Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

एक reprogrammable माउस मॉडल से आईपीएस सेल मध्यवर्ती की कोशिका की सतह मार्कर मध्यस्थता शोधन

Published: September 6, 2014 doi: 10.3791/51728
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University, 2Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University
* These authors contributed equally

Introduction

भ्रूणीय स्टेम (ते) कोशिकाओं ब्लास्टोसिस्ट चरण भ्रूण 1 की आंतरिक कोशिका द्रव्यमान से निकाली गई है. उचित संस्कृति शर्तों के तहत वे स्वयं को नवीनीकृत और pluripotent रहते हैं. 2006 में Yamanaka और सहयोगियों परिपक्व कोशिकाओं प्रतिलेखन के लिए मजबूर अभिव्यक्ति द्वारा तथाकथित प्रेरित pluripotent स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं में कारकों reprogrammed किया जा सकता है कि प्रदर्शन Oct-4, KLF-4, सॉक्स -2, सी MYC (OKSM) 2. आईपीएस कोशिकाओं, ES कोशिकाओं की तरह, शरीर की सभी प्रकार की कोशिकाओं को जन्म दे सकते हैं, हालांकि, वे ES कोशिकाओं 3 की पीढ़ी के आसपास के नैतिक बाधाओं से मुक्त हैं. इसके अलावा, आईपीएस कोशिकाओं व्यक्तिगत पुनर्योजी दवा का वादा ले और 4,5 स्क्रीनिंग रोग मॉडलिंग जैसे अनुप्रयोगों के लिए और इन विट्रो दवा में अपार क्षमता होती है. इस क्षमता को पूरा करने के लिए प्रौद्योगिकी reprogramming के लिए आदेश में, परमाणु reprogramming के बुनियादी तंत्र को पूरी तरह से समझने की जरूरत है. हालांकि, प्रयासों reprogramming पैट काटनाhway कोशिकाओं का केवल एक बहुत छोटी संख्या (0.1-1%) reprogram तथ्य यह है कि के द्वारा बाधा उत्पन्न किया गया है. सफलतापूर्वक reprogramming fibroblasts reprogramming, अंतर्जात कोर pluripotency नेटवर्क 11-14 की सक्रियता के अंतिम चरण में एक उपकला संक्रमण 6-10 को mesenchymal और, सहित घटनाओं की एक अलग श्रृंखला से गुजरना करने के लिए सूचित किया गया है. हम और दूसरों 12,13,15-17 हाल ही में आग रोक थोक आबादी से दुर्लभ मध्यवर्ती के अलग होने के लिए अनुमति देता है कि कोशिका की सतह मार्कर का एक सेट की पहचान की है. Reprogramming माउस भ्रूणीय (MEFs) fibroblasts 2 सप्ताह के लंबे reprogramming प्रक्रिया के दौरान 15 तेरा-1.2, Ssea1 और (दूसरों के बीच) Epcam की अभिव्यक्ति में परिवर्तन से गुजरना. प्रारंभिक MEFs के एक सबसेट reprogramming दौरान fibroblast पहचान मार्कर (तेरा-1.2) की अभिव्यक्ति नीचे विनियमित करने और फिर pluripotency जुड़े मार्कर SSEA -1 12 व्यक्त शुरू. Reprogramming Ssea1 पॉजिटिव कोशिकाओं के अंतिम चरण के दौरान Reactivऐसे Oct-4 10-13,15 के रूप में अंतर्जात pluripotency जीन खा लिया. यह पिछले संक्रमण detectable Epcam की अभिव्यक्ति (चित्रा 1 देखें) या एक बाद में मंच PECAM 15 में से कोशिका की सतह पर चिह्नित है. हाल ही में, पिता एट अल. Reprogramming मध्यवर्ती की पहचान के लिए तेरा-1.2 और SSEA-1 के लिए विकल्प या पूरक के रूप में CD44 और iCAM1 के उपयोग की सूचना दी. हम पहले से FACS इन कोशिका की सतह मार्कर 15,18 के आधार पर 0 दिन, दिन 3, दिन 6, 9 दिन और 12 दिन reprogramming संस्कृतियों से reprogramming मध्यवर्ती, साथ ही से स्थापित आईपीएस सेल लाइनों को निकाला है. नीचे वर्णित reprogramming प्रणाली और कानून के लिए हम आबादी के समरूप शांत कर रहे हैं, हालांकि, पहचान मध्यवर्ती आबादी में विविधता की एक निश्चित डिग्री है कि एकल कोशिका के स्तर पर पता चला है. यह इन आबादियों के भीतर कोशिकाओं की केवल एक सबसेट संबंधित अगले स्टेशन पर प्रगति करने में सक्षम हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिएreprogramming प्रक्रिया की जीई और बड़े पैमाने पर पहले से 15,19 विशेषता किया गया है जो विभिन्न क्षमता, पर आईपीएस सेल कालोनियों को जन्म दे. इसके अलावा, इन आबादियों के reprogramming दक्षता फिर से चढ़ाना और संस्कृति की स्थिति पर भी निर्भर करेगा. प्रयोगात्मक reproducibility बढ़ाने के लिए हम Rosa26 लोकस के नियंत्रण और एक डॉक्सीसाइक्लिन उत्तरदायी प्रमोटर 20,21 के नियंत्रण के अधीन एक polycistronic OKSM कैसेट के तहत एक ट्रांसक्रिप्शनल transactivator (m2rtTA) व्यक्त करने के लिए इंजीनियर किया गया है कि एक reprogrammable माउस तनाव का उपयोग करें. इस माउस मॉडल का उपयोग आईपीएस सेल पीढ़ी, यानी, संख्या और वायरल सम्मिलित का एकीकरण साइटों के स्थान में सेल परिवर्तनशीलता के लिए सेल के साथ एक विषम प्रारंभिक आबादी के पारंपरिक वायरल तरीकों की अवांछित दुष्प्रभावों में गतिरोध उत्पन्न. दो ट्रांसजेनिक माउस उपभेदों (OKSM, m2rtTA), जैक्सन प्रयोगशाला में समयुग्मक संस्थापक जानवरों के रूप में उपलब्ध है, reprogra स्थापित करने के क्रम में पार करने के लिए हैmmable माउस मॉडल (चित्रा 2 देखें). इस पांडुलिपि में हम MEFs प्राप्त आईपीएस कोशिकाओं को उत्पन्न, और FACS द्वारा रूपांतरण की प्रक्रिया के विभिन्न चरणों में reprogramming मध्यवर्ती अलग करने के लिए कैसे विस्तार से वर्णन है.

Protocol

1 साधन सेटिंग्स / अभिकर्मक तैयारी / जीनोटाइपिंग

  1. आईपीएस सेल मध्यम तैयार: 5 मिलीलीटर गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 500 μl β-mercaptoethanol 75 मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 5 एमएल एल glutamine, साथ, 5 एक्स 10 5 इकाइयों Leukaemia निरोधात्मक कारक 500 मिलीलीटर नॉकआउट DMEM मीडिया पूरक ( LIF). इस पांडुलिपि के संदर्भ में इस्तेमाल किया अभिकर्मकों के लिए उत्पाद की खरीद और जानकारी के लिए सामग्री की सूची देखें.
  2. MEF मध्यम तैयार: 50 मिलीलीटर FBS, 5 एमएल एल glutamine, 5 एमएल गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 5 मिलीग्राम सोडियम पाइरूवेट, 500 μl β-mercaptoethanol के साथ 500 मिलीलीटर DMEM मीडिया अनुपूरक.
  3. , 10 एमएल के लिए DMSO के 1 मिलीलीटर के साथ FBS की 9 मिलीलीटर गठबंधन: मध्यम ठंड तैयार करें.
  4. तैयार जिलेटिन व्यंजन सही उपयोग करने से पहले कम से कम 10 मिनट और महाप्राण के लिए आरटी पर, एक T75 फ्लास्क को 3-5 मिलीलीटर 0.1% सुअर जिलेटिन समाधान जोड़ें सेते लेपित.
  5. , 10 एमएल के लिए FBS की 0.1 मिलीलीटर के साथ पीबीएस के 9.9 मिलीलीटर गठबंधन: FACS लेबलिंग मध्यम तैयार करें.
  6. प्रदर्शन करनाRosa26 m2rtTA लोकस के लिए एक जीनोटाइपिंग पीसीआर: निर्माता के निर्देशों के अनुसार Taq डीएनए पोलीमरेज़ के साथ प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन करना. का प्रयोग करें एक 2 MgCl 3.5 मिमी और निम्नलिखित 3 प्राइमरों के -concentration संशोधित: oIMR8052: 5 'GCG आग AGT टीटीजी टीसीसी टीसीए एसीसी 3', oIMR8545: 5'AAA जीटीसी GCT CTG AGT TGT बुनना 3 ', oIMR8546: 5' GGA GCG GGA GAA ATG जी ए टी ATG 3 '. साइकिल चालन की स्थिति: 3 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस; (30 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस) के 35 चक्र; 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 12 डिग्री सेल्सियस पर पकड़. अपेक्षित उत्पाद का आकार: जंगली प्रकार एलील के लिए 650 बीपी और उत्परिवर्ती एलील के लिए 340 बीपी.
  7. कोलेजन StemCa / OKSM लोकस के लिए एक जीनोटाइपिंग पीसीआर प्रदर्शन करना: निर्देशों के अनुसार Taq डीएनए पोलीमरेज़ के साथ प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन करना. का प्रयोग करें एक 2 MgCl 2.5 मिमी और निम्नलिखित 3 प्राइमरों के -concentration संशोधित: कर्नल / FRT बी: 5 'CCCTCCATGTGTGACCAAGG 3', कर्नल / frtA1: 5 'GCACAGCATTGCGGACATGC 3', कर्नल / frtC1: 5 'GCAGAAGCGCGGCCGTCTGG 3 '. साइकिल चालन की स्थिति: 1 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस (30 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 45 सेकंड के लिए 70 डिग्री सेल्सियस) के 2 चक्र के 6 चक्र (30 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 45 सेकंड के लिए 68 डिग्री सेल्सियस) और 30 चक्र (20 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस) के; 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 12 डिग्री सेल्सियस पर पकड़. अपेक्षित उत्पाद का आकार: जंगली प्रकार एलील के लिए 331 बीपी और उत्परिवर्ती एलील के लिए 551 बीपी.
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 400 XG पर सभी centrifugation कदम बाहर ले.

माउस भ्रूणीय fibroblasts की 2 जनरेशन

  1. M2rtTA तनाव का विपरीत लिंग के एक सदस्य के साथ OKSM तनाव का एक जानवर के बीच एक समय पर संभोग प्रदर्शन करना. मां मुर्गियों को मारने और गर्भाशय सींग निकाल कर भ्रूण दिन 13.5 पर फसल भ्रूण. पहले गर्भाशय सींग को हटाने के लिए, माइक्रोबियल संक्रमण से बचने के लिए, एक 80% इथेनॉल समाधान के साथ पेट क्षेत्र स्प्रे.
  2. (बाँझ फॉस्फेट बफर खारा के 10 मिलीलीटर युक्त एक 10 सेमी टिशू कल्चर डिश में पंजाब गर्भाशय सींग स्थानांतरणएस). (बी चित्रा 3A देखें) एक भ्रूण युक्त टुकड़ों में गर्भाशय सींग कटौती करने के लिए निष्फल शल्य ग्रेड कैंची का प्रयोग करें.
  3. ध्यान से गर्भाशय लिफाफा और प्रत्येक भ्रूण के आसपास के अतिरिक्त भ्रूण झिल्ली को दूर करने के लिए एक विच्छेदन (आदर्श एक टिशू कल्चर हुड के भीतर रखा) माइक्रोस्कोप और निष्फल संदंश का प्रयोग करें. पीबीएस के 10 एमएल के साथ एक अलग 10 सेमी डिश प्रत्येक भ्रूण स्थानांतरण.
  4. भ्रूण के सिर, हाथ पैर, पूंछ और संदंश के साथ आंतरिक अंगों (हृदय, यकृत, आंत आदि) को निकाल कर आगे बढ़ें (चित्रा 3C देखें). एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में भ्रूण का सिर स्थानांतरण और यदि आवश्यक हो तो यह जीनोटाइपिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है तो नीचे फ्रीज.
  5. एक खाली 10cm थाली में भ्रूण का धड़ स्थानांतरण और 2 मिनट के लिए भ्रूण कीमा दो सर्जिकल ब्लेड का उपयोग करें. कीमा बनाया हुआ भ्रूण के शीर्ष पर / trypsin EDTA समाधान के 200 μl जोड़ें और आरटी पर 3-5 मिनट के लिए सेते हैं. एक अतिरिक्त 2 मिनट के लिए क़ीमा जारी रखें में करने के लिए MEF मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ने trypsin सक्रिय है, और उसके बाद एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में हस्तांतरण.
  6. आगे यंत्रवत् कोमल pipetting द्वारा ऊतक अलग कर देना करने के लिए एक 1000 μl विंदुक का प्रयोग करें. एक जिलेटिन लेपित 10 सेमी डिश के लिए स्थानांतरण और MEF मीडिया के एक अतिरिक्त 10 मिलीलीटर जोड़ें. दोनों normoxic और hypoxic इन्क्यूबेटरों संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और अधिक जानकारी के लिए चर्चा करने के लिए देखें: ध्यान दें.
  7. 24-48 घंटे के बाद थाली घनी MEFs साथ कवर किया जाना चाहिए.
  8. वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं तो आगे प्रचारित या नीचे जमे हुए किया जा सकता है. कोशिकाओं की ठंड के लिए, संस्कृति मीडिया को दूर पीबीएस 3 मिलीलीटर trypsin / EDTA समाधान के साथ मीडिया और ओवरले के निशान को दूर करने के लिए मिलीलीटर 10 के साथ पकवान कुल्ला. 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 मिनट के लिए सेते एक 15 मिलीलीटर centrifugation ट्यूब MEF मीडिया और हस्तांतरण के 5 मिलीलीटर जोड़कर trypsin पाचन निष्क्रिय. स्पिन और मीडिया ठंड 3 मिलीलीटर में गोली resuspend. 3 cryovials पर स्थानांतरण और एक सेल ठंड कंटेनर में नीचे फ्रीज.

MEFs के 3 Reprogramming

"ove_content> नोट: गोली 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं और reprogramming के लिए normoxic टिशू कल्चर इन्क्यूबेटरों उपयोग यह निकाले और hypoxic शर्तों (5% ऑक्सीजन के तहत MEFs विस्तार, अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखने के लिए फायदेमंद हो सकता है. ).

  1. जल्दी से एक पानी स्नान (37 डिग्री सेल्सियस) में एक कम बीतने cryovial (P0-P1, 2-3 Mio कोशिकाओं) पिघलना और पूर्व गर्म MEF मीडिया के 10 एमएल के साथ एक ट्यूब में सामग्री हस्तांतरण. गोली कोशिकाओं, 12 मिलीलीटर ताजा MEF मीडिया में Resuspend, एक जिलेटिन लेपित T75 संस्कृति बर्तन में हस्तांतरण, और कोशिकाओं आगे बढ़ने से पहले 24-48 घंटे के लिए ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं. नोट: MEFs भी सीधे व्युत्पत्ति के बाद इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. संस्कृति मीडिया को हटाने के बाद, एक trypsin / EDTA समाधान (37 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 मिनट के लिए 3 मिलीग्राम) के साथ overlaying द्वारा पीबीएस और cellularize साथ MEFs धो लो. MEF मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़कर trypsin बुझा लेते हैं और आगे एक 10 मिलीलीटर विंदुक के साथ कोमल मिश्रण से कोशिकाओं को अलग कर देना. एक hemocytometer का उपयोग सेल नंबर निर्धारित करते हैं.
  3. Reprogra लिएmming प्रयोगों, 6.7 x 10 3 कोशिकाओं / 2 सेमी के घनत्व में जिलेटिन लेपित T75 बोतल पर बीज MEFs (~ कुप्पी प्रति 0.5 Mio कोशिकाओं) 2 माइक्रोग्राम / एमएल डॉक्सीसाइक्लिन युक्त IPSC मीडिया में. हर बार बिंदु के लिए लगभग 2 Mio reprogramming मध्यवर्ती प्राप्त करने के लिए तालिका 1 के बारे में बोने सिफारिशों देखें. नोट: Reprogramming डॉक्सीसाइक्लिन (2 माइक्रोग्राम / एमएल) के अलावा के साथ शुरू मीडिया पूरक
  4. पहले 6 दिनों मीडिया की जगह के लिए ताजा डॉक्सीसाइक्लिन के साथ हर दूसरे दिन IPSC मीडिया (T75 फ्लास्क प्रति मीडिया के 12 एमएल) पूरक. उच्च सेल नंबर अगर वहाँ इस बिंदु से आगे एक दैनिक आधार पर मीडिया को नवीनीकृत. मीडिया परिवर्तन केवल हर दूसरे दिन प्रदर्शन किया जा सकता है अगर संस्कृति मात्रा दोगुना है.
  5. आवश्यक समय बिंदुओं पर हार्वेस्ट reprogramming मध्यवर्ती: एक के लिए (3 मिलीलीटर पीबीएस की उचित मात्रा (एक T75 कुप्पी के लिए 10 मिलीग्राम) के साथ rinsing और trypsin-EDTA समाधान के साथ overlaying, मीडिया को निकाल कर (सुझाव दिन 3, 6, 9, 12) T75 कुप्पी). सेते37 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 मिनट के लिए और कोमल pipetting द्वारा पीछा IPSC मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़कर बुझाना.
  6. , Centrifugation द्वारा सेल एक hemocytometer साथ निलंबन (ऊपर देखें), गोली गणना trypsin के किसी भी निशान को दूर करने के लिए पीबीएस के 10 एमएल में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं महाप्राण. एक बार फिर गोली कोशिकाओं के सतह पर तैरनेवाला Aspirate और reprogramming मध्यवर्ती अलग करने के लिए कदम 4.1 के साथ आगे बढ़ना. नोट: reprogramming के दौर से गुजर कोशिकाओं cryopreserved और एक बाद में मंच पर FACS अलगाव के लिए thawed किया जा सकता है.
  7. पूरी तरह से reprogrammed आईपीएस संस्कृतियों की स्थापना करने के लिए, एक और 4-7 दिनों के लिए Dox मुक्त IPSC मीडिया में कोशिकाओं को विकसित. नोट: सफलतापूर्वक reprogramming संस्कृतियों सुबह 12 से कालोनियों की एक बड़ी संख्या में शामिल होंगे (चित्रा 4 देखें). इस समय के दौरान, अभी भी OKSM अभिव्यक्ति की आवश्यकता है कि न्यायपालिका आईपीएस कोशिकाओं से गायब हो जाएगा.
  8. शुरू में 15 x 10 3 सेल / 2 सेमी की एक घनत्व पर विकिरणित MEFs बीज: वैकल्पिक रूप से, शेष पूरी तरह से reprogrammed आईपीएस संस्कृतियों का प्रचार करने के लिए
  9. अगला, trypsin-EDTA समाधान के 3 मिलीलीटर के साथ overlaying और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 मिनट के लिए incubating, पीबीएस के 10 एमएल के साथ T75 कुप्पी rinsing, मीडिया को निकाल कर cellularize आईपीएस सेल संस्कृतियों. , सौम्य मिश्रण द्वारा पीछा IPSC मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़कर trypsin बुझाना एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए स्थानांतरण, नीचे स्पिन और फिर 10 मिलीलीटर आईपीएस मीडिया में resuspended.
  10. विकिरणित MEFs (T75 कुप्पी) पर इस सेल निलंबन के 500 μl स्थानांतरण और संस्कृतियों 4-5 दिनों के लिए विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं. नोट: स्थापित आईपीएस संस्कृतियों cryopreserved या प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रतिरूप सेल लाइनों एक विदारक माइक्रोस्कोप 22 के तहत व्यक्तिगत IPSC कालोनियों उठा द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.
  11. MEFs के लिए 2.8 में वर्णित के रूप में क्रायो मिला हुआ IPSC संस्कृतियों के संरक्षण.

4 एंटीबॉडी लेबलिंग

  1. में, धारा 3 में तैयार के रूप में reprogramming संस्कृतियों का Resuspend सेल छर्रों,एंटीबॉडी के साथ पूरक FACS लेबलिंग मीडिया (1 विरोधी तेरा-1.2 प्रशांत ब्लू: 400, विरोधी SSEA -1 बायोटिन 1: 400 और विरोधी Epcam FITC 1: 400). 5 लाख कोशिकाओं प्रति पूरक लेबलिंग मिश्रण के 200 μl का प्रयोग करें और बर्फ पर सेते हैं.
  2. 10 मिनट के बाद धीरे बर्फ पर एक अतिरिक्त 10 मिनट के लिए कोशिकाओं resuspend और सेते ट्यूब नल. ट्यूब प्रति ठंड पीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़ें और नीचे स्पिन.
  3. 5 लाख कोशिकाओं प्रति: प्रत्येक ट्यूब के लिए (200) 1 1 μl streptavidin-PeCy7 साथ पूरक लेबलिंग मीडिया के 200 μl तैयार दाग होंगे. कोशिकाओं pelleted किया है, ध्यान से streptavidin-PeCy7 साथ पूरक लेबलिंग मीडिया का एक उचित मात्रा में सतह पर तैरनेवाला और resuspend aspirate.
  4. , Resuspend बर्फ पर एक और 10 मिनट के लिए सेते हैं, ट्यूब प्रति ठंड पीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़ने, नीचे स्पिन और सतह पर तैरनेवाला Aspirate के लिए नल, 10 मिनट के लिए बर्फ पर कोशिकाओं रखें.
  5. लेबलिंग मीडिया में Resuspend सेल छर्रों लगभग 1 एक्स 10 7 कोशिकाओं / एमएल propidium आयोडाइड (पीआई) (2 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ पूरक. एक 70 माइक्रोन झरनी के माध्यम से निलंबन से गुजर रहा सेल clumps निकालें. एक उपयुक्त FACS ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण और बर्फ पर उन्हें रखने के लिए.
  6. व्यक्तिगत एंटीबॉडी के साथ अलग नमूने तैयार (एंटी तेरा-1.2, विरोधी SSEA -1 और विरोधी Epcam). नोट: ये विश्लेषण में इस्तेमाल तीन चैनलों में रंग मुआवजा प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक हैं. इसके अलावा, unlabeled कोशिकाओं छँटाई के लिए वोल्टेज और द्वार स्थापित करने के लिए आवश्यक हैं. आदर्श रूप में आईपीएस कोशिकाओं मुआवजे के लिए उपयोग किया जाता है: विकिरणित MEFs पर बनाए रखा 0.5-1 एक्स 10 6 आईपीएस कोशिकाओं के शेयरों तरल नाइट्रोजन में cryovials में जमा हो जाती है. MEFs की उपस्थिति तेरा-1.2 चैनल में एक संकेत प्राप्त करने के लिए आवश्यक है.
  7. MEFs (धारा 3) के लिए वर्णित के रूप में आईपीएस कोशिकाओं का एक cryovial पहले गला लें. Centrifugation के बाद, लेबलिंग बफर के 800 μl और इस नमूने के 200 μl में resuspend कोशिकाओं unlabeled नियंत्रण के रूप में अलग सेट है.
  8. मुआवजा नियंत्रण के रूप में शेष कोशिकाओं का प्रयोग करें. तीन 15 मिलीलीटर ट्यूब और जोड़ एंटीबॉडी के बीच फूट डालो कोशिकाओंप्रशांत ब्लू मुआवजा नियंत्रण: विरोधी तेरा-1.2 प्रशांत ब्लू एंटीबॉडी के 0.5 μl जोड़ने निम्नानुसार. FITC मुआवजा ट्यूब: विरोधी Epcam-FITC एंटीबॉडी के 0.5 μl जोड़ें. पीई Cy7 मुआवजा नियंत्रण: विरोधी SSEA-1-बायोटिन एंटीबॉडी के 0.5 μl.
  9. , 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेल एंटीबॉडी नमूने रखें दोहन से मिश्रण और बर्फ पर 10 मिनट के लिए सेते हैं.
  10. 10 मिलीलीटर ठंड पीबीएस के साथ धो नमूने, अनबाउंड एंटीबॉडी हटाने नीचे कोशिकाओं स्पिन और सतह पर तैरनेवाला aspirate करने के लिए. FACS लेबलिंग मीडिया के 200 μl में Resuspend सेल छर्रों.
  11. विरोधी SSEA-1-बायोटिन लेबल के नमूने लिए, एक streptavidin-PeCy7 संयुग्म (200 μl कोशिकाओं प्रति 1 μl) जोड़ें. लेबल कोशिकाओं के रूप में प्राथमिक एंटीबॉडी (SSEA-1-बायोटिन) के लिए वर्णन किया.
  12. एक 70 माइक्रोन झरनी के माध्यम से unlabeled नियंत्रण सहित सभी नमूनों दर्रा और पीआई (2 माइक्रोग्राम / एमएल) जोड़ने. FACS ट्यूबों कोशिकाओं स्थानांतरण और आवश्यक जब तक बर्फ पर रहते हैं.

मध्यवर्ती के 5 FACS अलगाव

नोट:कोशिकाओं 405 एनएम, 488 एनएम और 560 एनएम उत्तेजना लेज़रों और एक 100 माइक्रोन नोक के साथ एक प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टर का उपयोग कर हल कर रहे हैं.

  1. सेल की आबादी ठीक से कल्पना की है कि ताकि आगे और पक्ष बिखराव के लिए स्थापित voltages. मलबे को बाहर करने चित्रा 5A में संकेत के रूप में कोशिकाओं के चारों ओर एक फाटक ड्रा. नोट: सेल सॉर्टर पर voltages की सही सेट अप जटिल हो सकता है और एक अनुभवी FACS ऑपरेटर की आवश्यकता कर सकते हैं.
  2. FSC क्षेत्र बनाम उपयोग आगे तितर बितर (FSC) ऊंचाई समुच्चय (चित्रा 5 ब) को बाहर करने के लिए.
  3. पीआई नकारात्मक जीवित कोशिकाओं (चित्रा 5C) पर में गेट को FSC बनाम पीआई चैनल कल्पना.
  4. पंजाब, FITC / GFP, पे, Cy7 की फ्लोरोसेंट चैनलों के लिए voltages समायोजित करने के लिए unlabeled कोशिकाओं का प्रयोग करें. आदर्श रूप में संबंधित चैनल के निचले अंत में सेल की आबादी की स्थिति.
  5. उप अंश reprogramming पंथ को चित्रा 6A, बी के रूप में दिखाया unlabeled नियंत्रण कोशिकाओं के साथ फाटकों सेटदिन 3, 6 में ures और 9 आबादी: SSEA-1 / तेरा-1.2 + कोशिकाओं; SSEA-1 / तेरा-1.2 कोशिकाओं; और reprogramming SSEA-1 / तेरा-1.2 कोशिकाओं मध्यवर्ती.
  6. इसके अलावा दिन 9 SSEA -1 प्रतिभाग + / तेरा-1.2 अंश FITC धब्बा बनाम पे Cy7 का उपयोग; दक्षिण-A1 + / Epcam + कोशिकाओं और SSEA-1 / Epcam- कोशिकाओं के चारों ओर द्वार आकर्षित. चित्रा 6C, डी के रूप में दिखाया unlabeled नियंत्रण कोशिकाओं के साथ फाटक निर्धारित करें.
  7. वांछित subpopulations (MEFs के लिए प्रतिनिधि FACS प्रोफाइल, दिन 3 / दिन 6 / दिन 9/12 दिन संस्कृतियों और आईपीएस कोशिकाओं के लिए 7 चित्र देखें) छँटाई पहले आईपीएस सेल मीडिया (1-2 मिलीग्राम) के साथ उपयुक्त संग्रह ट्यूब भरें.
  8. FACS छँटाई प्रोटोकॉल का विनिर्माण के अनुसार कार्य करें.
  9. FACS अलगाव के बाद आणविक रूपरेखा (आरएनए / प्रोटीन निकासी, chromatin immunoprecipitation, डीएनए methylome विश्लेषण आदि) के लिए कोशिकाओं सबमिट करें. वैकल्पिक रूप से, विभिन्न सेल भिन्न सुसंस्कृत हो सकता है.

Representative Results

एक E13.5 माउस भ्रूण का विच्छेदन, disaggregation और चढ़ाना के बाद, एक 10 सेमी पकवान लगभग 1 से 2 दिनों में confluency तक पहुंचने की उम्मीद है. संस्कृति को ठीक से cellularized नहीं किया गया है कि ऊतक के कुछ पक्षपाती टुकड़े को नियंत्रित करने के लिए इस स्तर पर, यह सामान्य है. ये passaging के बाद गायब हो जाएगा.

डॉक्सीसाइक्लिन प्रेरण पर, reprogramming MEFs अलग morphological परिवर्तन से गुजरना. 6 दिन के आसपास, जल्दी कॉलोनी की तरह पैच (चित्रा 4C) में उभरने के लिए शुरू करना चाहिए. ये आगे संस्कृति पर आकार में बढ़ती रहेगी (चित्रा 4D, ई देखें). एक अच्छा reprogramming प्रयोग शुरू में 5 x 10 5 कोशिकाओं (चित्रा 4E) के साथ वरीयता प्राप्त था कि T75 प्रति 500> में कालोनियों परिणाम चाहिए. स्थापित आईपीएस संस्कृतियों विशेषता गुंबद के आकार कालोनियों के अधिकारी और ज्यादातर विभेदित कोशिकाओं (चित्रा 4F) से रहित होना चाहिए. आईपीएस cultu की कभी कभी, अतिरिक्त passagingजोड़कर undifferentiated / आंशिक रूप से reprogrammed कोशिकाओं को हटाने के लिए आवश्यक हो सकता है; कोशिकाओं का एक मिला हुआ कुप्पी विकिरणित MEFs के एक फीडर परत पर 1:10 के अनुपात में विभाजित किया जा सकता है.

जैसा कि ऊपर कहा, reprogramming दौरान रूपात्मक और आणविक परिवर्तन तेरा-1.2, SSEA -1 और अंततः Epcam (चित्रा 7A एफ देखें) के लिए FACS प्रोफाइल में परिवर्तन से परिलक्षित होते हैं. MEFs तेरा-1.2 के लिए मुख्य रूप से सकारात्मक रहे हैं और अन्य मार्करों के लिए नकारात्मक है, जबकि पहले से 12,15 बताया, दिन 3 संस्कृतियों पहले से ही स्पष्ट रूप से अलग दिखेगा. कोशिकाओं का एक बड़ा हिस्सा तेरा-1.2 की अभिव्यक्ति और इन तेरा-1.2 नकारात्मक कोशिकाओं का एक बहुत छोटा सबसेट SSEA -1, इस समय बिंदु के लिए मध्यवर्ती वास्तविक reprogramming के लिए सकारात्मक हो गए नीचे विनियमित करने के लिए शुरू कर दिया है. दिवस से 3 संस्कृतियों निकाला जा सकता है कि reprogramming मध्यवर्ती की संख्या के प्रतिशत के रूप में बहुत अप्रत्याशित है SSEA-1 / तेरा-1.2 आमतौर पर viabl की 1-10% के बीच एक सीमा में निहित हैई कोशिकाओं. दिन 6 और 9 SSEA -1 + कोशिकाओं का एक बढ़ा प्रतिशत पर, आम तौर पर अच्छी तरह से 10% से ऊपर, पता लगाया जा सकता है. 12 दिन भी Epcam के लिए सकारात्मक लेबल है कि पता लगाया जा सकता SSEA -1 पॉजिटिव कोशिकाओं की एक सबसेट के आसपास. चर रहा है और आम तौर पर सभी जीवित कोशिकाओं के केवल 2-4% की सीमा में पड़ता SSEA-1.2 + / Epcam + कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में 12 दिन संस्कृतियों, दिन 3 संस्कृतियों की तरह, मध्यवर्ती की शुद्धि में एक टोंटी का प्रतिनिधित्व करता है. तालिका 1 में प्रस्तुत reprogramming मध्यवर्ती की उम्मीद की संख्या केवल एक मोटा सन्निकटन के रूप में कार्य करता है. स्थापित सदाशयी आईपीएस सेल संस्कृतियों SSEA -1 और Epcam के लिए दृढ़ता से सकारात्मक हो जाएगा.

चित्रा 1
Reprogramming मार्ग दौरान चित्रा 1 सतह मार्कर परिवर्तन: fibroblast पहचान मार्कर तेरा-1.2 के नीचे विनियमन के ऊपर विनियमन के बाद हैSSEA-1. एक pluripotent राज्य की ओर SSEA -1 पॉजिटिव कोशिकाओं की एक सबसेट के संक्रमण दिन 12 के आसपास Epcam के अधिग्रहण ने संकेत दिया है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2 reprogrammable माउस मॉडल की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व:. M2rtTA अभिव्यक्ति सर्वत्र सक्रिय Rosa26 लोकस के नियंत्रण में है डॉक्सीसाइक्लिन की उपस्थिति में (Dox) m2rtTA प्रोटीन कोलेजन 1A1 पर एक टेट्रासाइक्लिन निर्भर प्रमोटर (tetOP) को बांध (Col1a1) चार कारक कैसेट की अभिव्यक्ति में जिसके परिणामस्वरूप ठिकाना. दो bicistronic कैसेट एक आंतरिक राइबोसोम प्रविष्टि साइट (IRES) से जुड़े हुए हैं. Oct-4 / KLF-4 और सॉक्स-2 / C-MYC के लिए खुला पढ़ने फ्रेम फू हैं आत्म cleaving F2A और E2A दृश्यों से sed, क्रमशः. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3 भ्रूण विच्छेदन: 10 मिलीलीटर पीबीएस और (बी) से भरी 10 सेमी डिश में (ए) स्थानांतरण गर्भाशय सींग एक भ्रूण युक्त टुकड़ों में काट लें. (सी) संदंश अतिरिक्त भ्रूण ऊतक से भ्रूण को मुक्त और सिर, हाथ पैर, पूंछ और आंतरिक अंगों को निकालने का उपयोग करना. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

लेस / ftp_upload / 51728 / 51728fig4highres.jpg "चौड़ाई =" 500 "/>
चित्रा reprogramming के दौरान 4 morphological परिवर्तन. कालोनी की तरह पैच के बाद सुबह 6 से संस्कृतियों में स्पष्ट हो. सदाशयी IPSCs एक आकार गुंबददार आकृति विज्ञान की विशेषता है. (ए) 0 दिन / MEFs, (बी) दिन 3, (सी) दिन 6, (डी) दिन 9, (ई) 12 दिन, (एफ) सेल संस्कृति आईपीएस. स्केल बार:. 200 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5 मूल FACS सेटअप. (ए) आगे तितर बितर क्षेत्र धब्बा बनाम ओर तितर बितर साथ मलबे को बाहर निकालें. (बी)आगे तितर बितर उच्च धब्बा बनाम आगे तितर बितर क्षेत्र के साथ एकल कक्ष जनसंख्या पर gating द्वारा गैर मलबे से समुच्चय को बाहर निकालें. (सी). धब्बा आगे तितर बितर क्षेत्र बनाम पीआई चैनल के साथ पीआई कम घटनाओं पर gating द्वारा एकल कक्ष जनसंख्या से मृत कोशिकाओं को बाहर यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
चित्रा 6 gating. तेरा-1.2 + / SSEA-1 कोशिकाओं, तेरा-1.2 / SSEA-1 कोशिकाओं और के लिए द्वार की स्थापना unlabeled नियंत्रण कोशिकाओं का उपयोग (ए, बी) तेरा-1.2 / SSEA-1 कोशिकाओं. (सी) Epcam सकारात्मक और Epcam नकारात्मक कोशिकाओं के लिए द्वार स्थापित करने के लिए unlabeled नियंत्रण कोशिकाओं का प्रयोग करें. + / तेरा-1.2 कोशिकाओं अलग किया जा सकता SSEA-1 (डी)सकारात्मक और एक Epcam नकारात्मक जनसंख्या में एक Epcam में. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 7
7 चित्रा तेरा-1.2 reprogramming प्रक्रिया के विभिन्न चरणों में SSEA -1 FACS blots बनाम. (ए) 0 दिन / MEFs, (बी) दिन 3, (सी) दिन 6, (डी) दिन 9, (ई) दिवस 12 (एफ) आईपीएस सेल संस्कृति.

तालिका 1 OKSM और m2rtTA के लिए एक भ्रूण विषमयुग्मजी की P1 MEFs के लिए बोने घनत्व, फ्लास्क संख्या और उम्मीद परिणाम का सुझाव दिया. घंटे क्लिक करेंपहले यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

दिवस T75 बोतल की संख्या 0 दिन पर वरीयता प्राप्त FACS के बाद Ssea1 + कोशिकाओं की कुल संख्या FACS के बाद Ssea1 + / Epcam + कोशिकाओं की कुल संख्या
3 8 2 लाख
6 4 2 लाख
9 4 2 लाख
12 10 10 लाख 2 लाख

Discussion

सफलतापूर्वक आईपीएस कोशिकाओं में MEFs reprogram करने और उच्च मात्रा में reprogramming मध्यवर्ती शुद्ध करने के लिए आदेश में यह समग्र दक्षता पर प्रभाव पड़ता है कि कारकों के बारे में पता होना जरूरी है. विशेष रूप से FBS की बैच एक हानिकारक प्रभाव हो सकता आईपीएस मीडिया के पूरक के लिए इस्तेमाल किया. सामान्य सकारात्मक अनुभव में भ्रूण स्टेम (ते) सेल योग्य FBS लेकिन एक सस्ता विकल्प की पहचान हो सकती है विक्रेताओं की एक किस्म से सीरा की बैच परीक्षण के साथ किए गए थे.

Reprogramming दक्षता पर प्रभाव डालता है MEFs 15,20 के जीनोटाइप है कि एक और पहलू है. OKSM और reprogram है m2rtTA ठिकाना, homozygousity एक पर या उच्च reprogramming क्षमता में दोनों loci परिणाम दोनों के लिए चूहों विषमयुग्मजी (बेचैन) से ली गई MEFs है. हेट / हेट <होमो / हेट <बेचैन / होमो <होमो /: दरअसल, OKSM और m2rtTA पार की संतानों से व्युत्पन्न MEFs निम्नलिखित आदेश (OKSM / m2rtTA) में reprogramming दक्षता में वृद्धि शोहोमो (1 टेबल में दिए गए नंबर बेचैन / हेट जानवरों के लिए कर रहे हैं कि कृपया ध्यान दें). एक पुरुष होमोसेक्सुअल / होमोसेक्सुअल जानवर की पहचान की है दुर्लभ अवसर पर कई m2rtTA महिलाओं के साथ संभोग एक अन्त: पुर की स्थापना की जा सकती है. इन पार से सभी संतानों क्रमशः OKSM / m2rtTA loci के लिए / होमो बेचैन कर दिया जाएगा. प्रजनन के लिए युवा चूहों (उम्र के 6-15 सप्ताह) का उपयोग करते समय बड़ा litters प्राप्त कर रहे हैं के रूप में इसके अलावा, litters का तेजी से जीनोटाइपिंग की सिफारिश की है.

इसके अलावा, reprogramming के लिए कम बीतने MEFs का उपयोग 23 पर बल दिया है. MEFs एक normoxic टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में ली गई है और विस्तार किया गया तो हम दृढ़ता से केवल हालांकि बीतने 2 करने के लिए इन कोशिकाओं का उपयोग करने की सलाह देते हैं, प्रयोगकर्ता MEFs की व्युत्पत्ति और विस्तार के लिए एक कम ऑक्सीजन इनक्यूबेटर एक्सेस (5% ऑक्सीजन) है, अभी भी अच्छे परिणाम 23 निकलेगा 3 के रूप में उच्च बीतने संख्या.

मामले में प्रयोगकर्ता reprogramming से जुड़ी समस्याओं का सामना करना पड़ता, बताया गया है कि सबसे अधिक संभावना स्पष्टीकरण Dox अलावा, गलत चूहों के जीनोटाइप या आईपीएस सेल पीढ़ी के लिए अनुकूल नहीं है कि FBS के उपयोग के समय में उच्च बीतने संख्या हैं. हालांकि, दुर्लभ मामलों में हम MEFs भी आदर्श परिस्थितियों में reprogram करने में सक्षम नहीं थे कि मनाया. इन मामलों में m2rtTA का खुला पढ़ने सीमा के भीतर एक सहज डी नोवो विलोपन अंतर्निहित कारण के रूप में पहचान की थी.

इस पद्धति का सफलतापूर्वक चुंबकीय सेल अलगाव (एमएसीएस) के माध्यम से SSEA -1 + मध्यवर्ती निकालने के लिए अनुकूलित किया गया था. एमएसीएस का उपयोग करने में एक स्पष्ट समय लाभ नहीं है, तथापि, SSEA -1 + सेल आबादी 'पवित्रता कोशिकाओं आ सकती है के लिए किस्मत में हैं प्रयोग के प्रकार पर निर्भर करता है जो 80-90%, के बजाय 95% से अधिक, कम है एक समस्या. इस प्रकार, एक विकल्प SSEA-1 / Epcam + और SSEA-1 / Epcam- कोशिकाओं में पवित्रता और / या अंश उन्हें बढ़ाने के लिए FACS द्वारा पीछा SSEA -1 + कोशिकाओं के लिए समृद्ध करने के लिए एमएसीएस उपयोग करने के लिए है.

उल्लिखित प्रोटोकॉल और माउस मॉडल द्वारा उत्पादित आईपीएस कोशिकाओं pluripotent हो और प्रभावी ढंग से काइमेरिक जानवरों 15,20 के सभी ऊतकों में योगदान करने के लिए दिखाया गया है जबकि ">, पूरी तरह tetraploid complementation के माध्यम से इन आईपीएस कोशिकाओं से बना भ्रूण का उत्पादन करने के लिए एक कम क्षमता की गई है 24 का प्रदर्शन किया. DLK-Dio3 जीन क्लस्टर पर न्यायपालिका मेथिलिकरण पैटर्न अंतर्निहित कारण 24 के रूप में पहचान की गई है. हालांकि, reprogramming के दौरान मीडिया से 50 माइक्रोग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में एस्कॉर्बिक एसिड के अलावा tetraploid complementation सक्षम आईपीएस कोशिकाओं 24 का उत्पादन होगा. एक वैकल्पिक reprogrammable माउस मॉडल भी एस्कॉर्बिक एसिड उपचार 25 के अभाव में टेट्राप्लोइड सक्षम आईपीएस कोशिकाओं का उत्पादन कर सकते हैं एक अलग stoichiometry पर reprogramming कारकों व्यक्त करने के लिए इंजीनियर है कि कृपया सलाह दी है. हालांकि, हमारे हाथ कोशिकाओं में कम से काफी कम आवृत्ति की तुलना में इस तनाव reprogram से इस के साथ साथ इस्तेमाल किया माउस मोड परएल.

इस पांडुलिपि में वर्णित पद्धति, जनसंख्या की आग रोक थोक से reprogramming मध्यवर्ती की जुदाई की अनुमति देता है और जैसे काटना और रूपरेखा के लिए एक unfractioned जनसंख्या का उपयोग करने वाले के पिछले सीमाओं को हटाने, reprogramming प्रक्रिया को समझने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण (के रूप में देखा जाना चाहिए आग रोक कोशिकाओं से उच्च संकेत शोर). यहाँ बताया एंटीबॉडी संयोजन हालांकि यह अतिरिक्त कोशिका की सतह मार्कर भी उच्च शुद्धता पर मध्यवर्ती प्राप्त करने की अनुमति होगी कि भविष्य में पर्दाफाश हो जाएगा कि संभव है, उच्च शुद्धता पर माउस कोशिकाओं से मध्यवर्ती के अलगाव की अनुमति देता है. SSEA -1 अभिव्यक्ति मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं की एक बानगी नहीं है और इस तरह इस प्रोटोकॉल के रूप में मानव की उत्पत्ति की कोशिकाओं reprogramming पर इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है कि कृपया ध्यान दें. अंत में, एक बार वर्णित विधि के साथ अलग reprogramming मध्यवर्ती अभिव्यक्ति profilin सहित आणविक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैजी, chromatin immunoprecipitation, methylome विश्लेषण, और प्रोटीन assays.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम मोनाश लार्किंस कार्यक्रम से साथ ही एक NHMRC CDF और एक NHMRC परियोजना अनुदान से वित्तीय सहायता स्वीकार करना चाहते हैं. इसके अलावा, हम वीडियो के निर्माण में उनकी मदद के लिए उसे समर्थन और (विशेष एडम Dinsdale में) मोनाश Flowcore टीम के लिए, उसके रचनात्मक सुझाव के लिए एडविना McGlinn मुकदमा मेई लिम को धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-mouse CD90.2 (Thy1.2) Pacific Blue  eBioscience  48-0902-82 
Anti-Human/Mouse SSEA-1 Biotin  eBioscience  13-8813 
Streptavidin PE-Cy 7  eBioscience  25-4317-82 
Anti-Mouse CD326(Epcam) Fitc  eBioscience  48-5791-82 
Sodium pyruvate  Life Technologies  11360-070 
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA)  Life Technologies  11140-050 
Embryonic Stem Cell qualified Foetal Bovine Serum (FBS)  Life Technologies  10439024
Trypsin-EDTA (0.25%)  Life Technologies  25200-056 
GlutaMAX Life Technologies  35050-070 
β-Mercaptoethanol  Life Technologies  21985-023 
DMSO (Dimethyl Sulfoxide)  Sigma-Aldrich  D8418 
Penicillin/streptomycin  Life Technologies  15140
Propidium Iodide solution (PI)  Sigma-Aldrich  P4864-10ML 
Gelatine from porcine skin  Sigma-Aldrich  G1890 
Doxycyclin hyclate  Sigma-Aldrich  33429-100MG-R 
Leukemia Inhibitory Factor (LIF)  Millipore  ESG1107 
DMEM High Glucose  Life Technologies  11960-044 
DPBS (Dulbecco's phosphate buffer saline)  Life Technologies  14190-144 
KnockOut DMEM  Life Technologies  10829-018 
Irradiated MEFs  Life Technologies  S1520-100 
75-cm2 Tissue culture flasks  Corning/BD Bioscience  430641
15-ml centrifuge tubes  Corning/BD Bioscience  430791
50-ml centrifuge tubes  Corning/BD Bioscience  430829
Disposable surgical blades  Clifford Hallam SM0501
Cryogenic vials  Corning/BD Bioscience  430487
70 µm Cell strainer  BD Bioscience  352340
Taq DNA Polymerase  Life Technologies  10342-020 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Matsui, Y., Zsebo, K., Hogan, B. L. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. Cell. 70, 841-847 (1992).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  3. Stadtfeld, M., Maherali, N., Borkent, M., Hochedlinger, K. A reprogrammable mouse strain from gene-targeted embryonic stem cells. Nature Methods. 7, 53-55 (2010).
  4. Ebert, A. D., Svendsen, C. N. Human stem cells and drug screening: opportunities and challenges. Nature Reviews. Drug Discovery. 9, 367-372 (2010).
  5. Zhang, J., et al. A human iPSC model of Hutchinson Gilford Progeria reveals vascular smooth muscle and mesenchymal stem cell defects. Cell Stem Cell. 8, 31-45 (2011).
  6. Samavarchi-Tehrani, P., et al. Functional genomics reveals a BMP-driven mesenchymal-to-epithelial transition in the initiation of somatic cell reprogramming. Cell Stem Cell. 7, 64-77 (2010).
  7. Celià-Terrassa, T., et al. Epithelial-mesenchymal transition can suppress major attributes of human epithelial tumor-initiating cells. The Journal of Clinical Investigation. 122, 1849 (2012).
  8. Liao, B., et al. MicroRNA cluster 302–367 enhances somatic cell reprogramming by accelerating a mesenchymal-to-epithelial transition. Journal of Biological Chemistry. 286, 17359-17364 (2011).
  9. Cieślik, M., et al. Epigenetic coordination of signaling pathways during the epithelial-mesenchymal transition. Epigenetic., & Chromatin. 6, 1-22 (2013).
  10. Golipour, A., et al. A late transition in somatic cell reprogramming requires regulators distinct from the pluripotency network. Cell Stem Cell. 11, 769-782 (2012).
  11. Maherali, N., et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
  12. Stadtfeld, M., Maherali, N., Breault, D. T., Hochedlinger, K. Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse. Cell Stem Cell. 2, 230-240 (2008).
  13. Brambrink, T., et al. Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of mouse somatic cells. Cell Stem Cell. 2, 151-159 (2008).
  14. Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
  15. Polo, J. M., et al. A molecular roadmap of reprogramming somatic cells into iPS cells. Cell. 151, 1617-1632 (2012).
  16. Wright, A. J., Andrews, P. W. Surface marker antigens in the characterization of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 3, 3-11 (2009).
  17. O'Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. , (2013).
  18. Hansson, J., et al. Highly coordinated proteome dynamics during reprogramming of somatic cells to pluripotency. Cell Reports. 2, 1579-1592 (2012).
  19. Stadtfeld, M., Maherali, N., Breault, D. T., Hochedlinger, K. Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse. Cell Stem Cell. 2, 230-240 (2008).
  20. Stadtfeld, M., Maherali, N., Borkent, M., Hochedlinger, K. A reprogrammable mouse strain from gene-targeted embryonic stem cells. Nature Methods. 7, 53-55 (2009).
  21. Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27, 543-549 (2009).
  22. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).
  23. Utikal, J., et al. Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells. Nature. 460, 1145-1148 (2009).
  24. Stadtfeld, M., et al. Ascorbic acid prevents loss of Dlk1-Dio3 imprinting and facilitates generation of all-iPS cell mice from terminally differentiated B cells. Nature Genetics. 44, 398-405 (2012).
  25. Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).

Tags

सेल बायोलॉजी अंक 91 प्रेरित pluripotent स्टेम सेल स्टेम; reprogramming; मध्यवर्ती; छँटाई फ्लोरोसेंट सक्रिय कोशिकाओं; कोशिका की सतह मार्कर; reprogrammable माउस मॉडल; माउस भ्रूण fibroblasts की व्युत्पत्ति
एक reprogrammable माउस मॉडल से आईपीएस सेल मध्यवर्ती की कोशिका की सतह मार्कर मध्यस्थता शोधन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nefzger, C. M., Alaei, S., Knaupp,… More

Nefzger, C. M., Alaei, S., Knaupp, A. S., Holmes, M. L., Polo, J. M. Cell Surface Marker Mediated Purification of iPS Cell Intermediates from a Reprogrammable Mouse Model. J. Vis. Exp. (91), e51728, doi:10.3791/51728 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter