Introduction
SNF2 семья хроматина комплексы включают центральную SNF2-как АТФазную субъединицы 1,2. Некоторые SnF2-АТФазы, как функция в виде отдельных субъединиц ферментов, в то время как другие функционировать в качестве каталитической субъединицы крупных мульти-субъединицы комплексов. Выяснение молекулярных механизмов, с помощью которых каждый из субъединиц хроматина комплексов способствовать их деятельности требует способность выполнять биохимические анализы, которые рассекают процесс ремоделирования.
АТФ-зависимой нуклеосом ремоделирование человеческим INO80 комплекса и других ферментов хроматина могут быть предусмотрены как многоступенчатый процесс, который начинается с связывания фермента ремоделирования к нуклеосом, с последующей активацией его ДНК-и / или нуклеосом-зависимой АТФ-азы, транслокация ремоделирования фермента на нуклеосомной ДНК, и в конечном итоге репозиционирования нуклеосом 1,2. Понимание молекулярных детали АТФ-зависимый процесс ремоделирования хроматина гequires рассечение реакции ремоделирования в его отдельных этапов и определения вклада отдельных субъединиц хроматина комплекса к каждому стадии реакции. Такие анализы требуют умение анализировать нуклеосом ремоделирования и другие мероприятия с использованием определенных молекулярных субстратов в пробирке.
В предыдущем протоколе богу, мы описали процедуры, используемые для создания INO80 хроматина комплексов и подкомплекса с определенными субъединиц композиций 3. Здесь мы представляем три биохимические анализы, которые позволяют количественный анализ нуклеосоме связывания, ДНК-и нуклеосом-активируется АТФ-азы, и нуклеосом деятельности ремоделирования связанных с такими комплексами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 АТФ-зависимых нуклеосомных Ремоделирование Анализы
Для измерения АТФ-зависимой нуклеосом ремоделирования деятельности, иммунологически INO80 или INO80 подкомплексы инкубируют с АТФ и mononucleosomal подложки, которая содержит одну нуклеосомы, расположенную на одном конце 216 п.н., 32 Р-меченного фрагмента ДНК. Реакционные продукты затем подвергали электрофорезу в нативных поли-акриламида гелей.
- Для создания 32 P-меченых, '601' фрагмента ДНК, амплификации из pGEM-3Z-601 4 фрагмент ДНК 216 б.п., содержащий 601 нуклеосом последовательность позиционирования конечного расположенный, с использованием олигонуклеотидов 5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG и 5'-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG как прямого и обратного праймеров.
- Установка ПЦР с 100 мкл, как описано в таблице 1.
- Выполните реакции ПЦР в термоциклере используя следующую программу: 1 мин при 96 ° C, followeD на 45 сек при 94 ° С, 30 сек при 57 ° С, 60 сек при 72 ° С в течение 30 циклов; заканчивая 7 мин при 72 ° С.
- После того как реакция завершена ПЦР, удалить некорпоративные нуклеотидов путем передачи продуктов реакции в два раза через нуклеазы без центрифужных колонок.
- Запуск 5 мкл очищенного продукта ПЦР в 1,2% агарозном геле, чтобы подтвердить, что реакция методом ПЦР нужный фрагмент ~ 216 п.н. ДНК.
- Развести 5 мкл очищенного продукта ПЦР в 20 раз, и измерения концентрации ДНК с помощью УФ-спектрофотометра. Средняя урожайность составляет ~ 40 нг / мкл.
- Измеряют радиоактивность 1 мкл очищенного продукта ПЦР в сцинтилляционном счетчике. Оцените эффективность маркировки путем расчета CPM / нг. Успешный реакция маркировки ожидается выход ~ 15 000 CPM / нг 601 фрагмента ДНК.
- Передача клеток HeLa нуклеосомы на меченого 601 ДНК с помощью метода серийных разведений 5.
- Смешайте 2 пмоль32 Р-меченого ДНК-фрагмент 601 с 6 мкг Hela нуклеосом (полученный, как описано 5) в 50 мкл буфера, содержащего 1,0 М NaCl, 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА, 0,1 мМ PMSF и 1 мМ ДТТ и инкубируют при 30 ° С в течение 30 мин.
- Последовательно разбавляя смесь до 0,8 М, 0,6 М и 0,4 М NaCl разбавлением 12,5 мкл, 20,8 мкл, и 41,6 мкл, соответственно, 10 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА, 0,1 мМ PMSF, и 1 мМ ДТТ, с 30-минутной инкубации при 30 ° С после каждого разведения.
- Кроме того разбавленной смеси до 0,2 М, а затем 0,1 М NaCl добавлением 125 мкл, а затем 250 мкл того же самого буфера, содержащего 0,1% Nonidet P-40, 20% глицерина, и 200 мкг / мл БСА, с 30-минутной инкубации при 30 ° С между двух заключительных разведения. Храните mononucleosome подложку при 4 ° С в течение 3 месяцев.
- Выполнение АТФ-зависимые нуклеосом скольжения реакции в общем объеме 10 мкл. REAКомпоненты ие приведены в таблице 2. Поскольку оптимальная концентрация NaCl в течение INO80 нуклеосом ремоделирования активности ~ 50 мМ NaCl (неопубликованные результаты), регулировать общую концентрацию NaCl в каждой реакции до 50 мм, с учетом количества NaCl, содержащейся в препараты нуклеосом и фермента.
- Перед началом настроить анализов, бросить родные поли-акриламид гели (18 х 16 см). Чтобы подготовить единый гель, содержащий 5% акриламида (акриламид: бис-акриламид 37,5: 1), 0.5x КЭ (45 мМ Трис борат, 1 мМ ЭДТА), 0,01% персульфата аммония (APS), и 0,001%, N, N, N, N'тетраметилэтилендиамина (TEMED), смешивают ингредиенты, перечисленные в таблице 3. Разрешить гель для полимеризации, по крайней мере, 2 ч при комнатной температуре.
- Между тем, для каждой реакции должна быть выполнена, сочетают в предварительно охлажденной силиконизированный 1,5 мл микроцентрифужных трубки ~ 20 нМ или INO80 INO80 подкомплексом (полученного, как описано 3) с некоторым количеством EB100 буфера (
- Настройка мастера коктейль с остальными ингредиентами, расширения с коэффициентом 'X' (где X = общее число реакций +3). Количество каждого ингредиента, необходимого для одной реакции 10 мкл представлены в таблице 5; Рецепт должен быть расширен в зависимости от количества реакций, чтобы быть выполненной. Все хорошо перемешать, нажав на трубу или с помощью пипетки вверх и вниз с Pipetman и спин трубку на несколько секунд в настольной микроцентрифуге.
- Разливают 5,25 мкл мастера коктейль, чтобы каждый из реакционных труб, установленных на шаге 1.3.2. Все хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Запуск реакции путем передачи реакционные трубы до 30 ° С тепла блока или водяной бане и инкубируют в течение 2 часов.
- Между тем, готовить 'удаления смеси' коктейль, содержащий конкурента ДНКи нуклеосомы, расширения на коэффициент X (X = общее количество реакций и 4). Количество каждого ингредиента, необходимого для подготовки 1,5 мкл смеси для удаления одной реакции приведены в таблице 6; Рецепт должны быть расширены в зависимости от количества анализов должны быть выполнены.
- Завершить реакции добавлением 1,5 мкл удаления смеси. Хорошо перемешать, спин вниз, и инкубируют при 30 ° С в течение еще 30 мин.
- В то же время, предварительно запустить родной полиакриламидном геле в вертикальном блоке электрофореза при 100 V в течение 30 мин при 4 ° С, с использованием 0.5x TBE буфер, как работает с помощью магнитной мешалки внутри нижней камеры для поддержания постоянной циркуляции буфера.
- Чтобы загрузить образец, добавить 2,5 мкл красителем, содержащим 3x КЭ, 30% глицерина, 0,25% бромфеноловый синий и 0,25% ксилолцианола FF. Все хорошо перемешать, кратко вращаться образцы, и загрузить на гель, используя советы загрузки.
- Запуск гель при 200 V в течение 4,5 ч при 4 ° С с циркуляцией буфера.
- Чтобы обнаружить сигнал, перевести гель для стопку двумя листами фильтровальной бумаги. Оберните бумагу фильтра с гелем на вершине, используя прозрачную пластиковую обертку, а затем выставить его на экране хранения люминофора при 4 ° С в течение требуемого времени.
- Сканирование экран с системой сканера изображений изотопов и проанализировать данные с помощью соответствующего программного обеспечения.
2 Mononucleosome Анализы связывания
Для анализа сродство связывания данного INO80 комплекса для mononucleosomes, выполнить электрофоретической подвижности клавишу Shift Анализ (EMSA), используя mononucleosomal субстрат сгенерированный на шаге 1.2.
- Настройка реакция смесей для анализов связывания, как описано для нуклеосомных ремоделирования анализов, но опустить АТФ и удаление смесь из реакций; инкубировать при 30 ° С в течение 30 мин.
- Добавить 2,5 мкл загрузочного красителя к каждой реакционной смеси, и распространяется на родном полиакриламидном геле, содержащем 3,5% акриламида (акриламид: бис 37,5: 1), 1% глицерина, 0.5x КЭ, 0,01% АПС и 0,001% тетраметилендиамин.
- Использование 0.5x TBE буфер, как работает, запустить гель при 200 V в течение 2,5 ч при 4 ° С с циркуляцией буфера и подвергают к экрану хранения люминофора.
3 ДНК-и нуклеосом-зависимые АТФазы Анализы
Выполнение анализов АТФазы в 5 мкл реакционной смеси, содержащей 20 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 60 мМ NaCl, 6,6 мМ MgCl 2, 0,8 мМ ЭДТА, 0,015% Nonidet P-40, 2,5% глицерина, 0,1 мг / мл BSA, 1 мМ ДТТ, 0,1 мМ ФМСФ, 2 мМ АТФ, 2 мкКи [α- 32 P] АТФ (3000 Ки / ммоль). Для каждого INO80 комплекса или количества INO80 комплекса, который надо анализировать созданы три параллельные реакции, один, содержащий EB100 буфер для измерения ДНК-или нуклеосом-независимый АТФазы, одна из которых замкнутой кольцевой ДНК плазмиды (5000 б.п., ~ 30 нм) для измерения ДНК- зависит АТФазы, и один, содержащий HeLa oligonucleosomes (~ 185 нм) для измерения нуклеосом-зависимой АТФ-азы. Настройте все реакции на льду.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Цифры показывают репрезентативные результаты биохимических анализов, используемых для характеристики INO80 деятельности, в том числе нуклеосоме скольжения (рисунок 1) и связывания (рисунок 2) анализов и ДНК-или нуклеосомных-зависимой АТФазы анализов (рисунок 3).
Эксперимент показано на рисунке 1 сравнивает способность неповрежденных INO80 комплексов очищают FLAG-Ies2 или FLAG-INO80E и INO80 подкомплексов очищают либо FLAG-Ino80ΔN или Ino80ΔNΔHSA катализировать реконструкцию mononucleosomes собранных на 216 б.п., меченного фрагмента ДНК. Положение нуклеосомы на ДНК-фрагмента влияет электрофоретической подвижности; с боков расположены нуклеосом работать быстрее в геле, чем более центрально расположенных нуклеосом. С INO80 хроматина комплексов преимущественно двигаться mononucleosomes к центру куска ДНК 6,7,8, реконструкции деятельность Моническое появлением населением нуклеосом, которые демонстрируют снизилась электрофоретической подвижности. В конце реакции избыток Hela oligonucleosomes и спермы лосося или другой ДНК должен быть добавлен к реакционной смеси в качестве конкурента, чтобы удалить любую подложку с привязкой INO80 или INO80 подкомплексов, так как граница ремоделирование фермент будет меняться электрофоретической подвижности нуклеосомы субстрат. Комплексы очищенные через FLAG Ino80ΔN хватает многоклеточных конкретных субъединиц INO80D, INO80E, Амида, MCRS1, NFRKB, и UCH37, в то время как комплексы очищают Ino80ΔNΔHSA также не хватает Arp4, Arp8 и YY1. Комплексы очищенные через FLAG-Ies2, FLAG-INO80E и FLAG-Ino80ΔN имеют аналогичные мероприятия, указывая, что многоклеточных конкретных субъединиц необязательны для нуклеосом ремоделирования по INO80 комплекса. В отличие от этого, комплексы очищали с помощью FLAG-Ino80ΔNΔHSA неактивны в этом анализе, что свидетельствует о ремоделирование активность зависит от области HSA в Ino80 АТФазы и / или связанные с ним подразделения.
Эксперименты на рисунке 2 сравнить нуклеосому связывания деятельность INO80 и INO80 подкомплекса помощью электрофоретической подвижности анализах сдвига. Эти анализы проводили так же, как нуклеосомы ремоделирования анализов, за исключением того, что нет никакого добавление oligonucleosomes и ДНК в конце реакции, чтобы удалить нуклеосом связанного комплексы. Таким образом, инкубация нуклеосом с увеличением количества интактных INO80 комплексов очищают с помощью INO80E субъединицы приводит к исчезновению зависимости от дозы в диапазоне, соответствующем свободных mononucleosomes и появления новых 'смещается' видов, которые мигрируют в верхней части геля (дорожки 6-8). В отличие от этого, когда нуклеосомы инкубировали с меньшими комплексов, который был очищен с помощью Ino80ΔN и которые не имеют подмножество INO80 субъединиц, смещенные вид мигрирует более быстро (полосы 2-5 и 9-11), что свидетельствует о том, что относительная Mobility из супер-сдвинуты полосы определяется размером комплексов анализа.
Рисунок 3 показывает результаты анализе сравнивая ДНК-и нуклеосом-активируется деятельность АТФазы двух различных подкомплексов INO80. Более медленно мигрирующие пятна соответствуют отправной α- 32 P помечены АТФ, и быстрее, мигрирующие виды ADP продукты реакции; Стрелки указывают направление миграции растворителя.
Один из комплексов, проанализированных здесь, INO80ΔN, включает в себя субъединицы Ino80 АТФазную, расширяющий к нормальному С-конца в белка, в то время как другой, INO80ΔNC, не хватает C-концевой участок Ino80. Хотя эти два комплекса в остальном идентичны, скорость гидролиза АТФ (измеренной конверсии радиоактивно меченного АТФ в АДФ) больше, в присутствии INO80ΔNC, что указывает на С-конец на Ino80 АТФазы может негативно регулировать свою активность. Обратите внимание, что скорость АТФ гидрolysis обеими комплексов больше, в присутствии нуклеосом, чем ДНК, что свидетельствует о INO80 нуклеосомы ремоделирования комплексов предпочитают нуклеосомной субстраты для гидролиза АТФ.
В анализе, показанном на рисунке, есть только очень низкий уровень гидролиза АТФ в реакциях, которые не имеют ДНК нуклеосомы (или в диапазоне от обнаруживается до <5%, что наблюдалось в присутствии ДНК / нуклеосом). Поскольку АТФазы из INO80 и других SnF2 семьи хроматина ферментов сильно стимулируется ДНК или нуклеосом, присутствие значительного ДНК-и / или нуклеосом-независимого АТФазы в очищенных препаратах INO80 комплекса бы предположить наличие загрязняющих сотовой ДНК, или в качестве альтернативы, загрязняя не-INO80 АТФазы, которые не были успешно удалены в процессе очистки. Несколько шаги могут быть предприняты для минимизации введения нежелательных ДНК и / или АТФ-азы при очистке.
1) Увеличение Индекс SКонцентрация высота (NaCl) в обязательных и стиральных шагов в очистке. Использование менее 200 мм NaCl в связывании и шаги стиральные обычно дает препараты ремоделирования комплексов с неприемлемых уровней загрязнения ДНК и / или АТФазы. Мы обычно очищают INO80 комплексы с использованием буфера, содержащего 450 мМ NaCl, чтобы свести к минимуму загрязнений (описанного в 3). Мы использовали буферы, содержащие столько, сколько 1 М NaCl, чтобы очистить активные INO80 комплексы; Однако, мы получим снижение урожайности активных комплексов в этих условиях;
2) Уменьшение соотношения ФЛАГ агарозы в лизата клеток во время иммуноочистки; Оптимальное количество FLAG-агарозы должна определяться титрования;
3) АТФ-зависимой компаньонки может оставаться связанным с FLAG-меткой белков во иммуноочистки. Они часто могут быть удалены в том числе 1 мМ АТФ в промывочном буфере в течение иммуноочистки;
4) У нас есть успехуу удалила загрязнения ДНК, в том числе Benzonase в концентрации 25 ед / мл при инкубации экстракта с флагом-агарозы шариков. ВНИМАНИЕ: Очень важно, чтобы убедиться, что Benzonase удаляется в течение последующих стадий промывки, как остаточное ДНКаза будет деградировать ДНК субстрата или нуклеосом во время анализов для INO80 деятельности.
Интерпретация этих АТФазы анализов может, в принципе, быть осложнена тем, что INO80 хроматина комплексы содержат несколько потенциальных АТФазы, в том числе SnF2-подобное ядро АТФазы Ino80, актин-подобных белков Arp5, Arp8, Baf53a, актина, и AAA + ATPases TIP49a и TIP49b. Несмотря на физическое присутствие нескольких АТФаз, однако, предыдущие исследования показали, что только комплексы, содержащие каталитически активный Ino80 может поддерживать ДНК-или гидролиз нуклеосом-активируется АТФ; комплексы, содержащие каталитически неактивную форму E653Q из Ino80 АТФазы неудачу выставлять обнаруживаемый ДНК-или нуклеосом-стимулированной АТФазную ACTiVity ни при каких условиях проходят 8. Таким образом, ДНК-и / или нуклеосома стимулированной АТФазы из INO80 или INO80 подкомплексов в основном предоставлены субъединицы Ino80 АТФазы.
Рис.1 INO80 нуклеосома реконструкции зданий зависит от домена Ino80 HSA и / или связанных субъединиц, но не зависит от Ino80 НТД и многоклеточных конкретных подразделений. Нуклеосомных ремоделирования анализы проводили с флагом-иммунологически комплексов из ядерных экстрактов, полученных из клеточных линий, выражающих FLAG -tagged версии дикого типа или мутантного INO80 субъединиц. Интактные INO80 комплексы очищали от клеточных линий, выражающих FLAG-Ies2 или флаг-INO80E; INO80 подкомплексы очищали от клеточных линий, выражающих FLAG-Ino80ΔN или флаг-Ino80ΔNΔHSA. Относительное содержание (относительная. Конц.) 1 соответствует ~ 10 нМ INO80 комплекс.
Рисунок 2 нуклеосом связывания по INO80 комплекса не зависит от Ino80 НТД и многоклеточных конкретных субъединиц. Нуклеосомы Анализы связывания проводили в присутствии различных количеств указанного FLAG-иммунологически INO80 комплекса. Связывание INO80 или INO80 подкомплексов в mononucleosomes результаты в появлению медленных-миграции "супер-сдвинутых" полос, соответствующих mononucleosomes стабильно связан INO80 или INO80 подкомплексов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 51721 / 51721fig3highres.jpg "/>
Рисунок 3 ДНК-и нуклеосома-зависимые АТФазы анализы. ТСХ (тонкослойной хроматографии) основе АТФазы анализы проводили для измерения скорости гидролиза АТФ INO80 подкомплексов очищают FLAG-Ino80ΔN (An) или FLAG-Ino80ΔNC (ΔNC) в Наличие насыщения количества ДНК или нуклеосом. Анализы проводили с использованием двух разных концентраций каждого комплекса (5 нМ и 10 нМ) и в течение трех различных временах реакции. Количество АТФ гидролизуется (в пмоль) в реакциях указывается в каждой панели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| 67,5 мкл | H 2 O |
| 10 мкл | 10x ПЦР буфер реакция (см список материалов) | </ TR>
| 1 мкл | pGEM-3Z-601 (10 нг / мкл) |
| 5 мкл | Прямой праймер (10 мкм) |
| 5 мкл | Обратный праймер (10 мкм) |
| 0,5 мкл | дНТФ раствор, содержащий 10 мМ каждого из 4 дНТФ |
| 1 мкл | Taq ДНК-полимеразы (5 ед / мкл) |
| 10 мкл | [Α- 32 Р] дЦТФ (6000 Ки / ммоль, 3,3 мкМ) |
Таблица 1 Реакционная смесь для ПЦР-амплификации радиоактивно меченного фрагмента "601" ДНК.
| 20 нМ | INO80 или INO80 подкомплексы |
| 2,8 нМ | нуклеосом (состоящие из смеси mononucleosomes на P-меченых 601 фрагментов ДНК и Хела клеток нуклеосом 32) |
| 1 мм | сверхчистого ATP |
| 20 мМ | HEPES-NaOH (рН 7,9) |
| 50 мм | NaCl |
| 5 мМ | MgCl 2 |
| 1 мм | дитиотреитола (ДТТ) |
| 0,1 мм | фенилметансульфонилфторид (ФМСФ) |
| 0,1 мг / мл | бычьего сывороточного альбумина (БСА) |
| 5% | глицерин |
| 0.02% | Nonidet P-40 |
| 0.02% | Тритон Х-100 |
Таблица 2 Компоненты АТФ-зависимых нуклеосомных реконструкции анализов.
| 32,6 мл | H 2 O |
| 5 мл | 40% акриламида / бис (37,5: 1) |
| 2 мл | 10x КЭ (900 мм TriS-борат, 20 мМ ЭДТА) |
| Добавить следующие ингредиенты непосредственно перед заливкой геля: | |
| 0,4 мл | 10% персульфат аммония |
| 0,1 мл | TEMED |
Таблица 3 Подготовка родной полиакриламидном геле для АТФ-зависимой нуклеосомных реконструкции анализов.
| 10 мм | HEPES рН 7,9 |
| 10% | глицерин |
| 100 мм | NaCl |
| 1,5 мм | MgCl 2 |
| 0,05% | Тритон-100 |
| Добавить непосредственно перед использованием: | |
| 1 мм | DTT |
| 200 мкМ | ПМСФ |
| 1: 1000 разбавления | Ингибитор протеазы Кокktail (см список материалов) |
Таблица 4 EB100 буфера.
| 3,9 мкл | H 2 O |
| 1 мкл | 10x ремоделирования буфера (200 мМ HEPES-NaOH (рН 7,9), 0,2% NP-40, 0,2% Тритон Х-100, 50% глицерин, 50 мМ MgCl 2, 1 мг / мл БСА) |
| 0,1 мкл | 100 мМ АТФ |
| 0,01 мкл | 1 М DTT |
| 0,01 мкл | 100 мМ PMSF |
| 0,25 мкл | воссоздана mononucleosome субстрат с шага 1.2 |
Таблица 5. Компоненты мастер коктейль для АТФ-зависимой нуклеосомных реконструкции анализов.
| 0,33 мкл | 400 нМ Hela нуклеосом |
| 0,75 мкл | 100 нМ ультразвуком лосося ННО спермы |
| 0,01 мкл | 1 М DTT |
| 0,01 мкл | 100 мМ PMSF |
Таблица 6 Удаление коктейль микс.
| 2 мкл | H 2 O |
| 0,25 мкл | 20x АТФазы буфера, содержащего 400 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 200 мМ NaCl, 132 мМ MgCl2, 16 мМ ЭДТА, 0,3% Nonidet Р-40, 50% глицерина, 2 мг / мл БСА |
| 0,1 мкл | 100 мкМ АТФ |
| 0,005 мкл | 1 М DTT |
| 0,005 мкл | 100 мМ PMSF |
| 0,1 мкл | [Α- 32 Р] АТФ (3000 Ки / ммоль) |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Чтобы гарантировать, что нуклеосом ремоделирование и деятельность АТФазы мы наблюдаем в анализах зависит от каталитической активности INO80 комплексов, а не на загрязнение ремоделирования и / или ферменты, АТФазы, мы обычно анализ нуклеосом реконструкции и АТФазы каталитически неактивных версий INO80 комплексов, очищают Параллельно с дикого типа INO80 используя ту же процедуру. Негативная реакция контроль хватает АТФ также должны быть выполнены при опробования нуклеосом ремоделирования деятельности, чтобы проверить на наличие загрязняющих АТФ и / или АТФ-независимые ремоделирования деятельности, которые могли бы осложнить интерпретацию экспериментов, сравнивающих деятельности различных препаратов INO80 комплекса или подкомплексов. Каталитически неактивным версии INO80 или INO80 подкомплексов не должны проявлять не нуклеосом ремоделирования или деятельности АТФазы. Кроме того, обнаружение ДНК-или нуклеосом-независимого АТФазы указывает на присутствие загрязняющих АТФазы (ы) в Энзимэ фракция. Если активность по-прежнему присутствует в присутствии каталитически неактивной Ino80 или если существует значительная ДНК-или нуклеосом-независимый АТФазы даже после оптимизации очистки, как описано в "репрезентативных результатов," комплексы могут быть дополнительно очищен с помощью дополнительных шагов, таких как ионный обмен или гель-фильтрации или градиент оседания.
При измерении нуклеосом ремоделирования и деятельности АТФазы, целесообразно выполнять анализы в течение различных периодов времени и с более чем одним концентрации INO80 или INO80 подкомплексов для обеспечения измерения принимаются, когда продукт времени и кривые доза-реакция линейны. Аналогично, нуклеосом связывания анализы следует проводить с использованием нескольких концентраций INO80 комплекса (ов); в противном случае, никто не может достоверно сравнивать деятельность различных препаратов INO80.
Нуклеосом скольжения и анализы связывания всегда должна включать реакции управлениякоторые включают mononucleosome субстрат в одиночку в качестве маркера, чтобы показать электрофоретической подвижности исходного нуклеосомной населения. Таким образом, можно легко определить изменения, связанные в частности, в присутствии фракции фермента. Такие реакции управления также оценить целостность восстановленных mononucleosomes.
Для того чтобы провести легко интерпретируемые нуклеосому скольжения и анализов связывания, это полезно для создания однородных mononucleosomal субстраты; По этой причине, анализа, описанного в данном протоколе использует нуклеосомы собран на фрагментом ДНК, содержащим сильную последовательность позиционированием нуклеосом. Несмотря на то, INO80 комплекс имеет тенденцию перемещать в поперечном направлении, расположенных нуклеосом к более центральное положение на фрагменте ДНК, другие хроматина ферменты, такие как ISWI-содержащего комплекса NURF 9, перемещать нуклеосомы от нескольких центральных позиций по отношению к концам фрагментов ДНК. Таким образом, при характеристике любой хроматина ENZyme полезно подготовить mononucleosome субстраты, в которых нуклеосом последовательности позиционирования в различных местах. В качестве альтернативы, можно использовать субстраты, в которых нуклеосомы были собраны на ДНК-фрагментов без нуклеосом последовательности позиционирования. В этом случае, начиная нуклеосом население будет включать смесь более центрально расположенных в поперечном направлении и нуклеосом.
АТФ-зависимый процесс ремоделирования нуклеосом может привести к различным результатам ремоделирования, в том числе полного нуклеосом смещения от ДНК, нуклеосом движения на ДНК, или переходных изменениях в структуре нуклеосом, что не может привести к изменениям в позициях нуклеосом когда реакция достигает равновесия но, тем не менее функционально значимым. Нуклеосом скольжения анализа, описанного может контролировать первые две реакции, но, возможно, не сможет обнаружить переходные изменения в структуре нуклеосом. Один анализ, который может обнаружить некоторые такие переходные Altсмотра использует тот факт, что нуклеосомная ДНК на поверхности нуклеосом октамера в значительной степени недоступными для резки с помощью фермента рестрикции, а линкерной ДНК, которая была вытесненной из октамера поверхности нуклеосомы скольжения или частичное раскручивание нуклеосомной ДНК подвержена резки 10,11,12. Такой анализ может также быть особенно полезно в том случае, если нуклеосом ремоделирование фермент связывается так плотно, чтобы его субстрата, что она не может быть удалена путем конкурента 13.
Наша нуклеосома скольжения и связывания анализы измерения INO80 мероприятий с использованием mononucleosomal субстраты, приготовленные из родных клеток гистонов Hela. Тем не менее, ремоделирование деятельность INO80 или других ферментов хроматина может быть в принципе зависит от наличия или отсутствия конкретных посттрансляционных модификаций или вариантов гистонов. Кроме того, mononucleosomes может стимулировать деятельность INO80 комплекса иначе, чем ди-нуклеосом,или массив нуклеосом. Таким образом, деятельность измерения INO80 комплекса с использованием более сложный и разнообразный нуклеосомной субстрат может обеспечить понимание механизма, посредством которого INO80 хроматина комплексов регулируются.
В качестве альтернативы использованию радиоактивно меченных фрагментов ДНК в нуклеосомы ремоделирования и анализах связывания, некоторые исследователи визуализировать нуклеосомы и / или путем окрашивания ДНК нуклеосомной ДНК с бромистым этидием 14; Однако, анализы проводили с использованием нерадиоактивных методы обнаружения может быть значительно менее чувствительны, чем той, которая описана в этом протоколе, как правило, требует использования значительно более фермента.
Контроль за ходом АТФазы реакций в зависимости от времени, используя 32 P-основанный анализ, описанный здесь требует отдельных раундов обработки и анализа проб в каждый момент времени. В качестве альтернативного подхода, АТФазы может быть измерена с помощью флуоресценции на основе анализов Процедуры мы, описанные в данном документе JOVE были использованы для характеристики трех различных биохимических свойств INO80 или INO80 подкомплексов в процессе АТФ-зависимый нуклеосом ремоделирования. Используя различные INO80 подкомплексов или INO80 мутантов в этих анализах, можно анализировать функциональные вклад различных INO80 субъединиц и / или доменных структур в ремоделирования активности INO80 нуклеосом и определить стадию (ы) в реакции ремоделирования, при которой субъединицы INO80 и / или домены могут иметь важное значение. Эти процедуры могут быть адаптированы для изучения другой нуклеосомной ремоделирования и связывания ферментов и АТФаз шIth как ДНК-и нуклеосом-зависимые или независимые мероприятия. Отметим, что различные структуры хроматина ферменты могут иметь более высокие или ниже внутренние АТФазы или нуклеосома ремоделирования мероприятий, чем INO80 комплекса человека. Таким образом, при адаптации этих протоколов для анализа других ферментов хроматина, следует варьировать концентрацию фермента, АТФ, ДНК или нуклеосом, и время реакции и / или температуры с целью оптимизации анализов для конкретного изучаемого фермента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| 10x PCR reaction buffer | Roche Applied Science | 11435094001 | |
| Roche Taq DNA Polymerase | Roche Applied Science | 11435094001 | |
| NucAway Nuclease-free Spin Columns | Ambion | Cat. # AM10070 | |
| ultrapure ATP | USB/Affymetrix | 77241 25 UM | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| 40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Amresco | 0254-500ML | |
| Sonicated salmon sperm DNAs | GE Healthcare | 27-4565-01 | |
| 10% ammonium persulfate (APS) | Thermo Scientific | 17874 | |
| benzonase | Novagen | Cat. No. 70664 | |
| dCTP, [α-32P]- 6,000 Ci/mmol | PerkinElmer | BLU013Z250UC | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| Hoefer vertical electrophoresis unit | Hoefer | SE600X-15-1.5 | |
| lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 | |
| Storage Phosphor Screen | Molecular Dynamics | 63-0034-79 | |
| 3MM filter paper | Whatman | 28458-005 | VWR |
| Typhoon PhosphorImager | GE Healthcare | 8600 | |
| ImageQuant software | GE Healthcare | ver2003.02 | |
| TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F | Millipore | 5725-7 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe | Biodex | Model 14C |
References
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes. Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
- Narlikar, G. J., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and functions of ATP-dependent chromatin-remodeling enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
- Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, J. W., Conaway, R. C. Generation and purification of human INO80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes. , (2013).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 276 (1), (1006).
- Owen-Hughes, T., et al. Analysis of nucleosome disruption by ATP-driven chromatin remodeling complexes. Methods Mol. Biol. 119, 319-331 (1999).
- Udugama, M., Sabri, A., Bartholomew, B. The INO80 ATP-dependent chromatin remodeling complex is a nucleosome spacing factor. Mol. Cell Biol. 31 (4), 662-673 (2011).
- Jin, J., et al. A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (1074).
- Chen, L., et al. Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling. Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).
- Hamiche, A., Sandaltzopoulos, R., Gdula, D. A., Wu, C. ATP-dependent histone octamer sliding mediated by the chromatin remodeling complex NURF. Cell. 97 (7), 833-842 (1999).
- Polach, K. J., Widom, J. Restriction enzymes as probes of nucleosome stability and dynamics. Methods Enzymol. 304, 278-298 (1999).
- Anderson, J. D., Thastrom, A., Widom, J. Spontaneous access of proteins to buried nucleosomal DNA target sites occurs via a mechanism that is distinct from nucleosome translocation, Mol.Cell Biol. 22 (20), 7147-7157 (2002).
- Saha, A., Wittmeyer, J., Cairns, B. R. Chromatin remodeling through directional DNA translocation from an internal nucleosomal site. Nature Structural and Molecular Biology. 12 (9), 747-755 (2005).
- Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (33), 13770-13774 (2009).
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes. Nature. 492 (7428), 280-284 (2012).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Direct Webb, M. R. Real-Time Measurement of Rapid Inorganic Phosphate Release Using a Novel Fluorescent Probe and Its Application to Actomyosin Subfragment 1 ATPase, Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
- Luk, E., et al. Stepwise histone replacement by SWR1 requires dual activation with histone H2A.Z and canonical nucleosome. Cell. 143 (5), 725-736 (2010).
