituiti.
Al fine di condurre nucleosoma facilmente interpretabili scorrevole e saggi di legame, è utile generare substrati mononucleosomal omogenei; per questo motivo, il test descritto in questo protocollo utilizza nucleosomi montate su un frammento di DNA contenente una forte sequenza di posizionamento nucleosoma. Sebbene il complesso INO80 tende a riposizionare nucleosomi posizionati lateralmente ad una posizione più centrale su un frammento di DNA, altri enzimi rimodellamento della cromatina, come il complesso NURF ISWI contenenti 9, muovono nucleosomi da posizioni più centrali verso le estremità dei frammenti di DNA. Così, durante la caratterizzazione di qualsiasi rimodellamento cromatina itZYME è utile preparare substrati mononucleosome in cui la sequenza di posizionamento nucleosoma è in luoghi diversi. In alternativa, si può impiegare substrati in cui nucleosomi sono stati montati su frammenti di DNA, senza una sequenza di posizionamento nucleosoma. In questo caso, la popolazione iniziale nucleosoma includerà una miscela di nucleosomi più centralmente e lateralmente posizionati.
Il processo di rimodellamento dei nucleosomi ATP-dipendente può portare a diversi risultati di rimodellamento, tra cui completa spostamento nucleosoma dal DNA, movimento nucleosomi sul DNA, o alterazioni transitorie della struttura del nucleosoma che non può portare a cambiamenti nelle posizioni dei nucleosomi una volta la reazione raggiunge l'equilibrio ma sono comunque funzionalmente significative. Il saggio nucleosoma scorrevole descritto in grado di monitorare le prime due reazioni, ma non può essere in grado di rilevare le alterazioni transitorie nella struttura nucleosoma. Un test in grado di rilevare alcuni tale alt transitoriarazioni sfrutta il fatto che il DNA nucleosomal sulla superficie del ottamero nucleosoma è in gran parte inaccessibile al taglio con un enzima di restrizione, mentre linker DNA che è stato spostato dalla superficie ottamero da nucleosomi scorrevole o parziale svolgimento del DNA nucleosomal è suscettibile al taglio 10,11,12. Tale dosaggio può essere particolarmente utile nel caso in cui il rimodellamento enzima nucleosoma si lega così strettamente ad un substrato che non può essere rimosso dal concorrente 13.
Il nostro nucleosoma scorrevole e vincolante test misurano le attività INO80 utilizzando substrati mononucleosomal preparati con nativi istoni cellule Hela. Tuttavia, rimodellamento attività di INO80 o di altri enzimi di rimodellamento della cromatina possono, in linea di principio essere influenzati dalla presenza o assenza di specifiche modificazioni post-traduzionali o varianti istoniche. Inoltre, mononucleosomes possono stimolare le attività complesse di INO80 diverso rispetto a di-nucleosomi,o una serie di nucleosomi. Pertanto, le attività di misura complesse INO80 utilizzando più complessa e diversificata substrato nucleosomal possono fornire una conoscenza del meccanismo con cui INO80 complessi di rimodellamento della cromatina sono regolati.
In alternativa all'utilizzo di frammenti di DNA radiomarcato nel rimodellamento nucleosoma e saggi di legame, alcuni ricercatori visualizzare nucleosomi e / o DNA mediante colorazione DNA nucleosomal con bromuro di etidio 14; Tuttavia, i saggi eseguiti utilizzando metodi di rilevamento non radioattivi può essere molto meno sensibile di quello descritto in questo protocollo, in genere richiedono l'uso di molto più enzimi.
Monitorare lo stato di avanzamento delle reazioni ATPasi in funzione del tempo usando il saggio base-P 32 qui descritta richiede round di manipolazione del campione e di analisi in ogni punto di tempo. Come approccio alternativo, ATPasi attività può essere misurata mediante saggi basati fluorescenza Le procedure che abbiamo descritto in questo documento JOVE sono stati utilizzati per caratterizzare tre diverse proprietà biochimiche di INO80 o INO80 Sottocomplessi nel processo di ATP-dipendente rimodellamento nucleosoma. Utilizzando vari Sottocomplessi INO80 o mutanti INO80 in questi saggi, è possibile sezionare i contributi funzionali di varie subunità INO80 e / o strutture di dominio all'attività rimodellamento INO80 nucleosoma e definire passo (s) nella reazione rimodellamento in cui subunità INO80 e / o domini possono essere importanti. Queste procedure possono essere adattati per lo studio di altri rimodellamento nucleosomi ed enzimi vincolanti e ATPasi wesimo sia DNA e attività nucleosoma-dipendenti o indipendenti. Si noti che diversi enzimi di rimodellamento della cromatina possono avere attività ATPasi o rimodellamento dei nucleosomi superiori o inferiori intrinseci rispetto al complesso INO80 umano. Quindi, quando adegua questi protocolli per l'analisi di altri enzimi cromatina rimodellamento, si dovrebbe variare concentrazioni di enzima, ATP, DNA o nucleosomi, ei tempi e / o temperature di reazione al fine di ottimizzare i dosaggi per gli enzimi particolari allo studio.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| 10x PCR reaction buffer | Roche Applied Science | 11435094001 | |
| Roche Taq DNA Polymerase | Roche Applied Science | 11435094001 | |
| NucAway Nuclease-free Spin Columns | Ambion | Cat. # AM10070 | |
| ultrapure ATP | USB/Affymetrix | 77241 25 UM | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| 40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Amresco | 0254-500ML | |
| Sonicated salmon sperm DNAs | GE Healthcare | 27-4565-01 | |
| 10% ammonium persulfate (APS) | Thermo Scientific | 17874 | |
| benzonase | Novagen | Cat. No. 70664 | |
| dCTP, [α-32P]- 6,000 Ci/mmol | PerkinElmer | BLU013Z250UC | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| Hoefer vertical electrophoresis unit | Hoefer | SE600X-15-1.5 | |
| lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 | |
| Storage Phosphor Screen | Molecular Dynamics | 63-0034-79 | |
| 3MM filter paper | Whatman | 28458-005 | VWR |
| Typhoon PhosphorImager | GE Healthcare | 8600 | |
| ImageQuant software | GE Healthcare | ver2003.02 | |
| TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F | Millipore | 5725-7 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe | Biodex | Model 14C |
References
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