Introduction
SnF2 familjen kromatin remodeling komplex innefattar en central SnF2 liknande ATPas subenhet 1,2. Vissa SnF2 liknande ATPaser funktion som enskilda subenheten enzymer, medan andra fungerar som den katalytiska subenheten av större multi subenhet komplex. Belysa de molekylära mekanismer genom vilka var och en av subenheterna av kromatin remodeling komplex bidrar till deras verksamhet kräver förmågan att utföra biokemiska analyser som dissekera remodelleringsprocessen.
ATP-beroende nukleosomen remodellering av den mänskliga INO80 komplex och andra kromatin remodeling enzymer kan förutses som en flerstegsprocess som börjar med bindning av remodeling enzym till nukleosomer, följt av aktivering av dess DNA- och / eller nukleosom-beroende ATPas, translokation av ombyggnad enzym på nucleosomal DNA, och eventuell omplacering av nukleosomer 1,2. Förstå de molekylära detaljerna i ATP-beroende kromatin remodelleringsprocessen requires dissektion av ombyggnad reaktion till dess enskilda åtgärder och fastställande av bidragen från enskilda subenheter av kromatin remodeling komplex för varje steg i reaktionen. Sådana analyser kräver förmåga att analysera nukleosomen ombyggnad och andra aktiviteter med hjälp av definierade molekylära substrat in vitro.
I en tidigare JOVE protokoll, beskrev vi metoder som används för att generera INO80 kromatin remodeling komplex och subcomplexes med definierade subenheten kompositioner 3. Här presenterar vi tre biokemiska analyser som möjliggör kvantitativ analys av nukleosomen bindande, DNA- och nukleosom-aktiverade ATPas och nukleosomen remodeling verksamhet i samband med sådana komplex.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 ATP-beroende nukleosom Remodeling Analyser
För att mäta ATP-beroende nukleosomen remodeling aktiviteter, immunrenat INO80 eller INO80 subcomplexes inkuberas med ATP och en mononucleosomal substrat, som innehåller en enda nukleosomen positionerad vid en ände av en 216-bp, 32 P-märkta DNA-fragmentet. Reaktionsprodukterna utsattes därefter för elektrofores i nativa poly-akrylamid-geler.
- För att generera 32 P-märkta, "601" DNA-fragment, förstärker från pGEM-3Z-601 4 a 216 bp DNA-fragment innehållande en slut placerad 601 nukleosomen positioneringssekvens, med hjälp av oligonukleotider 5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG och 5'-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG som Framåt och bakåt primers.
- Sätt upp en 100 ul PCR-reaktion som beskrivs i tabell 1.
- Utför PCR-reaktioner i en termocykelapparat med användning av följande program: 1 min vid 96 ° C, followed med 45 sek vid 94 ° C, 30 sek vid 57 ° C, 60 sek vid 72 ° C under 30 cykler; slutar med 7 min vid 72 ° C.
- Efter PCR-reaktionen är klar, ta bort de personliga nukleotider genom att reaktionsprodukterna två gånger genom nukleasfria spinnkolonner.
- Kör 5 | il av det renade PCR-produkten i en 1,2% agarosgel för att bekräfta att PCR-reaktionen som genereras det önskade ~ 216 bp DNA-fragment.
- Späd 5 | il av det renade PCR-produkten 20-faldig, och mäta DNA-koncentrationen med användning av en UV-spektrofotometer. Den genomsnittliga avkastningen är ~ 40 ng / ul.
- Mät radioaktiviteten av en fil av den renade PCR-produkten i en scintillationsräknare. Uppskatta märkningseffektiviteten genom att beräkna cpm / ng. En lyckad märkningsreaktionen förväntas ge ~ 15,000 cpm / ng 601 DNA-fragment.
- Överför Hela-cell nukleosomer på den märkta 601-DNA med hjälp av en serieutspädningsmetod 5.
- Blanda 2 pmol32 P-märkt 601-DNA-fragment med 6 ng av Hela-nukleosomer (framställd såsom beskrivs 5) i 50 | il av en buffert innehållande 1,0 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF, och 1 mM DTT och inkubera vid 30 ° C under 30 min.
- Sekventiellt späda blandningen till 0,8 M, 0,6 M och 0,4 M NaCl genom spädning med 12,5 pl, 20,8 pl, och 41,6 | il, respektive, av 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF, och 1 mM DTT, med en 30 minuters inkubation vid 30 ° C efter varje utspädning.
- Späd blandningen till 0,2 M och därefter till 0,1 M NaCl genom tillsats av 125 | al och sedan 250 | il av samma buffert innehållande 0,1% Nonidet P-40, 20% glycerol och 200 ug / ml BSA, med en 30 min inkubation vid 30 ° C mellan de två slutliga spädningar. Förvara mononucleosome substratet vid 4 ° C i upp till 3 månader.
- Utför ATP-beroende nukleosomen glidande reaktioner i en total volym av 10 | il. REAction beståndsdelar är upptagna i tabell 2. Eftersom den optimala NaCl-koncentrationen för INO80 nukleosomen remodeling aktivitet är ~ 50 mM NaCl (opublicerade resultat), justera den totala koncentrationen av NaCl i varje reaktion till 50 mM, med hänsyn till den mängd NaCl som finns i beredningar av nukleosomer och enzym.
- Innan du börjar ställa in analyserna, kastade infödda poly-akrylamid geler (18 x 16 cm). För att framställa en enda gel innehållande 5% akrylamid (akrylamid: bisakrylamid 37,5: 1), 0,5 x TBE (45 mM Tris-borat, 1 mM EDTA), 0,01% ammoniumpersulfat (APS) och 0,001% N, N, N', N'-tetrametyletylendiamin (TEMED), blanda ingredienserna anges i tabell 3. Låt gelen polymerisera i minst 2 timmar vid rumstemperatur.
- Under tiden för varje reaktion som skall utföras, kombinera i en pre-kyld silikoniserad 1,5 ml mikrocentrifugrör ~ 20 nM INO80 eller INO80 subcomplex (framställd såsom beskrivits 3) med en mängd av EB100 buffert (
- Inrätta en mästare cocktail med resten av ingredienserna, skala upp med en faktor "X" (där X = totalt antal reaktioner +3). Mängden av varje ingrediens som behövs för en enda 10 pl reaktion är uppräknad i tabell 5; receptet bör ökas i enlighet med antalet av reaktioner som skall utföras. Blanda väl genom att knacka på röret eller genom att pipettera upp och ned med en Pipetman och snurra röret några sekunder i en bänk mikro.
- Fördela 5.25 l av master cocktail till varje reaktionsrören som inrättats i steg 1.3.2. Blanda väl genom att pipettera upp och ned. Starta reaktionerna genom att överföra reaktionsrören till 30 ° C värmeblock eller vattenbad och inkubera i 2 timmar.
- Under tiden förbereder "ta bort mix" cocktail som innehåller konkurrerande DNAoch nukleosomerna, skala upp med en faktor X (X = totala antalet reaktioner + 4). Mängden av varje ingrediens som behövs för att framställa 1,5 l ta bort mix för en enda reaktion listas i tabell 6; receptet bör ökas beroende på antalet analyser som skall utföras.
- Avsluta reaktioner genom att lägga till 1,5 pl av att ta bort mix. Blanda väl, spinn ner, och inkubera vid 30 ° C under ytterligare 30 min.
- Under tiden för-köra nativa polyakrylamidgel i en vertikal elektroforesenhet vid 100 V under 30 min vid 4 ° C, med användning av 0,5 x TBE såsom löpbuffert med en magnetisk omrörarstav inuti den nedre kammaren för att bibehålla konstant buffertcirkulation.
- För att ladda provet, tillsätt 2,5 l av laddningsfärg innehållande 3x TBE, 30% glycerol, 0,25% bromfenolblått, och 0,25% xylencyanol FF. Blanda väl, kortfattat snurra proven, och ladda på gelén med hjälp av last tips.
- Kör gelén vid 200 V under 4,5 h vid 4 ° C med buffertcirkulation.
- För att detektera signalen, överför gelén till en stapel av två ark av filterpapper. Linda filterpapper med gelén på toppen med hjälp av klar plast wrap, och sedan utsätta den för en lagringsfosforskärm vid 4 ° C under önskad tid.
- Skanna skärmen med en isotop bildskannersystem och analysera data med hjälp av lämplig mjukvara.
2. Mononucleosome Bindningsanalyser
För att analysera bindningsaffiniteten för en given INO80 komplex för mononucleosomes, utföra en elektroforetisk mobilitetsförskjutningsanalys (EMSA) med användning av mononucleosomal substratet genererade i steg 1,2.
- Ställ in reaktionen blandar för bindningsanalyser som beskrivs för nukleosomen remodeling analyser men utelämna ATP och ta bort mix från reaktionerna; inkubera vid 30 ° C under 30 min.
- Lägg 2,5 l av laddningsfärg till varje reaktionsblandning, och gäller för en infödd polyakrylamidgel innehållande 3,5% akrylamid (akrylamid: bis 37,5: 1), 1% glycerol, 0,5 x TBE, 0,01% APS, och 0,001% TEMED.
- Att använda 0,5 x TBE som löpande buffert, köra gelen vid 200 V under 2,5 timmar vid 4 ° C med buffertcirkulation och utsättas för en lagringsfosforskärm.
3 DNA- och nukleosomen-beroende ATPas-analyser
Utför ATPas-analyser i 5 ^ il reaktionsblandningar innehållande 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 60 mM NaCl, 6,6 mM MgCl2, 0,8 mM EDTA, 0,015% Nonidet P-40, 2,5% glycerol, 0,1 mg / ml BSA, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 2 mM ATP, 2 ^ Ci av [α- 32 P] ATP (3000 Ci / mmol). För varje INO80 komplex eller mängd INO80 komplex som skall analyseras inrätta tre parallella reaktioner, en som innehåller EB100 buffert för att mäta DNA- eller nukleosom oberoende ATPas, en som innehåller sluten cirkulär plasmid-DNA (5000 bp, ~ 30 nM) för att mäta DNA- beroende ATPas och en innehållande Hela oligonucleosomes (~ 185 nM) för att mäta nukleosom beroende ATPas. Ställ in alla reaktioner på is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Siffrorna visar representativa resultat av biokemiska analyser används för att karakterisera INO80 aktiviteter, inklusive nukleosomen glid (figur 1) och bindning (figur 2) analyser och DNA- eller nukleosomen beroende ATPas-analyser (Figur 3).
Experimentet som visas i figur 1 jämför förmågan hos intakta INO80 komplexen renades genom FLAG-Ies2 eller FLAG-INO80E och av INO80 subcomplexes renades genom antingen FLAG-Ino80ΔN eller Ino80ΔNΔHSA att katalysera remodellering av mononucleosomes hopsatta på ett 216 bp, radiomärkt DNA-fragmentet. Läget för nukleosomen på DNA-fragment påverkar elektroforetisk mobilitet; lateralt placerade nukleosomer springa snabbare i gelén än mer centralt placerade nukleosomer. Eftersom INO80 kromatin remodeling komplex företrädesvis flytta mononucleosomes mot mitten av en bit av DNA 6,7,8 är remodeling aktivitet monivakas av uppkomsten av en population av nukleosomer som uppvisar minskad elektroforetisk mobilitet. Vid slutet av reaktionen, måste ett överskott av Hela-oligonucleosomes och laxsperma eller annan DNA tillsättas till reaktionsblandningen som konkurrent för att avlägsna eventuella substratbundna INO80 eller INO80 subcomplexes eftersom bundet remodeling enzym kommer att förändra den elektroforetiska mobiliteten av nukleosomen substrat. Anläggningar renade genom FLAG Ino80ΔN saknar metazoiska specifika subenheterna INO80D, INO80E, Amida, MCRS1, NFRKB och UCH37 medan komplexen renade genom Ino80ΔNΔHSA saknar också Arp4, Arp8 och YY1. Komplex renade genom FLAG-Ies2, FLAG-INO80E och FLAG-Ino80ΔN har liknande verksamheter, vilket indikerar att de metazoiska specifika subenheter är umbärliga för nukleosomen ombyggnad av INO80 komplex. Däremot renades komplexen genom FLAG-Ino80ΔNΔHSA är inaktiva i denna analys, vilket indikerar att remodellering aktivitet beror på HSA domänen av Ino80 ATPase och / eller dess associerade subenheter.
Experimenten i Figur 2 jämför nukleosomen bindande verksamhet INO80 och INO80 subcomplexes använder elektromobilitetsskiftanalyser. Dessa analyser utförs på liknande sätt som nukleosomen remodeling analyser, förutom att det inte finns någon tillsats av oligonucleosomes och DNA vid slutet av reaktionen för att avlägsna nukleosomen bundna komplexen. Följaktligen renas inkubation av nukleosomer med ökande mängder av intakta INO80 komplex genom INO80E subenheten leder till en dosberoende försvinnande av band motsvarande fria mononucleosomes och utseende av en ny "skiftas" arter som vandrar nära toppen av gelén (spår 6-8). Däremot när nukleosomer inkuberas med mindre komplex som hade renats genom Ino80ΔN och som saknar en delmängd av INO80 subenheter, migrerar snabbare de skiftade arter (banorna 2-5 och 9-11), vilket antyder att den relativa mobbilitet av super-skiftade bandet bestäms av storleken av komplexen analyseras.
Figur 3 visar resultat av en analys för att jämföra den DNA- och nukleosomen-aktiverad ATPas-aktiviteter av två olika INO80 subcomplexes. De mera långsamt migrerar fläckarna motsvarar utgångs α- 32 P-märkt ATP, och de mer snabbt migrerande arter är ADP-reaktionsprodukter; Pilarna anger riktningen för lösningsmedelsmigration.
En av komplexen analyseras här, INO80ΔN, innefattar en Ino80 ATPas subenheten som sträcker sig till proteinets normala C-terminalen, medan den andra, INO80ΔNC saknar Ino80 C-terminala regionen. Även om dessa två komplex är i övrigt identisk, är hastigheten för ATP-hydrolys (mätt genom omvandling av radio-märkt ATP till ADP) är större i närvaro av INO80ΔNC, vilket tyder på C-terminalen av den Ino80 ATPas kan negativt reglera dess aktivitet. Observera att graden av ATP hydrolysis av båda komplexen är större i närvaro av nukleosomer än DNA, vilket tyder på INO80 nukleosomen remodeling komplex föredrar nukleosomala substrat för ATP-hydrolys.
I analysen visas i figuren, det finns bara en mycket låg nivå av ATP hydrolys i reaktioner som saknar DNA eller nukleosomer (allt från omätbara till <5% av värdet i närvaro av DNA / nukleosomerna). Eftersom ATPas-aktiviteten hos INO80 och andra SnF2 familj kromatin remodeling enzymer är starkt stimulerad av DNA eller nukleosomer, skulle närvaron av betydande DNA- och / eller nukleosomen oberoende ATPas-aktivitet i renade beredningar av INO80 komplex antyder närvaron av kontaminerande cellulära DNA, eller alternativt, förorenar inte INO80 ATPaser som inte tagits bort under reningen. Flera åtgärder kan vidtas för att minimera införa oönskade DNA och / eller ATPas under reningen.
1) Öka salt koncentration (NaCl) i de bindande och tvättsteg under reningen. Användning av mindre än 200 mM NaCl i bindning och tvättsteg ger oftast beredningar av remodeling komplex med oacceptabla nivåer av kontaminerande DNA och / eller ATPaser. Vi renar rutinmässigt INO80 komplex med en buffert innehållande 450 mM NaCl för att minimera föroreningar (som beskrivs i 3). Vi har använt buffertar som innehåller så mycket som 1 M NaCl för att rena aktiva INO80 komplex; Men vi får en minskad avkastning på aktiva komplex under dessa förhållanden;
2) Minska förhållandet FLAG agaros till cellysat under immunorening; den optimala mängden FLAG-agaros bör bestämmas genom titrering;
3) ATP-beroende chaperoner får förbli bundna till FLAG-taggade proteiner under immunorening. Dessa kan ofta tas bort genom att inkludera 1 mM ATP i tvättbufferten under immunorening;
4) Vi har framgångsrikay avlägsnas kontaminerande DNA genom att inkludera bensonas vid en koncentration av 25 enheter / ml under inkubation av extrakt med FLAG-agaroskulor. VARNING: Det är viktigt att se till att bensonas tas bort under de efterföljande tvättsteg, eftersom rest DNas försämrar substrat DNA eller nukleosomer under analyser för INO80 aktivitet.
Tolkningen av dessa ATPas-analyser kan, i princip, kompliceras av det faktum att INO80 kromatin remodeling komplex innehåller flera potentiella ATPaser, inklusive SnF2 liknande kärna ATPas Ino80, aktin-liknande proteiner Arp5, Arp8, Baf53a, aktin och AAA + ATPaser Tip49a och Tip49b. Trots den fysiska närvaron av flera ATPaser har dock tidigare studier visat att endast komplex som innehåller katalytiskt aktiva Ino80 kan stödja DNA- eller nukleosom aktiverade ATP hydrolys; komplex innehållande den katalytiskt inaktiv E653Q form av Ino80 ATPas misslyckas att uppvisa detekterbar DNA- eller nukleosomen-stimulerad ATPas activitet under några förhållanden testade 8. Således DNA- och / eller nukleosomen stimulerad ATPas aktivitet INO80 eller INO80 subcomplexes främst bidrar med Ino80 ATPas subenheten.
Figur 1 INO80 nukleosomen remodeling aktivitet beror på Ino80 HSA-domänen och / eller associerade subenheter men är oberoende av Ino80 NTD och metazoiska specifika subenheter. Nukleosomen remodeling utfördes med FLAG-immunrenat komplex från nukleära extrakt framställda från cellinjer som uttrycker FLAG -märkt versioner av vildtyp eller muterade INO80 subenheter. Intakta INO80 komplex renas från cellinjer som uttrycker FLAG-Ies2 eller FLAG-INO80E; INO80 subcomplexes renades från cellinjer som uttrycker FLAG-Ino80ΔN eller FLAG-Ino80ΔNΔHSA. En relativ koncentration (rel. Konc.) Av en motsvarar ~ 10 nM INO80 komplex.
Figur 2. nukleosomen bindning av INO80 komplex är oberoende av Ino80 NTD och metazoiska specifika subenheterna. Nukleosomen bindningsanalyser utfördes i närvaro av varierande mängder av den indikerade FLAG-immunrenat INO80 komplex. Bindning av INO80 eller INO80 subcomplexes att mononucleosomes resultat i framväxten av slow-migrering "super-skiftade" band motsvarande mononucleosomes stabilt bunden av INO80 eller INO80 subcomplexes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 "src =" / filer / ftp_upload / 51721 / 51721fig3highres.jpg "/>
Figur 3. DNA- och nukleosom-beroende ATPas-analyser. TLC (tunnskiktskromatografi) -baserade ATPas-analyser utfördes för att mäta hastigheten av ATP-hydrolys genom INO80 subcomplexes renades genom FLAG-Ino80ΔN (AN) eller FLAG-Ino80ΔNC (ΔNC) i närvaro av mättande mängder av DNA eller nukleosomer. Analyser utfördes med användning av två olika koncentrationer av varje komplex (5 nM och 10 nM) och för tre olika reaktionstider. Mängden ATP hydrolyseras (i pmol) i reaktionerna anges under varje panel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| 67,5 | il | H2O |
| 10 | il | 10x PCR-reaktionsbuffert (se Material List) | </ Tr>
| 1 il | pGEM-3Z-601 (10 ng / | il) |
| 5 pl | framåtriktad primer (10 | im) |
| 5 pl | omvänd primer (10 | im) |
| 0,5 ^ il | dNTP stamlösning innehållande 10 mM vardera av de fyra dNTP |
| 1 il | Taq DNA-polymeras (5 enheter / | il) |
| 10 | il | [Α- 32p] dCTP (6000 Ci / mmol, 3,3 M) |
Tabell 1 Reaction mix för PCR-amplifiering av radioaktivt märkt "601" DNA-fragment.
| 20 nM | INO80 eller INO80 subcomplexes |
| 2,8 nM | nukleosomer (bestående av en blandning av mononucleosomes på de 32 P-märkta 601-DNA-fragmentet och HeLa-cell nukleosomer) |
| 1 mM | ultraren ATP |
| 20 mM | HEPES-NaOH (pH 7,9) |
| 50 mM | NaCl |
| 5 mM | MgCl2 |
| 1 mM | ditiotreitol (DTT) |
| 0,1 mM | fenylmetansulfonylfluorid (PMSF) |
| 0,1 mg / ml | bovint serumalbumin (BSA) |
| 5% | glycerol |
| 0,02% | Nonidet P-40 |
| 0,02% | Triton X-100 |
Tabell 2 Komponenter i ATP-beroende nukleosomen remodeling analyser.
| 32,6 ml | H2O |
| 5 ml | 40% akrylamid / bis (37,5: 1) |
| 2 ml | 10x TBE (900 mM Tris-borat, 20 mM EDTA) |
| Lägg följande ingredienser omedelbart innan du häller gelén: | |
| 0,4 ml | 10% ammoniumpersulfat |
| 0,1 ml | TEMED |
Tabell 3 Beredning av nativ polyakrylamidgel för ATP-beroende nukleosomen remodeling analyser.
| 10 mM | HEPES pH 7,9 |
| 10% | glycerol |
| 100 mM | NaCl |
| 1,5 mM | MgCl2 |
| 0,05% | TritonX-100 |
| Lägg strax före användning: | |
| 1 mM | DTT |
| 200 pM | PMSF |
| 1: 1.000 späd | Protease Inhibitor Cocktail (se Material List) |
Tabell 4. EB100 buffert.
| 3,9 ^ il | H2O |
| 1 il | 10x Remodeling buffert (200 mM HEPES-NaOH (pH 7,9), 0,2% NP-40, 0,2% Triton X-100, 50% glycerol, 50 mM MgCl2, 1 mg / ml BSA) |
| 0,1 ^ il | 100 mM ATP |
| 0,01 | il | 1 M DTT |
| 0,01 | il | 100 mM PMSF |
| 0,25 | il | rekonstituerad mononucleosome substratet från steg 1,2 |
Tabell 5. Komponenter i master cocktail för ATP-beroende nukleosomen remodeling analyser.
| 0,33 | il | 400 nM Hela-nukleosomer |
| 0,75 | il | 100 nM sonikerad laxsperma-DNA: n |
| 0,01 | il | 1 M DTT |
| 0,01 | il | 100 mM PMSF |
Tabell 6 Demontering blanda cocktail.
| 2 | il | H2O |
| 0,25 | il | 20x ATPas-buffert innehållande 400 mM Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM NaCl, 132 mM MgCl2, 16 mM EDTA, 0,3% Nonidet P-40, 50% glycerol, 2 mg / ml BSA |
| 0,1 ^ il | 100 pM ATP |
| 0,005 il | 1 M DTT |
| 0,005 il | 100 mM PMSF |
| 0,1 ^ il | [Α- 32 P] ATP (3000 Ci / mmol) |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att säkerställa att nukleosomen ombyggnad och ATPas aktiviteter vi observerar i analyser är beroende av den katalytiska aktiviteten av INO80 komplex, och inte på kontamine remodeling och / eller ATPas enzymer, vi rutinmässigt analys nukleosomen ombyggnad och ATPas aktivitet katalytiskt inaktiva versioner av INO80 komplex, renas i parallellt med vildtyp INO80 enligt samma förfarande. En negativ kontrollreaktion som saknar ATP bör också göras vid analys nukleosomen remodeling aktivitet för att undersöka förekomsten av förorenande ATP och / eller ATP-oberoende remodeling verksamhet, vilket kan försvåra tolkningen av experiment som jämför verksamheten i olika beredningar av INO80 komplex eller subcomplexes. Katalytiskt inaktiva versioner av INO80 eller INO80 subcomplexes bör uppvisa någon nukleosomen ombyggnad eller ATPas aktiviteter. Dessutom upptäckt av DNA- eller nukleosom oberoende ATPas-aktivitet indikerar förekomst av förorenande ATPas (er) i enzyme fraktionen. Om aktiviteten är fortfarande detekteras i närvaro av katalytiskt inaktivt Ino80 eller om det finns betydande DNA- eller nukleosom oberoende ATPas aktivitet även efter att optimera rening som beskrivs i "Representativa resultat," komplex kan renas ytterligare med hjälp av ytterligare steg såsom jonbyte eller gelfiltreringskromatografi eller gradient sedimentation.
Vid mätning nukleosomen ombyggnad och ATPas verksamhet, är det lämpligt att utföra analyser för kortare eller längre tid och med mer än en koncentration av INO80 eller INO80 subcomplexes att se mätningarna görs vid produkt tid och dos-responskurvor är linjär. På samma sätt bör nukleosomen bindningsanalyser utföras med flera koncentrationer av INO80 komplex (er); annars kan man inte på ett tillförlitligt sätt jämföra verksamheten i olika INO80 preparat.
Nukleosomen glidande och bindningsanalyser ska alltid omfatta kontrollreaktionersom inkluderar mononucleosome substratet ensamt som en markör för att visa den elektroforetiska mobiliteten av utgångs nukleosomen populationen. På detta sätt kan ett enkelt identifiera förändringar som beror specifikt på närvaron av enzymfraktionen. Sådana kontrollreaktioner bedömer också integriteten för de beredda mononucleosomes.
För att genomföra lättolkad nukleosomen glidande och bindningsanalyser, är det bra att skapa homogena mononucleosomal substrat; av detta skäl, den analys som beskrivs i detta protokoll använder nukleosomer sammansatta på ett DNA-fragment innehållande en stark nukleosomen positioneringssekvens. Fastän INO80 komplex tenderar att flytta sig i sidled positionerade nukleosomer till ett mer centralt läge på ett DNA-fragment, andra kromatin remodeling enzymer, såsom den ISWI innehållande NURF komplex 9, flytta nukleosomer från flera centrala positioner mot ändarna av DNA-fragment. Sålunda under karakterisering av varje kromatin remodeling svzyme är det bra att förbereda mononucleosome substrat där nukleosomen positioneringssekvensen är på olika platser. Alternativt kan man använda substrat där nukleosomer har samlats på DNA-fragment utan en nukleosomen positioneringssekvens. I detta fall kommer utgångs nukleosomen befolkningen innehålla en blandning av mer centralt och lateralt placerade nukleosomer.
ATP-beroende nukleosomen remodelleringsprocessen kan leda till olika remodeling utfall, inklusive kompletta nukleosomen förskjutning från DNA, nukleosomen rörelse på DNA, eller övergående förändringar i nukleosomen struktur som inte kan leda till förändringar i positionerna för nukleosomer när svaren når jämvikt men är ändå funktionellt signifikant. Nukleosomen glidande analysen som beskrivs kan övervaka de två första reaktionerna, men kanske inte kan detektera transienta förändringar i nukleosomen struktur. En analys som kan upptäcka några sådana övergående altVanliga funktioner drar fördel av det faktum att nukleosomal DNA på ytan av nukleosomen oktamer är i stort sett otillgänglig för skärning med ett restriktionsenzym, medan linker-DNA som har förskjutits från oktamer ytan genom nukleosomen glidande eller partiell avlindning av nukleosomal DNA är känsliga för att skära 10,11,12. En sådan analys kan också vara särskilt användbart i händelse av att nukleosomen remodeling enzym binder så tätt till sitt substrat att den inte kan avlägsnas genom konkurrent 13.
Vår nukleosomen glidande och bindningsanalyser mäter INO80 verksamhet med hjälp av mononucleosomal substrat framställda med infödda Hela-cell histoner. Däremot kan remodeling verksamhet INO80 eller andra kromatin remodeling enzymer i princip påverkas av närvaron eller frånvaron av specifika posttranslationella modifieringar eller histon varianter. Dessutom kan mononucleosomes stimulera INO80 komplex verksamhet annorlunda än di-nukleosomerna,eller en uppsättning av nukleosomer. Således kan mäta INO80 komplex verksamhet med hjälp av mer komplicerade och mångskiftande nukleosomal substrat ge insikt i den mekanism genom vilken INO80 kromatin remodeling komplex regleras.
Som ett alternativ till användningen av radiomärkta DNA-fragment i nukleosomen remodellering och bindningsanalyser, vissa forskare visualisera nukleosomer och / eller DNA genom färgning nukleosomal DNA med etidiumbromid 14; Men analyser utförs med hjälp av icke-radioaktiva detektionsmetoder kan vara betydligt mindre känslig än den som beskrivs i detta protokoll, vanligtvis kräver användning av betydligt mer enzym.
Övervakning av utvecklingen av ATPas reaktioner som en funktion av tiden med 32 P-baserad analys som beskrivs här kräver separata omgångar av provhantering och analys vid varje tidpunkt. Som ett alternativt tillvägagångssätt, kan ATPas-aktivitet mätas med användning av fluorescensbaserade analyser Förfarandena vi beskrivs i detta JOVE papper har använts för att karakterisera tre olika biokemiska egenskaperna hos INO80 eller INO80 subcomplexes i processen för ATP-beroende nukleosomen ombyggnad. Genom att använda olika INO80 subcomplexes eller INO80 mutanter i dessa analyser, är det möjligt att dissekera de funktionella bidragen från olika INO80 subenheter och / eller domänstrukturer till INO80 nukleosomen remodeling aktivitet och för att definiera steg (n) i remodellering reaktionen vid vilken INO80 subenheter och / eller domäner kan vara viktigt. Dessa förfaranden kan anpassas för studier av andra nukleosomen ombyggnad och bindande enzymer och ATPases wed både DNA- och nukleosom-beroende eller fristående verksamhet. Vi noterar att olika kromatin remodeling enzymer kan ha högre eller lägre inneboende ATPas eller nukleosomen remodeling aktiviteter än den mänskliga INO80 komplex. Därför, när anpassning av dessa protokoll för analys av andra kromatin remodeling enzymer bör en variera koncentrationerna av enzym, ATP, DNA eller nukleosomer, och reaktionstider och / eller temperaturer i syfte att optimera de analyser för de särskilda enzymer som studeras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| 10x PCR reaction buffer | Roche Applied Science | 11435094001 | |
| Roche Taq DNA Polymerase | Roche Applied Science | 11435094001 | |
| NucAway Nuclease-free Spin Columns | Ambion | Cat. # AM10070 | |
| ultrapure ATP | USB/Affymetrix | 77241 25 UM | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| 40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Amresco | 0254-500ML | |
| Sonicated salmon sperm DNAs | GE Healthcare | 27-4565-01 | |
| 10% ammonium persulfate (APS) | Thermo Scientific | 17874 | |
| benzonase | Novagen | Cat. No. 70664 | |
| dCTP, [α-32P]- 6,000 Ci/mmol | PerkinElmer | BLU013Z250UC | |
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| Hoefer vertical electrophoresis unit | Hoefer | SE600X-15-1.5 | |
| lubricated 1.5 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 | |
| Storage Phosphor Screen | Molecular Dynamics | 63-0034-79 | |
| 3MM filter paper | Whatman | 28458-005 | VWR |
| Typhoon PhosphorImager | GE Healthcare | 8600 | |
| ImageQuant software | GE Healthcare | ver2003.02 | |
| TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F | Millipore | 5725-7 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe | Biodex | Model 14C |
References
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes. Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
- Narlikar, G. J., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and functions of ATP-dependent chromatin-remodeling enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
- Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, J. W., Conaway, R. C. Generation and purification of human INO80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes. , (2013).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 276 (1), (1006).
- Owen-Hughes, T., et al. Analysis of nucleosome disruption by ATP-driven chromatin remodeling complexes. Methods Mol. Biol. 119, 319-331 (1999).
- Udugama, M., Sabri, A., Bartholomew, B. The INO80 ATP-dependent chromatin remodeling complex is a nucleosome spacing factor. Mol. Cell Biol. 31 (4), 662-673 (2011).
- Jin, J., et al. A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (1074).
- Chen, L., et al. Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling. Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).
- Hamiche, A., Sandaltzopoulos, R., Gdula, D. A., Wu, C. ATP-dependent histone octamer sliding mediated by the chromatin remodeling complex NURF. Cell. 97 (7), 833-842 (1999).
- Polach, K. J., Widom, J. Restriction enzymes as probes of nucleosome stability and dynamics. Methods Enzymol. 304, 278-298 (1999).
- Anderson, J. D., Thastrom, A., Widom, J. Spontaneous access of proteins to buried nucleosomal DNA target sites occurs via a mechanism that is distinct from nucleosome translocation, Mol.Cell Biol. 22 (20), 7147-7157 (2002).
- Saha, A., Wittmeyer, J., Cairns, B. R. Chromatin remodeling through directional DNA translocation from an internal nucleosomal site. Nature Structural and Molecular Biology. 12 (9), 747-755 (2005).
- Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (33), 13770-13774 (2009).
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes. Nature. 492 (7428), 280-284 (2012).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Direct Webb, M. R. Real-Time Measurement of Rapid Inorganic Phosphate Release Using a Novel Fluorescent Probe and Its Application to Actomyosin Subfragment 1 ATPase, Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
- Luk, E., et al. Stepwise histone replacement by SWR1 requires dual activation with histone H2A.Z and canonical nucleosome. Cell. 143 (5), 725-736 (2010).
