Introduction
SnF2 complexos de remodelação da cromatina família incluem um SnF2-como centro ATPase subunidade 1,2. Alguns ATPases função SnF2-como enzimas individuais de subunidade, enquanto que outros funcionam como a subunidade catalítica de grandes complexos de multi-subunidades. Elucidar os mecanismos moleculares pelos quais cada uma das subunidades da cromatina complexos de remodelação contribuir para as suas actividades requer a capacidade de realizar ensaios bioquímicos que dissecam o processo de remodelação.
ATP-dependente remodelação nucleossoma pelo complexo INO80 humano e outras enzimas remodelação da cromatina pode ser concebido como um processo multi-etapas que começa com a ligação da enzima à remodelação nucleossomas, seguido por activação do seu ADN e / ou nucleossoma-ATPase dependente, translocação da enzima na remodelação ADN nucleossomal, e eventual reposicionamento de nucleossomas 1,2. Compreender os detalhes moleculares do dependente de ATP processo de remodelação da cromatina requires dissecção da reacção remodelação nos seus passos individuais e definição das contribuições das subunidades individuais do complexo de remodelação da cromatina para cada passo da reacção. Tais análises exigem a capacidade de analisar remodelação nucleosome e outras atividades utilizando substratos moleculares definidos in vitro.
Em um protocolo JOVE anterior, descrevemos os procedimentos utilizados para gerar complexos de remodelação da cromatina INO80 e subcomplexos com composições de subunidades definidas 3. Aqui, apresentamos três ensaios bioquímicos que permitem a análise quantitativa da ligação, DNA- e nucleosome ativado ATPase, e as atividades de remodelação nucleossomos associados com tais complexos nucleosome.
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Protocol
1. ATP-dependentes nucleossoma Remodelação Ensaios
Para medir as actividades de ATP-dependente nucleossoma remodelação, imunopurificada INO80 ou subcomplexos INO80 são incubados com ATP e um substrato mononucleosomal, que contém um único nucleossoma posicionado numa extremidade de um fragmento de ADN de 216 pb, 32 P-marcado. Os produtos da reacção são então sujeitos a electroforese em géis de poli-acrilamida nativo.
- Para gerar o, '601' fragmento de ADN marcado com 32 P, a partir de amplificar pGEM-3Z-4 601 um fragmento de ADN de 216 pb que contém uma sequência de 601 posicionamento nucleossoma posicionada-final, utilizando os oligonucleótidos 5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG e 5'-como AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG frente e verso, primers.
- Defina-se uma reacção de PCR de 100 ul, tal como descrito na Tabela 1.
- Realizar as reacções de PCR num termociclador utilizando o seguinte programa: 1 min a 96 ° C, followed por 45 seg a 94 ° C, 30 seg a 57 ° C, 60 segundos a 72 ° C durante 30 ciclos; terminando com 7 min a 72 ° C.
- Após a reacção de PCR é terminado, remover os nucleótidos não incorporados fazendo passar os produtos de reacção duas vezes através de colunas de giro livre de nuclease.
- Executar 5 ul do produto de PCR purificado em gel de agarose a 1,2% para confirmar que a reacção de PCR gerado a ~ 216 pb Fragmento de ADN desejado.
- Dilui-se 5 ul do produto de PCR purificado de 20 vezes, e medir a concentração de ADN, utilizando um espectrofotómetro de UV. O rendimento médio é de aproximadamente 40 ng / mL.
- Medir a radioactividade de 1 ul do produto de PCR purificado em um contador de cintilação. Estimar a eficiência de marcação pelo cálculo do cpm / ng. A reacção de marcação bem sucedida é esperado para produzir ~ 15,000 cpm / ng de fragmento de ADN 601.
- Transferir nucleossomas células HeLa na rotulada 601 DNA utilizando um método de diluição em série 5.
- Misture 2 pmol de32 601 fragmento de ADN marcado com P com 6 ug de nucleossomas Hela (preparado tal como descrito 5) em 50 ul de um tampão contendo 1,0 M de NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1 mM, PMSF 0,1 mM e 1 mM TDT e incubar a 30 ° C durante 30 min.
- Sequencialmente diluir a mistura a 0,8 M, 0,6 M e 0,4 M de NaCl por diluição com 12,5 mL, 20,8 mL, e 41,6 ul, respectivamente, de 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), EDTA 1 mM, PMSF 0,1 mM, e 1 mM de DTT, com uma incubação de 30 min a 30 ° C depois de cada diluição.
- Diluir a mistura de 0,2 M e, em seguida, para NaCl 0,1 M por adição de 125 mL e, em seguida, 250 ul do mesmo tampão contendo 0,1% de Nonidet P-40, 20% de glicerol, e 200 ug / ml BSA, com uma incubação de 30 min a 30 ° C entre as duas diluições finais. Armazenar o substrato mononucleosome a 4 ° C durante até 3 meses.
- Realizar as reacções de nucleossomas deslizante dependentes de ATP num volume total de 10 ul. A reaction componentes estão listados na Tabela 2. vez que a concentração de NaCl para a actividade óptima remodelação nucleossoma INO80 ~ é NaCl 50 mM (resultados não publicados), ajustar a concentração total de cada reacção em NaCl a 50 mM, tendo em conta a quantidade de NaCl contido nas preparações de nucleossomas e enzima.
- Antes de começar a configurar os ensaios, lança gel de poli-acrilamida nativas (18 x 16 cm). Para preparar um único gel contendo 5% de acrilamida (acrilamida: bisacrilamida a 37,5: 1), TBE 0,5 x (45 mM Tris borato, 1 mM EDTA), 0,01% de persulfato de amónio (APS), e 0,001% de N, N, N ', N'-tetrametiletilenodiamina (TEMED), mistura dos ingredientes listados na Tabela 3. Permitir que o gel de polimerizar durante pelo menos 2 horas à temperatura ambiente.
- Entretanto, para cada reacção a ser realizada, combinar num tubo siliconizado microcentrífuga de 1,5 ml pré-arrefecido ~ 20 nM ou INO80 INO80 subcomplexo (preparado como descrito 3) com uma quantidade de tampão EB100 (
- Defina-se um cocktail mestre com o resto dos ingredientes, ampliação de um factor de 'X' (em que X = número total de reacções 3). A quantidade de cada ingrediente necessário para uma única reacção de 10 uL é listada na Tabela 5; a receita deve ser dimensionado de acordo com o número de reacções a serem realizadas. Misture bem, tocando o tubo ou pipetando para cima e para baixo com um Pipetman e girar o tubo por alguns segundos em uma microcentrífuga de bancada.
- Dispensar 5,25 ul do cocktail de mestre para cada um dos tubos de reacção estabelecidas no passo 1.3.2. Misture bem pipetando para cima e para baixo. Iniciar as reacções através da transferência de tubos de reacção para um banho de 30 ° C de calor bloco ou água e incubar durante 2 horas.
- Enquanto isso, a preparar »removendo mistura 'cocktail contendo ADN competidore nucleossomos, ampliação por um fator de X (X = número total de reações + 4). A quantidade de cada ingrediente necessário para a preparação de 1,5 ul da mistura para remoção de uma única reacção está listado na Tabela 6; a receita deve ser aumentado de acordo com o número de ensaios a serem realizados.
- Terminar reações adicionando 1,5 mL da mistura de remover. Misture bem, girar para baixo, e incuba-se a 30 ° C durante mais 30 min.
- Enquanto isso, a pré-rodar o gel de poliacrilamida nativa, em uma unidade de electroforese vertical, a 100 V durante 30 min a 4 ° C, usando TBE 0,5 x como tampão de corrida com uma barra de agitação magnética no interior da câmara inferior para manter a circulação tampão constante.
- Para carregar a amostra, adicionar 2,5 l de corante de carga contendo TBE 3x, 30% de glicerol, 0,25% azul de bromofenol e 0,25% xileno cianol FF. Misture bem, girar rapidamente as amostras, e carregar no gel usando dicas de carregamento.
- Submeter o gel a 200 V durante 4,5 horas a 4 ° C com tampão de circulação.
- Para detectar o sinal, a transferência do gel para uma pilha de duas folhas de papel de filtro. Envolver o papel de filtro com o gel no topo usando plástico transparente, e, em seguida, expô-la a um ecrã de fósforo de armazenamento a 4 ° C durante o tempo desejado.
- Digitalize o ecrã com um sistema de scanner de imagens isótopo e analisar os dados utilizando software apropriado.
2. Mononucleosome Ensaios de Ligação
Para ensaiar a afinidade de ligação de um dado complexo INO80 para mononucleosomes, realizar um deslocamento Electrophoretic Mobility Assay (EMSA), utilizando o substrato mononucleosomal gerado no passo 1.2.
- Configure a reação Misturas para ensaios de ligação, tal como descrito para os ensaios de remodelação nucleossomos, mas omitir o ATP e remover mix das reações; incubar a 30 ° C durante 30 min.
- Adicionar 2,5 uL de corante de carga de cada uma das misturas de reacção, e aplicam-se a um gel de poliacrilamida nativa, contendo 3,5% de acrilamida (acrilamida: bis 37,5: 1), 1% de glicerol, TBE 0,5 x, 0,01% APS, 0,001% e TEMED.
- Usando 0,5 x TBE como tampão de corrida, correr o gel a 200 V durante 2,5 horas a 4 ° C com tampão de circulação e expor a um ecrã de fósforo de armazenamento.
3. ADN e Nucleosome-ATPase Os ensaios dependentes
Realizar ensaios ATPase em misturas de reacção contendo 5 ul de 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 60 mM de NaCl, 6,6 mM de MgCl2, 0,8 mM EDTA, 0,015% de Nonidet P-40, 2,5% de glicerol, 0,1 mg / ml de BSA, 1 DTT, 0,1 mM de PMSF, 2 mM ATP, 2 uCi de [α- 32 P] ATP (3000 Ci / mmol). Para cada complexo INO80 ou quantidade de complexo a ser ensaiada INO80 criou três reacções paralelas, uma contendo tampão EB100 para medir DNA- ou nucleossoma-ATPase independente, contendo um DNA de plasmídeo circular fechado (5000 pb, ~ 30 nM) para medir DNA- ATPase dependente, e outro contendo Hela oligonucleosomes (~ 185 nm) para medir nucleosome-ATPase dependente. Configure todas as reações no gelo.
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Representative Results
As figuras mostram os resultados representativos de testes bioquímicos usados para caracterizar as actividades, incluindo INO80 nucleossoma deslizante (Figura 1) e de ligação (Figura 2) e DNA- ensaios ou ensaios de ATPase dependente de nucleossoma (Figura 3).
A experiência apresentada na Figura 1 compara a capacidade dos complexos INO80 intactas purificado através de FLAG-Ies2 ou FLAG-INO80E e de INO80 subcomplexos purificado através de qualquer um FLAG-Ino80ΔN ou Ino80ΔNΔHSA para catalisar a remodelação de mononucleosomes montados sobre uma 216 pb, um fragmento de DNA marcado radioactivamente. A posição do nucleossoma sobre o fragmento de ADN afecta a mobilidade electroforética; lateralmente nucleossomos posicionados correr mais rápido no gel de nucleossomos mais posicionado centralmente. Desde complexos de remodelação INO80 cromatina se deslocam, preferencialmente mononucleosomes em direção ao centro de um pedaço de DNA 6,7,8, atividade remodelação é monitored pelo surgimento de uma população de nucleossomos que exibem diminuição da mobilidade eletroforética. No final da reacção, um excesso de oligonucleosomes Hela e de esperma de salmão, ou outro DNA deve ser adicionado à mistura de reacção como concorrente para remover quaisquer INO80 ou INO80 subcomplexos ligados a substratos, uma vez que a enzima remodelação ligada irá alterar a mobilidade electroforética do nucleossoma substrato. Complexos purificados através Ino80ΔN FLAG faltam as subunidades específicas de metazoários INO80D, INO80E, Amida, MCRS1, NFRKB, e UCH37, enquanto que os complexos purificados através Ino80ΔNΔHSA também falta Arp4, Arp8, e YY1. Complexos purificados através FLAG-Ies2, FLAG-INO80E e FLAG-Ino80ΔN têm atividades semelhantes, indicando que as subunidades específicas de metazoários são dispensáveis para a remodelação nucleosome pelo complexo INO80. Em contraste, os complexos purificados através de FLAG-Ino80ΔNΔHSA são inactivos neste ensaio, indicando que a actividade de remodelação depende do domínio de HSA da INO80 ATPase e / ou as suas subunidades associadas.
Os experimentos na Figura 2 compara a atividades de INO80 e INO80 subcomplexos utilizando ensaios de mudança de mobilidade eletroforética obrigatório nucleosome. Estes ensaios são realizados de modo semelhante para os ensaios de remodelação de nucleossomas, excepto que não há adição de oligonucleosomes e DNA no final da reacção para remover complexos ligados ao nucleossomas. Assim, a incubação de nucleossomas com quantidades crescentes de complexos INO80 intactas purificado através da subunidade INO80E conduz a um desaparecimento dependente da dose da banda correspondente a mononucleosomes livres e aparecimento de um novo "deslocado" espécies que migra perto do topo do gel (pistas 6-8). Em contraste, quando os nucleossomas são incubadas com complexos mais pequenos que tinham sido purificados através Ino80ΔN e que carecem de um subconjunto de subunidades INO80, as espécies deslocadas migra mais rapidamente (as pistas 2-5 e 9-11), o que sugere que a turba relativadegra da banda super-deslocado é determinada pelo tamanho dos complexos ensaiados.
A Figura 3 mostra os resultados de um ensaio de comparação do ADN e de actividades de ATPase activada por nucleossomas de dois subcomplexos INO80 diferentes. Os pontos mais lentamente migram correspondem à partida α- 32 P ATP marcado, e as espécies que migram mais rapidamente são produtos de reacção da ADP; as setas indicam a direcção da migração do solvente.
Um dos complexos ensaiados aqui, INO80ΔN, inclui uma subunidade INO80 ATPase, que se estende ao normal terminal C da proteína, enquanto que o outro, INO80ΔNC, falta a região C-terminal da INO80. Embora estes dois complexos são de outro modo idênticos, a taxa de hidrólise de ATP (medido pela conversão de ATP marcado com rádio para o ADP) é maior na presença de INO80ΔNC, sugerindo o C-terminal do INO80 ATPase pode regular negativamente a sua actividade. Note-se que a taxa de ATP hidrolysis por ambos os complexos é maior na presença de nucleossomas do que ADN, sugerindo que o nucleossoma INO80 remodelação complexos preferem nucleossomais substratos para a hidrólise de ATP.
No ensaio ilustrado na figura, existe apenas um muito baixo grau de hidrólise de ATP em reacções que não possuem ADN ou nucleossomas (que vão desde indetectáveis até <5% do que a observada na presença de ADN / nucleossomas). Porque a actividade de ATPase de INO80 e outras enzimas de remodelação da cromatina SnF2 família é fortemente estimulada por ADN ou nucleossomas, a presença de DNA- substancial e / ou a actividade de ATPase nucleossoma-independente nas preparações purificadas de complexo INO80 sugeriria a presença de contaminação celular ADN, ou alternativamente, a contaminação não-ATPases INO80 que não foram removidas com êxito durante a purificação. Pode ser feita de vários passos para minimizar a introdução de DNA indesejado e / ou durante a purificação da ATPase.
1) Aumentar as sconcentração alt (NaCl) nos passos de ligação e de lavagem, durante a purificação. Utilização de NaCl abaixo de 200 mM, em etapas de lavagem de ligação e geralmente produz preparações de complexos de remodelação com níveis inaceitáveis de contaminantes de ADN e / ou ATPases. Rotineiramente purificar complexos INO80 utilizando um tampão contendo NaCl 450 mM para minimizar os contaminantes (descrito em 3). Temos usado buffers contendo tanto quanto 1 M NaCl para purificar complexos INO80 ativos; no entanto, obtém-se uma diminuição da produção de complexos ativos nessas condições;
2) Diminuir a proporção de FLAG agarose para lisado celular durante imunopurifica�o; a quantidade ideal de FLAG-agarose deve ser determinada por titulação;
3) acompanhantes dependentes de ATP pode permanecer ligado a proteínas marcadas no pavilhão durante imunopurifica�o. Estas podem muitas vezes ser removido através da inclusão de ATP 1 mM no tampão de lavagem durante a imunopurificação;
4) Nós temos bem sucediday removeu o ADN contaminante, incluindo benzonase numa concentração de 25 unidades / ml, durante a incubação do extracto de grânulos com FLAG-agarose. ATENÇÃO: É essencial para se certificar de benzonase é removido durante as etapas de lavagem posteriores, como DNase residual irá degradar DNA substrato ou nucleossomos durante os ensaios para a atividade INO80.
A interpretação destes ensaios ATPase poderia, em princípio, ser complicada pelo fato de que os complexos de remodelação INO80 cromatina conter várias ATPases potenciais, incluindo os, proteínas actina-like SnF2-como núcleo ATPase INO80 ARP5, Arp8, Baf53a, actina, ea AAA + ATPases Tip49a e Tip49b. Apesar da presença física de vários ATPases, no entanto, estudos anteriores demonstraram que apenas os complexos contendo cataliticamente activa pode suportar INO80 DNA- ou hidrólise de ATP nucleossoma-activada; complexos contendo o formulário E653Q cataliticamente inativa de INO80 ATPase não exibem DNA- detectável ou estimuladas por nucleosome ATPase actividade sob quaisquer condições testadas 8. Assim, ADN e / ou a actividade de ATPase estimulada por nucleossoma de INO80 ou subcomplexos INO80 são contribuídos principalmente pela subunidade INO80 ATPase.
Figura 1 INO80 actividade remodelação nucleossoma depende do domínio INO80 HSA e / ou subunidades associadas, mas é independente do INO80 DTN e subunidades específicas de metazoários. Ensaios remodelação nucleossoma foram realizadas com complexos imunopurificada-FLAG a partir de extractos nucleares preparados a partir de linhas celulares que expressam FLAG -tagged versões de tipo selvagem ou mutantes INO80 subunidades. Complexos INO80 intactas foram purificados a partir de linhas de células que expressam FLAG-Ies2 ou FLAG-INO80E; Subcomplexos INO80 foram purificados a partir de linhas de células que expressam FLAG-Ino80ΔN ou FLAG-Ino80ΔNΔHSA. A concentração relativa (rel. Conc.) De 1 corresponde a ~ 10 nM de complexo INO80.
Figura 2. Nucleosome ligação pelo complexo INO80 é independente da INO80 DTN e subunidades específicas de metazoários. Ensaios de ligação nucleossoma foram realizadas na presença de quantidades variáveis do complexo INO80 imunopurificada-FLAG indicada. A ligação do INO80 ou subcomplexos INO80 para mononucleosomes resultados no surgimento de bandas lentas-migração "super-deslocados" correspondentes a mononucleosomes estável vinculado por INO80 ou subcomplexos INO80. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 "src =" / files / ftp_upload / 51721 / 51721fig3highres.jpg "/>
Figura 3 DNA- e ensaios ATPase nucleosome-dependentes. TLC (cromatografia em camada delgada) à base de ensaios ATPase foram realizados para medir a taxa de hidrólise de ATP pela INO80 subcomplexos purificado através FLAG-Ino80ΔN (ΔN) ou FLAG-Ino80ΔNC (ΔNC) em a presença de quantidades saturantes de ADN ou de nucleossomas. Os ensaios foram realizados utilizando duas concentrações diferentes de cada complexo (5 nm e 10 nm) e para três tempos de reação diferentes. A quantidade de ATP hidrolisado (em pmol) nas reações é indicado abaixo de cada painel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| 67,5 mL | H2O |
| 10 ul | 10x PCR tampão de reação (ver lista de materiais) | </ Tr>
| 1 ul | pGEM-3Z-601 (a 10 ng / mL) |
| 5 ul | iniciador directo (10 pm) |
| 5 ul | iniciador de sentido inverso (10 mm) |
| 0,5 ul | solução de estoque contendo dNTP 10 mM de cada um dos quatro dNTPs |
| 1 ul | Taq ADN polimerase (5 unidades / ul) |
| 10 ul | [Α- 32 P] dCTP (6000 Ci / mmol, 3,3 M) |
Tabela 1 mistura de reacção para amplificação por PCR do fragmento de "601" de DNA marcado radioactivamente.
| 20 nM | INO80 ou INO80 subcomplexos |
| 2,8 nM | nucleossomas (consistindo de uma mistura de mononucleosomes nas 32 601 fragmentos de ADN e células Hela nucleossomas marcadas com P) |
| 1 mM | ultrapura ATP |
| 20 mM | HEPES-NaOH (pH 7,9) |
| 50 mM | NaCl |
| 5 mM | MgCl2 |
| 1 mM | ditiotreitol (DTT) |
| 0,1 mM | fluoreto de fenilmetanossulfonilo (PMSF) |
| 0,1 mg / mL | albumina de soro bovino (BSA) |
| 5% | glicerol |
| 0,02% | Nonidet P-40 |
| 0,02% | Triton X-100 |
Tabela 2. Componentes de nucleossomas dependente de ATP remodelação ensaios.
| 32,6 ml | H2O |
| 5 ml | 40% de acrilamida / Bis (37,5: 1) |
| 2 ml | 10x TBE (Tri 900 mMs-borato, 20 mM de EDTA) |
| Adicione os seguintes ingredientes imediatamente antes de derramar o gel: | |
| 0,4 ml | 10% de persulfato de amónio |
| 0,1 ml | Temed |
Tabela 3: Preparação de gel de poliacrilamida nativo a nucleossomas remodelação ensaios dependentes de ATP.
| 10 mM | HEPES pH 7,9 |
| 10% | glicerol |
| 100 mM | NaCl |
| 1,5 mM | MgCl2 |
| 0,05% | Triton X-100 |
| Adicionar imediatamente antes da utilização: | |
| 1 mM | TDT |
| 200 uM | PMSF |
| 1: 1000 de diluição | Inibidor de Protease Cocktail (ver lista de materiais) |
Tabela 4 tampão EB100.
| 3,9 l | H2O |
| 1 ul | Remodelação 10x tampão (200 mM de HEPES-NaOH (pH 7,9), 0,2% de NP-40, 0,2% de Triton X-100, 50% glicerol, 50 mM de MgCl2, 1 mg / ml de BSA) |
| 0,1 l | ATP 100 mM |
| 0,01 l | DTT 1 M |
| 0,01 l | PMSF 100 mM |
| 0,25 l | substrato mononucleosome reconstituída a partir do Passo 1.2 |
Tabela 5 Os componentes do cocktail mestre para nucleossomas remodelação ensaios dependentes de ATP.
| 0,33 l | 400 nucleossomos nM Hela |
| 0,75 l | 100 nM DNAs de esperma de salmão sonicado |
| 0,01 l | DTT 1 M |
| 0,01 l | PMSF 100 mM |
Tabela 6 Removendo mix cocktail.
| 2 ul | H2O |
| 0,25 l | 20x ATPase tampão contendo 400 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 200 mM, 132 mM MgCl2, 16 mM de EDTA, 0,3% de Nonidet P-40, 50% de glicerol, 2 mg / ml de BSA |
| 0,1 l | 100 uM de ATP |
| 0.005 l | DTT 1 M |
| 0.005 l | PMSF 100 mM |
| 0,1 l | [Α- 32 P] ATP (3000 Ci / mmol) |
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Discussion
Para garantir que a remodelação nucleosome e atividades ATPase observamos em ensaios dependem da atividade catalítica de complexos INO80, e não sobre a contaminação de remodelação e / ou enzimas ATPase, nós nucleosome rotineiramente ensaio remodelação e atividade ATPase de versões cataliticamente inativos de complexos INO80, purificado em paralelo com o tipo selvagem INO80 utilizando o mesmo procedimento. Uma reacção de controlo negativo a que falta o ATP também deve ser realizada quando se examina a actividade de remodelação dos nucleossomas para testar a presença de contaminação de ATP e / ou actividades de remodelação ATP-independentes, que podem complicar a interpretação de experiências comparando as actividades de diferentes preparações de complexo INO80 ou subcomplexos. Cataliticamente versões inativas de INO80 ou subcomplexos INO80 deve apresentar nenhuma remodelação nucleosome ou atividades ATPase. Além disso, a detecção da actividade de ATPase ou DNA- nucleossoma-independente indica a presença de contaminação de ATPase (s) no enzymfracção de e. Se a actividade é ainda detectado na presença de cataliticamente inactivo INO80 ou se houver DNA- substancial ou a actividade de ATPase nucleossoma-independente, mesmo depois de optimizar a purificação, tal como descrito em "Resultados representativos, 'complexos pode ainda ser purificado utilizando passos adicionais, tais como permuta iónica ou cromatografia de filtração em gel ou sedimentação gradiente.
Ao medir a remodelação nucleosome e atividades ATPase, é aconselhável realizar ensaios para diferentes períodos de tempo e com mais de uma concentração de INO80 ou subcomplexos INO80 para garantir medidas estão sendo tomadas quando em tempo produto e curvas dose-resposta são lineares. Da mesma forma, a ligação de nucleossomas ensaios devem ser realizados usando várias concentrações do complexo INO80 (es); caso contrário, não se pode comparar de forma confiável as atividades de diferentes preparações INO80.
Nucleosome deslizamento e ensaios de ligação deve sempre incluir reacções de controloque incluem mononucleosome substrato sozinho como um marcador para mostrar a mobilidade electroforética da população de partida nucleossoma. Desta forma, pode-se identificar facilmente as alterações devidas especificamente a presença da fracção de enzima. Tais reações de controle também avaliar a integridade dos mononucleosomes reconstituídos.
Para conduzir nucleosome facilmente interpretável deslizamento e ensaios de ligação, é útil para gerar substratos mononucleosomal homogêneos; por esse motivo, o ensaio descrito no presente protocolo utiliza nucleossomas montados sobre um fragmento de ADN contendo uma sequência de posicionamento do nucleossoma forte. Embora o complexo tende a reposicionar INO80 nucleossomas posicionado lateralmente para uma posição mais central de um fragmento de ADN, outras enzimas remodelação da cromatina, tal como o complexo NURF ISWI contendo 9, mover nucleossomas de posições mais centrais em relação às extremidades dos fragmentos de ADN. Assim, durante a tipificação de uma remodelação da cromatina enZyme é útil para preparar substratos mononucleosome em que a sequência de posicionamento do nucleossoma é em locais diferentes. Alternativamente, pode-se empregar substratos em que nucleossomas foram montados em fragmentos de ADN sem uma sequência de posicionamento do nucleossoma. Neste caso, a população de partida nucleossoma irá incluir uma mistura de nucleossomas mais central e lateralmente posicionado.
O processo de remodelação nucleosome ATP-dependente pode levar a vários resultados de remodelação, incluindo a deslocação completa nucleosome do DNA, o movimento nucleosome no DNA, ou alterações transitórias na estrutura nucleosome que podem não levar a mudanças nas posições dos nucleossomos uma vez que a reação atinge o equilíbrio mas, no entanto, são funcionalmente significativa. O ensaio nucleosome deslizamento descrito pode monitorar as duas primeiras reações, mas pode não ser capaz de detectar alterações transitórias na estrutura nucleosome. Um ensaio que pode detectar alguns desses alt transitóriarações tira proveito do facto de que o ADN nucleossomal na superfície do octâmero nucleossoma é praticamente inacessíveis ao corte por uma enzima de restrição, enquanto ligante de ADN que tenha sido deslocada a partir da superfície por octâmero nucleossoma deslizante ou desenrolamento parcial de ADN nucleossomal é susceptível ao corte 10,11,12. Um tal ensaio também pode ser particularmente útil no caso em que a enzima se liga remodelação nucleossoma tão firmemente ao seu substrato, que não pode ser removido por concorrente 13.
Nosso nucleosome deslizamento e ensaios de ligação medir as atividades INO80 utilizando substratos mononucleosomal preparados com histonas de células HeLa nativas. No entanto, as actividades de remodelação INO80 ou outras enzimas remodelação da cromatina pode, em princípio, ser afectada pela presença ou ausência de modificações pós-tradução ou variantes específicos de histona. Além disso, mononucleosomes pode estimular as atividades do complexo INO80 diferente do que di-nucleossomos,ou uma matriz de nucleossomas. Assim, as atividades de medição do complexo INO80 usando substrato nucleosomal mais complicada e diversificada pode fornecer uma visão sobre o mecanismo pelo qual os complexos de remodelação INO80 cromatina são regulados.
Como uma alternativa para a utilização de fragmentos de ADN radiomarcados na remodelação dos nucleossomas e ensaios de ligação, alguns investigadores nucleossomas visualizar e / ou de ADN por coloração do ADN com brometo de etídio nucleossomal 14; no entanto, ensaios realizados utilizando métodos de detecção não radioactivo pode ser consideravelmente menos sensível do que a descrita no presente protocolo, normalmente exige a utilização de significativamente mais enzima.
Monitorizar o progresso de reacções de ATPase como uma função do tempo utilizando o ensaio de base P-32 aqui descrito requer voltas separadas de manipulação e análise da amostra em cada ponto de tempo. Como uma abordagem alternativa, a actividade de ATPase pode ser medida utilizando os ensaios baseados em fluorescência Os procedimentos que descritos no presente documento JOVE foram utilizados para caracterizar três propriedades bioquímicas distintas de INO80 ou INO80 subcomplexos no processo de ATP-dependente remodelação nucleossoma. Usando várias subcomplexos INO80 ou mutantes INO80 nestes ensaios, é possível para dissecar a contribuição funcionais de várias subunidades INO80 e / ou estruturas de domínios para a actividade de remodelação INO80 nucleossoma e para definir o passo (s) na reacção em que a remodelação subunidades INO80 e / ou os domínios podem ser importantes. Estes procedimentos podem ser adaptados para o estudo de outras remodelação nucleossoma e de ligação e enzimas ATPases wom tanto DNA- e atividades nucleossomos-dependentes ou independentes. Notamos que diferentes enzimas cromatina remodelação pode ter actividades de maior ou menor intrínsecas ATPase ou remodelação nucleosome do que o complexo INO80 humano. Assim, quando a adaptação destes protocolos para a análise de outros enzimas da cromatina pode ser notada, deve-se variar as concentrações de enzima, ATP, ADN ou nucleossomas, e os tempos de reacção e / ou temperaturas, a fim de optimizar os ensaios para os enzimas particulares em estudo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| 10x PCR reaction buffer | Roche Applied Science | 11435094001 | |
| Roche Taq DNA Polymerase | Roche Applied Science | 11435094001 | |
| NucAway Nuclease-free Spin Columns | Ambion | Cat. # AM10070 | |
| ultrapure ATP | USB/Affymetrix | 77241 25 UM | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| 40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Amresco | 0254-500ML | |
| Sonicated salmon sperm DNAs | GE Healthcare | 27-4565-01 | |
| 10% ammonium persulfate (APS) | Thermo Scientific | 17874 | |
| benzonase | Novagen | Cat. No. 70664 | |
| dCTP, [α-32P]- 6,000 Ci/mmol | PerkinElmer | BLU013Z250UC | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| Hoefer vertical electrophoresis unit | Hoefer | SE600X-15-1.5 | |
| lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 | |
| Storage Phosphor Screen | Molecular Dynamics | 63-0034-79 | |
| 3MM filter paper | Whatman | 28458-005 | VWR |
| Typhoon PhosphorImager | GE Healthcare | 8600 | |
| ImageQuant software | GE Healthcare | ver2003.02 | |
| TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F | Millipore | 5725-7 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe | Biodex | Model 14C |
References
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes. Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
- Narlikar, G. J., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and functions of ATP-dependent chromatin-remodeling enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
- Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, J. W., Conaway, R. C. Generation and purification of human INO80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes. , (2013).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 276 (1), (1006).
- Owen-Hughes, T., et al. Analysis of nucleosome disruption by ATP-driven chromatin remodeling complexes. Methods Mol. Biol. 119, 319-331 (1999).
- Udugama, M., Sabri, A., Bartholomew, B. The INO80 ATP-dependent chromatin remodeling complex is a nucleosome spacing factor. Mol. Cell Biol. 31 (4), 662-673 (2011).
- Jin, J., et al. A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (1074).
- Chen, L., et al. Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling. Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).
- Hamiche, A., Sandaltzopoulos, R., Gdula, D. A., Wu, C. ATP-dependent histone octamer sliding mediated by the chromatin remodeling complex NURF. Cell. 97 (7), 833-842 (1999).
- Polach, K. J., Widom, J. Restriction enzymes as probes of nucleosome stability and dynamics. Methods Enzymol. 304, 278-298 (1999).
- Anderson, J. D., Thastrom, A., Widom, J. Spontaneous access of proteins to buried nucleosomal DNA target sites occurs via a mechanism that is distinct from nucleosome translocation, Mol.Cell Biol. 22 (20), 7147-7157 (2002).
- Saha, A., Wittmeyer, J., Cairns, B. R. Chromatin remodeling through directional DNA translocation from an internal nucleosomal site. Nature Structural and Molecular Biology. 12 (9), 747-755 (2005).
- Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (33), 13770-13774 (2009).
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes. Nature. 492 (7428), 280-284 (2012).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Direct Webb, M. R. Real-Time Measurement of Rapid Inorganic Phosphate Release Using a Novel Fluorescent Probe and Its Application to Actomyosin Subfragment 1 ATPase, Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
- Luk, E., et al. Stepwise histone replacement by SWR1 requires dual activation with histone H2A.Z and canonical nucleosome. Cell. 143 (5), 725-736 (2010).
