Introduction
SNF2 complexes chromatine de la famille de remodelage comprennent une sous-unité ATPase central SNF2 comme 1,2. Certaines fonctions des ATPases SNF2 comme les enzymes de sous-unités simples, tandis que d'autres fonctionnent comme la sous-unité catalytique de grands complexes multi-sous-unités. Élucider les mécanismes moléculaires par lesquels chacune des sous-unités de complexes de remodelage de la chromatine contribuent à leurs activités nécessite la capacité à effectuer des dosages biochimiques qui dissèquent le processus de remodelage.
ATP-dépendante des nucléosomes remodelage par le complexe INO80 humain et d'autres enzymes de remodelage de la chromatine peut être envisagé comme un processus en plusieurs étapes qui commence par la liaison du remodelage enzyme de nucléosomes, suivie de l'activation de son ADN et / ou des nucléosomes dépendante ATPase, la translocation de l'enzyme sur l'ADN nucléosomique remodelage, et éventuel repositionnement des nucléosomes 1,2. La compréhension des détails moléculaires de l'ATP-dépendante processus de remodelage de la chromatine récessite dissection de la réaction de remodelage en ses différentes étapes de définition et des contributions des sous-unités individuelles du complexe de remodelage de chromatine à chaque étape de la réaction. Ces analyses nécessitent la capacité d'analyser le remodelage du nucléosome et autres activités utilisant des substrats moléculaires définies in vitro.
Dans un protocole de JOVE précédente, nous avons décrit les procédures utilisées pour générer des complexes et Subcomplexes de remodelage INO80 avec des compositions de sous-unités définies 3. Ici, nous présentons trois dosages biochimiques qui permettent une analyse quantitative de la liaison, l'ADN et nucléosome activé ATPase, et les activités de remodelage du nucléosome associés à ces complexes nucléosome.
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Protocol
1. dépendant de l'ATP nucléosome Rénovation Essais
Pour mesurer ATP-dépendant des activités de remodelage des nucléosomes, immunopurifié INO80 ou sous-complexes de INO80 sont incubées avec de l'ATP et un substrat de mononucleosomal, qui contient un seul nucléosome positionné à une extrémité d'un fragment d'ADN de 216 pb, marqué au 32P. Les produits de réaction sont ensuite soumis à une électrophorèse dans des gels de poly-acrylamide natif.
- Pour générer le P-marqué, «601» fragment 32 d'ADN, amplification de pGEM-3Z-601 4 un fragment d'ADN de 216 pb contenant une 601 séquence de positionnement des nucléosomes d'extrémité positionnée, en utilisant les oligonucléotides 5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG et 5'-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG que amorces sens et antisens.
- Mettre en place une réaction PCR de 100 pi, comme décrit dans le tableau 1.
- Effectuer les réactions PCR dans un thermocycleur en utilisant le programme suivant: 1 mn à 96 ° C, followed de 45 sec à 94 ° C, 30 sec à 57 ° C, 60 secondes à 72 ° C pendant 30 cycles; se terminant par 7 min à 72 ° C.
- Après la réaction de PCR est terminée, retirez les nucléotides non constituées en faisant passer les produits de la réaction deux fois à travers des colonnes de centrifugation sans nucléase.
- Exécuter 5 ul du produit de PCR purifié dans un gel d'agarose à 1,2% pour confirmer que la réaction PCR a généré l'~ fragment d'ADN de 216 pb désiré.
- Diluer 5 ul du produit de PCR purifié 20 fois, et de mesurer la concentration d'ADN en utilisant un spectrophotomètre UV. Le rendement moyen est d'environ 40 ng / ul.
- Mesurer la radioactivité de 1 ul du produit de PCR purifié dans un compteur à scintillation. Estimer l'efficacité de l'étiquetage en calculant le cpm / ng. On s'attend à une réaction de marquage succès pour obtenir ~ 15 000 cpm / ng de 601 fragment d'ADN.
- Transfert de cellules Hela nucléosomes sur l'ADN marqué 601 en utilisant une méthode de dilution en série 5.
- Mélanger 2 pmol deMarqué au 32P 601 fragment d'ADN de 6 pg de nucléosomes Hela (préparé comme décrit 5) dans 50 pl d'un tampon contenant 1,0 M de NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1 mM, mM PMSF 0,1, et 1 mM DTT et incuber à 30 ° C pendant 30 min.
- Diluer le mélange séquentiel à 0,8 M, 0,6 M et 0,4 M de NaCl, par dilution avec 12,5 ul, 20,8 ul, et 41,6 pi, respectivement, de 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0), EDTA 1 mM, PMSF 0,1 mM, et DTT 1 mM, avec une incubation de 30 min à 30 ° C après chaque dilution.
- Diluer ensuite le mélange à 0,2 M puis de NaCl 0,1 M par addition de 125 ul et 250 ul du même tampon contenant 0,1% de Nonidet P-40, 20% de glycérol, et 200 pg / ml de BSA, avec une incubation de 30 min à 30 ° C entre les deux dilutions finales. Stocker le substrat mononucléosome à 4 ° C pendant 3 mois.
- Réaliser des réactions de nucléosomes glissement dépendant de l'ATP dans un volume total de 10 pl. Le reacomposants ction sont répertoriés dans le tableau 2. Puisque la concentration de NaCl optimale pour l'activité des nucléosomes de remodelage INO80 est d'environ 50 mM de NaCl (résultats non publiés), ajuster la concentration totale de NaCl dans chaque réaction à 50 mM, en tenant compte de la quantité de NaCl contenue dans les préparations de l'enzyme et nucléosomes.
- Avant de commencer à mettre en place les tests, fonte des gels de poly-acrylamide natifs (18 x 16 cm). Pour préparer un gel contenant 5% d'acrylamide (acrylamide: bis-acrylamide à 37,5: 1), 0,5 x TBE (45 mM de Tris borate, 1 mM EDTA), 0,01% de persulfate d'ammonium (APS), et 0,001% de N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine (TEMED), mélanger les ingrédients énumérés dans le tableau 3. Laisser le gel polymériser pendant au moins 2 heures à température ambiante.
- Pendant ce temps, pour chaque réaction à effectuer, mélanger dans un tube de silicone de 1,5 ml pré-réfrigérés ~ 20 nM INO80 ou INO80 sous-complexe (préparé comme décrit 3) avec une quantité de tampon EB100 (
- Configuration d'un cocktail de maître avec le reste des ingrédients, mise à l'échelle par un facteur de 'X' (où X = nombre total de réactions 3). La quantité de chaque ingrédient nécessaire pour une seule réaction de 10 ul est listé dans le tableau 5; la recette doit être agrandi en fonction du nombre de réactions à effectuer. Mélangez bien en appuyant sur le tube ou par aspiration et refoulement avec un Pipetman et tourner le tube pendant quelques secondes dans une microcentrifugeuse de paillasse.
- Verser 5,25 pi du cocktail maître à chacun des tubes réactionnels mis en place à l'étape 1.3.2. Bien mélanger par pipetage de haut en bas. Démarrer la réaction en transférant des tubes de réaction dans un bain à 30 ° C-bloc de la chaleur ou de l'eau et incuber pendant 2 heures.
- Pendant ce temps, préparer «l'élimination mix 'cocktail contenant de l'ADN de concurrentet nucléosomes, mise à l'échelle par un facteur de X (X = nombre total de réactions + 4). La quantité de chacun des ingrédients nécessaires à la préparation de 1,5 ul de mélange pour retirer une seule réaction est listé dans le tableau 6; la recette doit être agrandi en fonction du nombre d'essais à effectuer.
- Terminer réactions en ajoutant 1,5 ul du mélange retirer. Mélangez bien, spin-down, et incuber à 30 ° C pendant encore 30 min.
- Pendant ce temps, pré-exécuter le gel de polyacrylamide natif dans une unité d'électrophorèse vertical à 100 V pendant 30 min à 4 ° C, à l'aide 0.5x TBE comme tampon avec une barre d'agitation magnétique à l'intérieur de la chambre inférieure pour maintenir la circulation de tampon constant.
- Pour charger l'échantillon, ajouter 2,5 pi de colorant de charge contenant 3x TBE, 30% de glycérol, 0,25% de bleu de bromophénol, et 0,25% Xylène Cyanol FF. Mélangez bien, centrifuger brièvement les échantillons, et les charger sur le gel à l'aide des conseils de chargement.
- Exécuter le gel à 200 V pendant 4,5 heures à 4 ° C avec une circulation d'un tampon.
- Pour détecter le signal, le gel à transférer un empilement de deux feuilles de papier filtre. Enroulez le papier filtre avec le gel sur le dessus, avec un collier en plastique transparent, puis l'exposer à un écran au phosphore de stockage à 4 ° C pendant le temps désiré.
- Balayer l'écran d'un système de scanner d'imagerie par isotope et analyser les données en utilisant un logiciel approprié.
2 mononucléosome essais de liaison
Pour doser l'affinité de liaison d'un complexe de INO80 donné pour mononucléosomes, effectuer un décalage de mobilité électrophorétique Assay (EMSA) en utilisant le substrat de mononucleosomal généré à l'étape 1.2.
- Mettre en place la réaction mélanges pour les analyses de liaison comme décrit pour les essais de remodelage du nucléosome mais omettre l'ATP et la suppression mélange des réactions; incuber à 30 ° C pendant 30 min.
- Ajouter 2,5 pi de colorant de charge à chaque mélange réactionnel, et l'appliquer à un gel de polyacrylamide natif contenant 3,5% d'acrylamide (acrylamide: bis 37,5: 1), 1% de glycérol, 0.5x TBE, 0,01% APS, et 0,001% TEMED.
- Utilisation 0.5x TBE comme tampon, exécutez le gel à 200 V pendant 2,5 heures à 4 ° C avec circulation de tampon et exposer à un écran au phosphore de stockage.
3. ADN et Nucléosome dépendantes ATPase dosages
Réaliser des tests de ATPase dans des mélanges réactionnels 5 ul contenant 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 60 mM de NaCl, 6,6 mM de MgCl2, mM EDTA 0,8, 0,015% de Nonidet P-40, 2,5% de glycerol, 0,1 mg / ml de BSA, 1 mM de DTT, 0,1 mM PMSF, 2 mM d'ATP, 2 pCi de [α- 32 P] ATP (3000 Ci / mmol). Pour chaque complexe INO80 ou la quantité de complexe INO80 à doser mis en place trois réactions parallèles, un tampon de EB100 contenant à mesurer l'ADN ou nucléosome indépendant ATPase, un contenant fermé ADN plasmidique circulaire (5000 pb, ~ 30 nM) pour mesurer l'ADN ATPase dépendante, et un contenant (~ 185 nM) de Hela pour mesurer nucléosome dépendant ATPase. Mettre en place toutes les réactions sur la glace.
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Representative Results
Les chiffres montrent des résultats représentatifs de tests biochimiques utilisés pour caractériser les activités de INO80, y compris nucléosome glissière (figure 1) et de liaison (Figure 2) des tests et des analyses d'ADN ou de l'ATPase nucléosome-dépendant (figure 3).
L'expérience a montré à la figure 1, on compare la capacité des complexes de INO80 intact purifié à travers FLAG-Ies2 ou FLAG-INO80E et de INO80 Subcomplexes purifié soit par FLAG-Ino80ΔN ou Ino80ΔNΔHSA pour catalyser le remodelage de mononucléosomes assemblés sur un 216 pb, un fragment d'ADN radiomarqué. La position du nucléosome sur le fragment d'ADN affecte la mobilité électrophorétique; latéralement nucléosomes positionnés courir plus vite dans le gel de nucléosomes plus en position centrale. Depuis complexes de remodelage de la chromatine INO80 déplacent préférentiellement mononucléosomes vers le centre d'un morceau d'ADN 6,7,8, l'activité de rénovation est moniTored par l'émergence d'une population de nucléosomes qui présentent une diminution de la mobilité électrophorétique. A la fin de la réaction, un excès d'oligonucléosomes Hela et de sperme de saumon ou d'un autre ADN doit être ajouté au mélange réactionnel en tant que concurrent pour enlever les INO80 ou INO80 Subcomplexes du substrat lié, depuis lié enzyme de remodelage changera la mobilité électrophorétique du nucléosome substrat. Complexes purifiés par Ino80ΔN FLAG n'ont pas les sous-unités spécifiques métazoaires INO80D, INO80E, Amida, MCRS1, NFRKB, et UCH37, tandis que les complexes purifiés par Ino80ΔNΔHSA manquent également Arp4, Arp8, et YY1. Complexes purifiés par FLAG-Ies2, FLAG-INO80E, et FLAG-Ino80ΔN ont des activités similaires, ce qui indique que les sous-unités spécifiques métazoaires ne sont pas indispensables pour le remodelage des nucléosomes par le complexe INO80. En revanche, les complexes purifiés par le biais FLAG-Ino80ΔNΔHSA sont inactifs dans cet essai, ce qui indique que l'activité de remodelage dépend du domaine de la HSA Ino80 ATPase et / ou de ses sous-unités associées.
Les expériences de la figure 2 comparer les activités de INO80 et INO80 Subcomplexes en utilisant des tests de décalage de mobilité électrophorétique de liaison nucléosome. Ces essais sont réalisés de façon similaire aux essais de remodelage des nucléosomes, sauf qu'il n'y a pas plus de oligonucléosomes ADN et à la fin de la réaction pour éliminer les complexes de nucléosomes-lié. En conséquence, l'incubation des nucléosomes avec des quantités de complexes INO80 intactes augmentation purifié par la sous-unité INO80E conduit à une disparition de la dose-dépendante de la bande correspondant à mononucléosomes gratuits et apparition d'une nouvelle "décalés" espèce qui migre vers le haut du gel (lignes 6-8). En revanche, lorsque les nucléosomes sont incubées avec les complexes plus petits qui ont été purifiés à travers Ino80ΔN et qui n'ont pas un sous-ensemble des sous-unités de INO80, l'espèce décalés migre plus rapidement (voies 2-5 et 9-11), ce qui suggère que la foule par rapportilité de la bande de super-décalée est déterminée par la taille des complexes testés.
Figure 3 montre les résultats d'un essai comparant l'ADN et les activités ATPase de deux sous-complexes de INO80 différents nucléosomes activé. Les taches migrant plus lentement correspondant à la mise en marche α- ATP marqué au 32P, et les espèces migrant plus rapidement des produits de réaction d'ADP; les flèches indiquent le sens de migration du solvant.
L'un des complexes testés ici, INO80ΔN, comprend une sous-unité ATPase Ino80 qui s'étend à extrémité C-terminale de la protéine normale, tandis que l'autre, INO80ΔNC, dépourvu de la région C-terminale Ino80. Bien que ces deux complexes sont par ailleurs identiques, le taux d'hydrolyse de l'ATP (mesurée par la conversion de l'ATP radiomarqué à ADP) est plus grande en présence de INO80ΔNC, ce qui suggère l'extrémité C-terminale de la Ino80 ATPase peuvent réguler négativement son activité. Notez que le taux d'ATP hydrolysis par deux complexes est plus grande en présence de nucléosomes que l'ADN, ce qui suggère le nucléosome INO80 préfèrent des substrats complexes de remodelage des nucléosomes pour l'hydrolyse de l'ATP.
Dans l'essai représenté sur la figure, il n'y a qu'une très faible niveau d'hydrolyse de l'ATP dans des réactions qui n'ont pas d'ADN ou des nucléosomes (allant de indétectable à <5% de celle observée en présence de l'ADN / nucléosomes). Parce que l'activité ATPase de INO80 et d'autres enzymes de remodelage SNF2 de la chromatine de la famille est fortement stimulée par l'ADN ou des nucléosomes, la présence de l'ADN substantielle et / ou l'activité d'ATPase nucléosome indépendante dans les préparations purifiées du complexe INO80 suggère la présence de contamination cellulaire ADN, ou encore, la contamination ATPases non INO80 qui n'ont pas été supprimés avec succès lors de la purification. Plusieurs mesures peuvent être prises pour minimiser l'introduction d'ADN non désirées et / ou ATPase au cours de la purification.
1) Augmenter les sconcentration alt (NaCl) dans les étapes de liaison et de lavage au cours de la purification. Utilisation d'mM de NaCl inférieure à 200 dans les étapes de lavage et de liaison donne généralement des préparations de complexes de remodelage avec des niveaux inacceptables de contamination de l'ADN et / ou ATPases. Nous purifions régulièrement INO80 complexes en utilisant un tampon contenant 450 mM de NaCl, afin de minimiser les contaminants (décrite au point 3). Nous avons utilisé des tampons contenant jusqu'à 1 M de NaCl pour purifier des complexes INO80 actifs; Toutefois, on obtient une diminution de rendement de complexes actifs dans ces conditions;
2) diminuer le taux de FLAG agarose à lysat cellulaire pendant immunopurification; la quantité optimale de FLAG-agarose doit être déterminée par titrage;
3) chaperons ATP-dépendant peuvent rester lié aux protéines FLAG marqué pendant immunopurification. Ceux-ci peuvent souvent être éliminés par y compris ATP 1 mM dans le tampon de lavage pendant immunopurification;
4) Nous avons réussieProduit retiré y compris l'ADN contaminant par la benzonase à une concentration de 25 unités / ml au cours de l'incubation de l'extrait de perles de FLAG-agarose. ATTENTION: Il est essentiel de s'assurer benzonase est retiré au cours des étapes ultérieures de lavage, comme DNase résiduelle dégrader l'ADN de substrat ou nucléosomes pendant les essais de l'activité INO80.
L'interprétation de ces tests ATPase pourrait, en principe, être compliquée par le fait que les complexes INO80 de remodelage contiennent plusieurs ATPases potentiels, y compris les noyau SNF2 comme ATPase INO80, les protéines d'actine comme ARP5, Arp8, Baf53a, actine, et l'AAA + ATPases Tip49a et Tip49b. En dépit de la présence physique de plusieurs ATPases, cependant, des études antérieures ont montré que seuls les complexes catalytiquement actif contenant Ino80 peut prendre en charge l'ADN ou l'hydrolyse de l'ATP nucléosome activé; complexes contenant le formulaire de E653Q activité catalytique de Ino80 ATPase ne parviennent pas à présenter d'ADN détectable ou nucléosome stimulée ATPase activité dans toutes les conditions testées 8. Ainsi, l'ADN et / ou l'activité de l'ATPase nucléosome stimulée INO80 ou Subcomplexes de INO80 sont principalement contribué par la sous-unité ATPase Ino80.
Figure 1 INO80 activité nucléosome de remodelage dépend du domaine Ino80 HSA et / ou des sous-unités associées, mais est indépendante de la Ino80 ATN et des sous-unités spécifiques aux métazoaires. Dosages de remodelage des nucléosomes ont été effectués avec les complexes de FLAG-immunopurifié à partir d'extraits nucléaires préparés à partir de lignées cellulaires exprimant FLAG versions -tagged de type sauvage ou des sous-unités de INO80 mutantes. Des complexes de INO80 intacts ont été purifiés à partir de lignées cellulaires exprimant FLAG FLAG-Ies2 ou INO80E; Subcomplexes INO80 ont été purifiés à partir de lignées cellulaires exprimant FLAG-Ino80ΔN ou FLAG-Ino80ΔNΔHSA. Une concentration relative (rel. Conc.) 1 correspond à ~ 10 nM complexe INO80.
Figure 2 nucléosomes par le complexe de liaison de INO80 est indépendante de la Ino80 ATN et des sous-unités spécifiques aux métazoaires. Nucléosome essais de liaison ont été effectuées en présence de quantités variables du complexe indiquée INO80 FLAG-immunopurifié. Reliure de INO80 ou Subcomplexes de INO80 à mononucléosomes résultats dans l'émergence de bandes lente migration «super-décalés» correspondant à mononucléosomes lié de façon stable par INO80 ou Subcomplexes de INO80. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3 ADN et des analyses de l'ATPase nucléosome-dépendantes. CCM (chromatographie sur couche mince) à base des analyses de l'ATPase ont été effectuées pour mesurer le taux de l'hydrolyse d'ATP par INO80 Subcomplexes purifiée par FLAG-Ino80ΔN (An) ou FLAG-Ino80ΔNC (ΔNC) dans la présence de quantités saturantes de l'ADN ou des nucléosomes. Les analyses ont été effectuées en utilisant deux concentrations différentes de chaque complexe (5 nm et 10 nm) et trois temps de réaction différents. La quantité d'ATP hydrolysé (en pmol) dans les réactions est indiqué sous chaque panneau. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| 67,5 pi | H 2 O |
| 10 pl | 10x PCR tampon de réaction (voir la liste des matériaux) | </ Tr>
| 1 pl | pGEM-3Z-601 (10 ng / pl) |
| 5 pl | amorce sens (10 pm) |
| 5 pl | amorce inverse (10 um) |
| 0,5 pl | dNTP solution de réserve contenant 10 mM de chacun des 4 dNTP |
| 1 pl | L'ADN polymérase Taq (5 unités / pl) |
| 10 pl | [Α- 32 P] dCTP (6000 Ci / mmol, 3,3 M) |
Tableau 1 mélange réactionnel pour l'amplification par PCR d'un fragment «601» de l'ADN radiomarqué.
| 20 nM | INO80 ou INO80 Subcomplexes |
| 2,8 nM | nucléosomes (constitués d'un mélange de mononucléosomes sur les 32 601 fragments d'ADN et de cellules Hela nucléosomes P marqué) |
| 1 mM | ultrapure ATP |
| 20 mM | HEPES-NaOH (pH 7,9) |
| 50 mM | NaCl |
| 5 mM | MgCl2 |
| 1 mM | dithiothréitol (DTT) |
| 0,1 mM | le fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF) |
| 0,1 mg / ml | albumine de sérum bovin (BSA) |
| 5% | glycérol |
| 0,02% | Nonidet P-40 |
| 0,02% | Triton X-100 |
Tableau 2: Composantes de nucléosomes ATP-dépendant remodelage essais.
| 32,6 ml | H 2 O |
| 5 ml | 40% d'acrylamide / bis (37,5: 1) |
| 2 ml | 10x TBE (mM Tri 900s-borate, 20 mM d'EDTA) |
| Ajouter les ingrédients suivants immédiatement avant de verser le gel: | |
| 0,4 ml | 10% de persulfate d'ammonium |
| 0,1 ml | TEMED |
Tableau 3 Préparation de gel de polyacrylamide natif pour nucléosomes remodelage essais ATP-dépendant.
| 10 mM | HEPES pH 7,9 |
| 10% | glycérol |
| 100 mM | NaCl |
| 1,5 mM | MgCl2 |
| 0,05% | Triton X-100 |
| Ajouter juste avant utilisation: | |
| 1 mM | TNT |
| 200 uM | PMSF |
| 1: 1000 dilution | Inhibiteur de la protéase Cocktail (voir liste des matières) |
Tableau 4 de la mémoire tampon de EB100.
| 3,9 pl | H 2 O |
| 1 pl | Remodelage tampon 10x (200 mM de HEPES-NaOH (pH 7,9), 0,2% de NP-40, 0,2% de Triton X-100, 50% de glycerol, 50 mM de MgCl2, 1 mg / ml BSA) |
| 0,1 pl | 100 mM d'ATP |
| 0.01 pi | 1 M DTT |
| 0.01 pi | 100 mM de PMSF |
| 0,25 pi | mononucléosome substrat reconstitué à partir de l'étape 1.2 |
Tableau 5 composants du cocktail de maître pour nucléosomes remodelage essais ATP-dépendant.
| 0,33 pi | 400 nM nucléosomes Hela |
| 0,75 pi | 100 nM saumon traité par ultrasons des ADN de sperme |
| 0.01 pi | 1 M DTT |
| 0.01 pi | 100 mM de PMSF |
Tableau 6 Retrait mélange cocktail.
| 2 pl | H 2 O |
| 0,25 pi | Tampon ATPase 20x contenant 400 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM de NaCl, 132 mM de MgCl2, 16 mM EDTA, 0,3% de Nonidet P-40, 50% de glycerol, 2 mg / ml de BSA |
| 0,1 pl | 100 uM d'ATP |
| 0.005 pi | 1 M DTT |
| 0.005 pi | 100 mM de PMSF |
| 0,1 pl | [Α- 32 P] ATP (3000 Ci / mmol) |
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Discussion
Afin de s'assurer que nucléosome remodelage et activités ATPase on observe dans des dosages dépendent de l'activité catalytique des complexes de INO80, et non sur contaminant rénovation et / ou d'enzymes ATPase, nous nucléosome régulièrement dosage remodelage et l'activité ATPase de versions catalytiquement inactives de complexes INO80, purifié dans parallèle avec le type sauvage INO80 utilisant la même procédure. Une réaction témoin négatif dépourvu ATP doit également être effectué lors du dosage de l'activité de remodelage des nucléosomes à tester pour la présence de contamination de l'ATP et / ou les activités de remodelage ATP-indépendantes, ce qui peut compliquer l'interprétation des expériences comparant les activités des différentes préparations de complexe ou sous-complexes INO80. Catalytique versions inactives de INO80 ou Subcomplexes INO80 doivent présenter aucun remodelage des nucléosomes ou ATPase. En outre, la détection de l'ADN ou des nucléosomes indépendante de l'activité ATPase indique la présence de contamination de l'ATPase (s) dans l'enzymfraction de e. Si l'activité est toujours détecté en présence d'catalytiquement inactif Ino80 ou s'il existe ADN substantielle ou l'activité d'ATPase nucléosome indépendante même après optimisation de purification, comme décrit dans «Les résultats représentatifs, 'les complexes peuvent être purifiés davantage à l'aide des étapes supplémentaires telles que l'échange d'ions ou Chromatographie par filtration sur gel ou sédimentation gradient.
Lors de la mesure remodelage du nucléosome et ATPase, il est conseillé d'effectuer des essais pour des durées variables et avec plus d'une concentration de INO80 ou Subcomplexes de INO80 pour assurer des mesures sont prises quand-temps des produits et des courbes dose-réponse sont linéaires. De même, des essais de liaison de nucléosomes doivent être effectuées en utilisant plusieurs concentrations de complexe INO80 (es); autrement, on ne peut comparer de manière fiable les activités des différentes préparations de INO80.
Nucléosome coulissante et les analyses de liaison devraient toujours inclure des réactions de contrôlequi comprennent mononucléosome substrat seul comme un marqueur pour afficher la mobilité électrophorétique de la population nucléosome départ. De cette manière, on peut facilement identifier les modifications dues en particulier à la présence de la fraction de l'enzyme. De telles réactions de contrôle évaluent également l'intégrité des mononucléosomes reconstituées.
Afin de mener nucléosome facilement interprétable de glissement et les analyses de liaison, il est utile de générer des substrats de mononucleosomal homogènes; pour cette raison, l'essai décrit dans ce protocole utilise des nucléosomes assemblés sur un fragment d'ADN contenant une séquence de positionnement du nucléosome solide. Bien que le complexe de INO80 a tendance à repositionner les nucléosomes positionnés latéralement à une position plus centrale sur un fragment d'ADN, d'autres remodelage de la chromatine des enzymes, telles que la ISWI contenant un complexe NURF 9, déplacent les nucléosomes à partir de positions plus centrale vers les extrémités des fragments d'ADN. Ainsi, lors de la caractérisation d'un remodelage de la chromatine enzyme il est utile de préparer des substrats mononucléosome dans lequel la séquence de positionnement des nucléosomes est à différents endroits. En variante, on peut utiliser des substrats en nucléosomes qui ont été montés sur des fragments d'ADN sans une séquence de positionnement des nucléosomes. Dans ce cas, la population nucléosome à partir comprendra un mélange de nucléosomes plus en position centrale et latérale.
Le processus de remodelage du nucléosome ATP-dépendant peut conduire à divers résultats de remodelage, y compris le déplacement complet nucléosome partir de l'ADN, le mouvement des nucléosomes sur l'ADN, ou des modifications transitoires de la structure du nucléosome qui ne peuvent pas conduire à des changements dans les positions des nucléosomes fois que la réaction a atteint l'équilibre mais n'en sont pas moins fonctionnelle significative. Le test de nucléosome glissement décrit peut suivre les deux premières réactions, mais peut ne pas être en mesure de détecter des altérations transitoires de la structure du nucléosome. Un test qui permet de détecter certains comme alt transitoirerations tire parti du fait que l'ADN nucléosomique sur la surface de l'octamère nucléosome est essentiellement inaccessible à la coupure par une enzyme de restriction, tandis que l'ADN de liaison qui a été déplacé à partir de la surface octamère par nucléosome glisse ou de déroulement partiel de l'ADN nucléosomique est susceptible de coupe 10,11,12. Un tel dosage peut également être particulièrement utile dans le cas où l'enzyme de remodelage des nucléosomes lie si fortement à son substrat qui ne peut pas être éliminé par 13 concurrent.
Notre nucléosome coulissant et essais de liaison de mesurer les activités de INO80 utilisant des substrats de mononucleosomal préparés avec les histones de cellules Hela indigènes. Cependant, les activités de remodelage de INO80 ou d'autres enzymes de remodelage de la chromatine peuvent en principe être affectées par la présence ou l'absence de modifications post-traductionnelles spécifiques ou variants d'histones. En outre, mononucléosomes peuvent stimuler les activités de complexes INO80 différemment de di-nucléosomes,ou un tableau de nucléosomes. Ainsi, les activités de mesure complexes INO80 utilisant substrat nucléosomale plus complexe et diversifié peuvent donner un aperçu du mécanisme par lequel complexes INO80 de remodelage sont réglementés.
Comme alternative à l'utilisation de fragments d'ADN radio-marqués dans le remodelage des nucléosomes et des analyses de liaison, certains chercheurs nucléosomes visualiser et / ou de l'ADN par coloration de l'ADN nucléosomique avec du bromure d'éthidium 14; Cependant, des essais effectués en utilisant des procédés de détection non radioactifs peuvent être beaucoup moins sensible que celui décrit dans ce protocole, ce qui nécessite généralement l'utilisation d'une enzyme considérablement plus.
Contrôle de l'état d'avancement des réactions d'ATPase en tant que fonction du temps en utilisant l'essai à base de P-32 décrits ici nécessite séries distinctes de la manipulation et l'analyse d'échantillons à chaque point de temps. Comme autre approche, l'activité ATPase peut être mesurée en utilisant des dosages basés sur la fluorescence Les procédures que nous avons décrites dans ce document de JOVE ont été utilisées pour caractériser trois propriétés biochimiques différentes de INO80 ou INO80 Subcomplexes dans le processus de l'ATP-dépendant nucléosome remodelage. En utilisant divers sous-complexes INO80 ou mutants INO80 dans ces essais, il est possible de disséquer les contributions fonctionnelles de différentes sous-unités INO80 et / ou des structures de domaines de l'activité de remodelage INO80 du nucléosome, et de définir l'étape (s) dans la réaction de remodelage au cours de laquelle les sous-unités de INO80 et / ou de domaines peuvent être importants. Ces procédures peuvent être adaptées pour l'étude d'autres remodelage du nucléosome et enzymes de liaison et ATPases wvec la fois l'ADN et les activités nucléosome-dépendants ou indépendants. Nous notons que différentes enzymes de remodelage de la chromatine peuvent avoir ATPase ou remodelage des nucléosomes activités plus élevés ou plus bas intrinsèques que le complexe INO80 humaine. Par conséquent, lors de l'adaptation de ces protocoles pour l'analyse d'autres enzymes de remodelage de la chromatine, il faut varier les concentrations d'enzyme, l'ATP, l'ADN ou les nucléosomes, des temps, et / ou à des températures de réaction afin d'optimiser les tests pour les enzymes particulières à l'étude.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| 10x PCR reaction buffer | Roche Applied Science | 11435094001 | |
| Roche Taq DNA Polymerase | Roche Applied Science | 11435094001 | |
| NucAway Nuclease-free Spin Columns | Ambion | Cat. # AM10070 | |
| ultrapure ATP | USB/Affymetrix | 77241 25 UM | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| 40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Amresco | 0254-500ML | |
| Sonicated salmon sperm DNAs | GE Healthcare | 27-4565-01 | |
| 10% ammonium persulfate (APS) | Thermo Scientific | 17874 | |
| benzonase | Novagen | Cat. No. 70664 | |
| dCTP, [α-32P]- 6,000 Ci/mmol | PerkinElmer | BLU013Z250UC | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| Hoefer vertical electrophoresis unit | Hoefer | SE600X-15-1.5 | |
| lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 | |
| Storage Phosphor Screen | Molecular Dynamics | 63-0034-79 | |
| 3MM filter paper | Whatman | 28458-005 | VWR |
| Typhoon PhosphorImager | GE Healthcare | 8600 | |
| ImageQuant software | GE Healthcare | ver2003.02 | |
| TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F | Millipore | 5725-7 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe | Biodex | Model 14C |
References
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