Summary
بروتوكولات لإعداد كفاءة عينات متجانسة من العناكب، الإصابة من النباتات التجريبية، وتقييم الأضرار النبات، كما هو مطلوب للدراسات التفاعل النبات للآفات وضعت.
Abstract
سوس العنكبوت رصدت اثنين، الخاشية urticae، هو في كل مكان عاشب المفصلية قارت التي تتغذى على مجموعة واسعة بشكل ملحوظ من الأنواع، مع أكثر من 150 من القيمة الاقتصادية. بل هو آفة كبرى من المحاصيل المسببة للاحتباس الحراري، وخاصة في الباذنجانية وقرعية (على سبيل المثال، الطماطم، الباذنجان، الفلفل، الخيار، الكوسة) ونباتات الزينة الدفيئة (على سبيل المثال، الورود، والأقحوان، والقرنفل) والمحاصيل الحقلية السنوية (مثل الذرة والقطن و فول الصويا، وبنجر السكر)، وفي الثقافات المعمرة (البرسيم، والفراولة، العنب، الحمضيات، والخوخ) 1،2. بالإضافة إلى polyphagy المدقع الذي يجعل من الآفات الزراعية الهامة، T. urticae لديه ميل لتطوير مقاومة لمجموعة واسعة من المبيدات الحشرية ومبيدات قراد التي تستخدم لسيطرتها 3-7.
T. urticae هو كائن التجريبية ممتازة، كما أن لديها دورة الحياة السريعة (7 أيام في 27 درجة مئوية)ويمكن الحفاظ على كثافة عالية بسهولة في المختبر. وقد تم تطوير طرق لفحص التعبير الجيني (بما في ذلك الموقع التهجين وتلوين الأجسام المضادة في) وتعطيل التعبير عن جينات العنكبوت سوس الذاتية باستخدام تدخل الحمض النووي الريبي 8-10. في الآونة الأخيرة، وتسلسل الجينوم كله من T. وقد تم الإبلاغ عن urticae، وخلق فرصة لتطوير هذا النبات للآفات باعتبارها كائن النموذج مع الموارد الجيني يعادل موجودة بالفعل في بعض النباتات مضيفه (thaliana نبات الأرابيدوبسيس والطماطم مغد قوطة) 11. معا، يمكن لهذه الكائنات نموذج تقديم نظرة ثاقبة الأسس الجزيئية للتفاعلات النباتات من الآفات.
هنا، يتم وصف وسيلة فعالة لجمع سريعة وسهلة لعدد كبير من العث الإناث الكبار، تطبيقها على المضيف محطة تجريبية، وتقييم الأضرار النباتية بسبب التغذية العنكبوت سوس. بروتوكول قدمت ENABLES جمع سريعة وفعالة من مئات الأفراد في أي مرحلة التطوير (بيض، يرقات، الحوريات، الذكور البالغين، وإناث) التي يمكن استخدامها لتطبيق التجارب اللاحقة.
Introduction
تفاعل النبات من الآفات هو موضوع من الأهمية العلمية والاقتصادية كبيرة. وقد درس تاريخيا باستخدام كل من نباتات المحاصيل (مثل الطماطم) ومحطة نموذجية، A. thaliana. في كلتا الحالتين، يمكن قياس قابلية النبات لعاشب إما مباشرة من خلال تقييم النمط الظاهري المصنع بعد هجوم عاشب أو بشكل غير مباشر من خلال تقييم الأداء الآفات.
واستخدمت القياسات المباشرة من قابلية النبات سابقا لعدد من أنواع الآفات الحشرية باستخدام مجموعة من الأساليب. على سبيل المثال، يقاس الحيوانات العاشبة من اليرقات lepidopteran بمثابة تقدير جزء من الأنسجة النباتية التي يستهلكها إما Plutella xylostella (الماسي العثة) أو Trichoplusia ني (الملفوف وبير) بالعين المجردة بمساعدة شبكة 12. أيضا، هناك طرق التي تستخدم التصوير الرقمي من الأضرار اللاحقة رقة مع تحليل الصور الكمي. واستخدمت هذه الأساليب فيدراسات A. التفاعل مع thaliana Frankliniella occidentalis (التربس زهرة الغربية) 13، Scaptomyza الضبعة (ذبابة الفاكهة أوراق التعدين) 14، وT. ني 15.
وتستخدم على نطاق واسع من القياسات غير المباشرة قابلية النبات في دراسات التفاعل النبات من الآفات. على سبيل المثال، حساسية A. ويتم تقييم thaliana إلى الخوخ المن Myzus بيرسيكا الحيوانات العشبية عادة من خلال تحليل خصوبة الآفات وصفا مورفولوجيا الجسيمة لمصنع بعد التفاعل 16،17. آخر مؤشر غير مباشر نموذجية من A. thaliana التعرض للآفة هو تقييم الوزن الجاف أو الرطب من النبات. يتم استخدام هذه المعلمة عادة لوصف الحيوانات العاشبة من lepidoterans، مثل Pieris rapae (بيضاء صغيرة)، P. xylostella، أو T. ني في اليرقات أو مراحل العذراء 15،17.
العناكب هي الخلية محتوى الحديدeders. ومن المسلم به الضرر الناجم عن سوس كمجموعة من البقع داء الاخضرار التي تتراوح في اللون من الأبيض إلى الأخضر الشاحب. قابلية مجموعة مصنع لسوس العنكبوت الحيوانات العاشبة تم تقييم سابقا إما بشكل غير مباشر من خلال تحليل أداء سوس العنكبوت أيام آخر الإصابة، 18،19، أو مباشرة باستخدام التشكل الإجمالي من النباتات أسابيع بعد الإصابة 18 أو باستخدام التصوير الرقمي من الأوراق المكشوفة لالعث لعدة أيام لاحقة مع تحليل الصور الآلي 19. ويجري تطوير هذه الأساليب وتستخدم لدراسات التفاعلات بين نباتات الطماطم وT. urticae، والتي تستخدم عادة أعداد صغيرة من العناكب (5-15 في العلاج) التي تم جمعها من السكان سوس المختلطة ووضعت على سطح الورقة باستخدام فرشاة ناعمة. ومع ذلك، وهذه الأساليب ليست مناسبة للدراسات التي يحتاج فيها أعداد أكبر من العث ليتم تطبيقها. بالإضافة إلى ذلك، في حين أن معالجة مباشرة لأوراق الصور في برنامج تحليل الصورمثل أدوبي فوتوشوب (سان خوسيه، كاليفورنيا) أو يماغيج 20 يمكن استخدامها لتحليل الضرر الطماطم، وهذه البروتوكولات تحتاج إلى تعديل من أجل تطبيقها على الأوراق التي لديها أكبر انعكاسية السطح أو ملونة خفيفة ولها التريكوم واضح للغاية ( على سبيل المثال، A. thaliana) التي تتداخل مع اختيار الآلية من البقع التي تميز داء الاخضرار الضرر النبات. وعلاوة على ذلك، فإن المرحلة التنموية من العناكب التي يمكن استخدامها بسهولة مع الطرق السابقة يقتصر على الإناث الأكثر انتشارا والتي يسهل التعرف عليها الكبار ويحول دون الاستفادة من مراحل النمو الأخرى.
الخطوة الحاسمة الأولى نحو تحليل الإنتاجية العالية من النبات العنكبوت سوس التفاعل هو وضع بروتوكولات استنساخه وبسيطة وقوية لتحدي النباتات مع العناكب وموثوق تقييم نتائج التفاعل.
في هذا الفيديو، وسيلة فعالة لجمع سريعة وسهلة من الأسطوانات الكبيرةالبر من العث الإناث الكبار، موصوفة تطبيقها على المضيف محطة تجريبية، وتقييم الأضرار النباتية بسبب التغذية العنكبوت سوس. بروتوكول قدمت يتيح جمع سريعة وفعالة من مئات الأفراد في أي مرحلة التطوير (بيض، يرقات، الحوريات، الذكور البالغين، وإناث) التي يمكن استخدامها لتطبيق التجارب اللاحقة. بالإضافة إلى ذلك، هذه البروتوكولات يمكن تطبيقها على أي نبات المضيف سوس، ولكن أثبتت تحديدا في حالة A. thaliana.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. صيانة العنكبوت سوس السكان
ملاحظة: يتم تربيتها العث العنكبوت في كاليفورنيا الفاصوليا الحمراء (فاصيلوس الشائع).
- تنمو نباتات الفول من البذور لمدة 2-3 أسابيع قبل الإصابة.
- إختلط هذه النباتات مع النباتات المصابة؛ والعث الكبار استعمار بسرعة المواد النباتية الطازجة.
- إزالة نباتات الفول المصابة القديمة كل 7-10 أيام، والاستعاضة عنها بالنباتات الطازجة.
2. جمع الكبار أنثى العث
- سوس كوكتيل باستخدام طريقة الغسل
- لجمع العث، ضع نبات الفاصوليا الطازجة في اتصال مع النباتات المصابة 1-2 أيام قبل التجربة.
- استخدام 20-30 نباتات الفول جديدة لجمع 1،000 إلى 2،000 العث الكبار من الإناث.
- تحضير محلول توين 20 في 0.001٪ باستخدام مياه الصنبور في RT.
- غسل نباتات الفول المصابة في محلول توين 20، وذلك باستخدام 2 إلى 3 محطات في كل مرة.
- خطوة كاملة في غضون 10 دقيقة 2.1.4 لتجنب وفيات سوس.
- عزل الكبار أنثى العث التي كتبها الترشيح للتعليق سوس من خلال شبكة من المناخل معرفة الحجم
- إعداد المناخل من أحجام شبكة التالية: 500 ميكرومتر (لإزالة الحطام) و 300 ميكرومتر (لجمع العث الكبار الإناث) (الشكل 1A).
- تحديد تعليق من خلال ميكرون غربال 500.
- يعيد الترشيح تعليق من خلال غربال 300 ميكرون. سيتم الاحتفاظ العث الإناث البالغات.
- تراجع منخل 300 ميكرون مع العث الإناث الكبار في مياه الصنبور نظيفة لإزالة توين 20.
- تنتشر العث في طبقة واحدة في الجزء السفلي من الغربال.
- استخدام منشفة ورقية لإزالة المياه الزائدة من شبكة والجانبين من غربال. ملاحظة: يتم ذلك لأن العث بحاجة لتجف بسرعة من أجل التعافي.
- إعداد التجمع كما هو مبين في الشكل 1باء؛ وهذا سوف يسمح العث للتحرك بحرية، ولكن منعهم من الهرب.
- وضع غربال مع العث على رأس المنخل الذي يستخدم كوسيلة لدعم.
- تحيط غربال السفلي مع الماء لمنع العث من تشتيت. ملاحظة: سوف يبدأ في التعافي بعد العث حوالي 5 دقائق. بعد ما يقرب من 30 دقيقة، وعدد من العث تتحرك كافية لبدء جمع (1D الشكل). وينبغي جمع العث في حدود 1 ساعة، لأنها تنتج الحرير التي من شأنها أن تتداخل مع المجموعة.
3. مصنع الإصابة مع العث
ملاحظة: بمجرد أن تعافى العث الإناث البالغين، ويمكن استخدامها لغزو النبات. هناك 2 الأساليب المستخدمة لتصيب النباتات التجريبية مع العث الإناث الكبار: أ) باستخدام فرشاة غرامة (القسم بروتوكول 3.1) وب) باستخدام مضخة فراغ أو خط (القسم بروتوكول 3.2).
- سوس الإصابة باستخدام فرشاة
ملاحظة: العنكبوت سوس الإصابةمع ويستخدم فرشاة لتطبيق ما يصل إلى 30 العث في النبات.- استخدام فرشاة مستديرة لينة الشعر فن حجم 00 أو الدقيقة.
- تبلل الفرشاة مع RT ماء الصنبور.
- اختيار بلطف صعودا العث من غربال باستخدام رأس الفرشاة ونقلها إلى المصنع.
- سوس الإصابة باستخدام مضخة
ملاحظة: يتم استخدام النبات الإصابة مع العث التي جمعتها خط مضخة / فراغ عندما يتم تطبيق أكثر من 30 العث. لهذا الأسلوب، ومضخة فراغ لمكونات الدقيقة لاقط أو خط فراغ يمكن استخدامها. فمن المهم للحفاظ على تدفق الهواء المستمر وقوة كافية (2-4 رطل).- إرفاق ماصة 1 مل إلى الأنبوب الذي يربط لمضخة فراغ أو خط باستخدام قطع 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي في أسفل كما محول بين أنبوب مضخة / فراغ وغيض.
- وضع قطعة من منشفة ورقية بين طرف ماصة ومحول (1.5 مل أنبوب الطرد المركزي). ملاحظة: الغرض من هذا هو فخ العث داخل رانه غيض ماصة أثناء عملية الشفط وكذلك للحد من تدفق الهواء (الشكل 1C).
- جمع العث مباشرة من غربال استخدام غيض ماصة.
- بدلا من ذلك، جمع العث واحدا تلو الآخر من الأوراق المصابة باستخدام المجسام.
- عندما تم جمع العدد المطلوب من العث، وإزالة غيض ماصة من أنبوب، والتأكد من أن قطعة من منشفة ورقية في الجزء الخلفي من غيض ماصة ودون عائق.
- جمع العث من خلال الاستفادة من غيض ماصة والتثاقل العث معا. ثم، ووضعها على ورقة؛ في غضون ثوان، وسوف تبدأ العث لتفريق على ورقة.
4. تسجيل وتقييم الأضرار النباتية
- تسجيل الأضرار النباتية
ملاحظة: للحصول A. thaliana، يتم تقييم الضرر المصنع بعد 4 أيام من التغذية سوس. وسجلت الضرر كما المساحة الإجمالية من البقع داء الاخضرار. لقياس الضرر، هو قطع كامل ريدة ومسحها ضوئيا.المعلمات المسح الضوئي وصفها هي لV30 الماسح الضوئي إبسون ولكن سوف يكون بمثابة نقطة انطلاق جيدة لأي الماسحة الضوئية المسطحة مماثلة. إبقاء معلمات المسح المستمر لجميع التجارب السماح المقارنة بين أشواط التجربة الفردية.- تغطية السرير الماسح الضوئي مع ورقة الشفافية لمنع تلوث سطح الماسح الضوئي مع المواد النباتية.
- قطع وريدة كامل ومكان على السرير الماسح الضوئي بحيث متجه نحو المحور (العلوي) جانب من الأوراق تواجه مصدر الضوء الماسح الضوئي والتقاط العنصر. بدلا من ذلك، إذا ريدات هي كثيفة جدا لالتقاط أوراق الفردية دون تداخل، تشريح ريدة في الأوراق أو مجموعات من الأوراق غير متداخلة مع مقص غرامة الفردية قبل وضع على السرير الماسح الضوئي. يمكن مسحها ريدات متعددة في نفس الوقت.
- تغطية ريدات أو الأوراق مع قطعة من الورق الأبيض لمنع الالتزام وتلوث غطاء الماسح الضوئي.
- وثيقة غطاء الماسح الضوئي وإجراء فحص مع المعلمات التالية: القرار: 1،200 نقطة في البوصة؛ وضع اللون: أدوبي RGB؛ سطوع: +25؛ نوع الملف: JPEG الحد الأقصى الجودة.
- حفظ ملفات الصور لتحليل الأضرار اللاحقة.
- الأضرار محطة الكمي
ملاحظة: يتم احتساب مساحة الضرر يدويا باستخدام فوتوشوب. بسبب اختلافات كبيرة في شكل ورقة وكثافة اللون من الأعراض نتيجة لتغذية سوس، وبالطريقة الآلية لا يمكن الاعتماد عليها. وبالتالي، يتم استخدام طريقة شبكة لتقييم الضرر النبات:- فتح الصورة من المصنع مع فوتوشوب.
- خلق طبقة جديدة، ثم تراكب الصور الممسوحة ضوئيا مع شبكة من 0.25 مم × 0.25 مم الانقسامات (عرض أو العرض - عرض - الشبكة، اختصار لوحة المفاتيح على Ctrl + ').
- على طبقة مضافين، بمناسبة المناطق أوراق التالفة باستخدام نقطة (استخدام "أداة قلم رصاص"، اختصار لوحة المفاتيح B). استخدام نقطة واحدة واحدة لكل مربع من الشبكة أدناه والتي كان هناك ضرر تغطي أكثر من نصف وحدة الشبكة. ويعرف حجم نقطة بالبكسل (أي،
- عندما يتم وضع علامة على كافة الساحات من الشبكة التي تظهر الضرر مصنع تغطي ما لا يقل عن نصف وحدة الشبكة مع نقطة، استخدم أداة الرسم البياني (نافذة - الرسم البياني) لتحديد العدد الإجمالي للبكسل على طبقة. يسمح أداة الرسم البياني واحد لقياس عدد وحدات البكسل. لأن كل نقطة يمثله عدد ثابت ومعروف من بكسل، ستقوم الأداة الرسم البياني قياس عدد وحدات البكسل، التي تمثل العدد الإجمالي من النقاط، وبالتبعية، فإن العدد الإجمالي من المربعات ملحوظ.
- حساب عدد "النقاط" التي تميزت باستخدام الصيغة:
عدد النقاط = مجموع عدد بكسل / عدد بكسل لكل نقطة. - حساب المساحة الإجمالية للضرر عن طريق ضرب عدد من النقاط ملحوظ على الصورة التي مساحتها 1 متر مربع من الشبكة، كما يتوافق نقطة واحدة إلى المربع رقم واحد من الشبكة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام 20-30 نباتات الفول المصابة، يمكن للمرء أن جمع حوالي 2،000 العث الكبار الإناث باستخدام المناخل. الوقت اللازم لتصيب النباتات مع 10 20 العث في النبات ما يقرب من 15 دقيقة في حالة استخدام فرشاة لنقل العث. وتظهر مجموعات من أساليب جمع والتطبيق في الشكل 2.
هذا البروتوكول يولد نتائج استنساخه من الضرر النبات، مما يدل على أن العث التي يتم جمعها من الحالة الفسيولوجية مماثلة ومناسبة للدراسات النبات العنكبوت التفاعل سوس (الشكل 3 أ). لتقييم بروتوكول استنساخ، جمعت العث الإناث الكبار باستخدام طريقة الغسيل حيث وضعت 20 العث على أوراق ريدة من 3 أسابيع القديمة A. النباتات thaliana (الانضمام العقيد-0) بفرشاة مبللة. وكان كميا تم مسحها النباتات المعاملة 4 أيام postinfestation ومساحة الضرر باستخدام الأساليب المذكورة أعلاه. وقد تم مقارنة نتائج التجربة المتكررة باستخدام أنوفا.
كمثال على تطبيق التجريبي، قمنا بتقييم التغير الطبيعي في القابلية للالعنكبوت سوس الحيوانات العاشبة عبر 3 A. thaliana الانضمام من خلال تطبيق 20 العناكب الإناث في النبات باستخدام فرشاة مبللة والضرر تسجيل 4 أيام آخر الإصابة. ويظهر مظهر نموذجي من الضرر في الصور الممسوحة ضوئيا في الشكل 3B. بعد ذلك، القياس الكمي للبيانات الضرر يمكن تقديم مثل رسم بياني شريطي أو boxplot وتحليلها بواسطة الأسلوب الإحصائي لاختيار (الشكل 3C). في هذا المثال، يليه أنوفا بواسطة اختبار توكي HSD استخدمت لتحليل البيانات.
تعيين الرقم 1. التجريبية يصل لعزل العث الإناث البالغات. (أ) مجموعة من المناخل للسماح لفصل مختلف التنموية العنكبوت سوسمراحل. (أ. 0.5 ملم حجم الافتتاح - يزيل الحطام من سوس التعليق ب 0.3 ملم - يجمع العث الإناث البالغات 0.2 ملم ج - تجمع الشابات، ذكور، والحوريات د 0.16 مم - بجمع اليرقات والحوريات ه. 0.1 ملم - يجمع البيض) (B) إعداد تستخدم للسماح لاسترداد العث دون الهروب بعد الغسيل والتصفية (C) الإعداد المستخدمة في جمع العث باستخدام مضخة (D) المنخل مع تحريك العث الكبار الإناث جاهزة للجمع.
الشكل 2. الاستراتيجيات الممكنة لعزل العث الإناث البالغين، وفقا لعدد من العث لتطبيق. إذا كان التصميم التجريبي يتطلب استخدام عدد كبير من الكبار العناكب الإناث، والنهج الأكثر فعالية هو استخدام طريقة جمع مضخة فراغ مباشرة من أوراق الفول.إذا يتطلب تجربة استخدام المرحلة التنموية الأخرى من الإناث البالغات أو عدد قليل من الأفراد بحاجة إلى أن توضع بعناية على النباتات الشابة، فمن المستحسن لأداء مجموعة وتجزئة من مراحل تطور العنكبوت سوس مع اقتراب الغسيل باستخدام المناخل تليها الإصابة مع فرشاة.
الرقم 3. ممثل النتائج. (أ) القدرة على التكاثر من النتائج التجريبية. منطقة الضرر يقاس على 3 الاسبوع القديمة A. النباتات thaliana، الانضمام العقيد-0 بعد 4 أيام من تطبيق 20 العناكب الإناث. وقد تم مقارنة نتائج التجربة المتكررة باستخدام أنوفا (ن = 6، F = 0.621، P = 0.735). (B و C) الاختلاف الطبيعي في القابلية للالعنكبوت سوس الحيوانات العاشبة عبر 3الانضمام A. thaliana: العقيد-0، لير-0، وWS2 (B) المظهر النباتات بعد العنكبوت سوس الحيوانات العاشبة. تشير الأسهم الحمراء نحو المناطق المتضررة نموذجية. (C) الاختلافات في القابلية للالعنكبوت سوس الحيوانات العاشبة وفقا لتقييم مجال الضرر. القابلية للالعنكبوت سوس الحيوانات العاشبة يختلف اختلافا كبيرا عبر الانضمام (أنوفا، ن = 6، F = 13.4، P = 0.0004). رسائل تشير إلى فروق ذات دلالة إحصائية بين التراكيب الوراثية في P <0.05 (توكي HSD اختبار). القيم هي ± رسوم بيانية يعني الخطأ المعياري للمتوسط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا الفيديو يوضح البروتوكولات المستخدمة لعزل وتصيب النباتات مع أعداد كبيرة من العث الإناث البالغات. على الرغم من أننا قدم هذا البروتوكول باستخدام A. thaliana، ويمكن استخدامها لأي النبات العنكبوت نظام التفاعل سوس ويجري حاليا تطبيقه بنجاح أيضا على نباتات الطماطم والعنب (كرمة العنب الاوروبي). غلة بروتوكول النتائج استنساخه، مشيرا إلى أن العث التي يتم جمعها من الحالة الفسيولوجية للمقارنة (الشكل 3).
في حين أن هذه البروتوكولات هي بسيطة لتنفيذ، تتطلب العديد من الخطوات الحاسمة اهتماما خاصا لأنها سوف تؤثر على الانتعاش سوس. يجب أن يتم غسل العث من الأوراق على ما يصل إلى ثلاثة نباتات الفول في وقت واحد، ولها أن تكتمل في غضون 10 دقيقة باستخدام الماء في RT. بالإضافة إلى ذلك، لا بد من العث تنتشر على غربال لتجفيف السريع. إذا سوس الانتعاش غير مرضية، فمن المهم للتحقق ما إذا كان لنا الكمية الموصى بها من المنظفات توين 20إد وإذا تمت إزالة المنظفات بالكامل خلال الخطوة الشطف.
هناك نوعان من القيود الرئيسية لبروتوكول المعروضة: أ) جمع سوس بواسطة مضخة تعمل بشكل جيد لمجموعات من أكثر من 30 العث ولكن جمع من عدد أصغر من العث يتطلب استخدام الفرشاة وبطيئة نسبيا؛ ومع ذلك، وجمع وتركيز العث الكبار من خلال طريقة الغسيل يسهل كثيرا تطبيقها؛ ب) تحليل الضرر من خلال سجل سطح البقع داء الاخضرار يمكن أن يكون وقتا وجهدا طويلا خطوة؛ وينبغي بذل جهد المستقبل يكمن في تحديد الجينات علامة التي يمكن استخدامها كمقياس للتغذية سوس.
مقارنة منهجيات نشرت سابقا الطريقة المعروضة من جمع العنكبوت سوس، ويوفر ميزة من جمع أعداد كبيرة من الأفراد قابلة للحياة وفصل كفاءة من مراحل النمو في خطوة واحدة. بالإضافة إلى ذلك، تقييم الأضرار محطة النمط الظاهري في التفاعل النبات للآفات من خلال inspecti البصريةأو تحليل الصور الرقمية هو عادة الخطوة الأولى في التحليل المعقدة التي تنطوي على شكل من أشكال الجزيئية للقراءة من (مثل تحليل التعبير الجيني أو التنميط المستقلب). البروتوكولات الحالية هي مناسبة لتطبيق عدد قليل من العث ومجموعة من المواد آخر أيام الإصابة التي هي قيمة لتحليل التفاعلات طويلة الأجل بين النبات والآفات؛ ومع ذلك، هذا البروتوكول تمكن واحد لتطبيق المئات من العث في وقت واحد لالتقاط بفعالية الاستجابات النباتية التي تحدث أثناء فترة أقصر من الوقت (ساعة) في موقع والتغذية.
باختصار، وقد وصفت وسائل لتطبيق العث الكبار الإناث على النباتات المضيفة وتقييم الضرر النبات. هذه البروتوكولات هي ضرورية للتجارب تهدف إلى فهم الأساس الجيني والجزيئي من التفاعل بين النباتات وسوس العنكبوت رصدت اثنين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plant material: | |||
| California red kidney bean | Stokes, Thorold, ON, Canada | 2 week old, well infested with spider mites 2 or 3 days before use. Other cultivars of Phaseolus vulgaris can be used. | |
| Chemicals: | |||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 1% stock solution is prepared to simplify aliquoting |
| Tap water | At room temperature, heat- and cold-shock affect mite survival rate and performance | ||
| Other materials and equipment: | |||
| Plastic tray | |||
| Set of scissors | |||
| 2 L beakers | |||
| Paper towels | |||
| Sets of sieves | Manufactured in house | Detailed instructions are available | |
| Thin brush | |||
| Pipettes | |||
| Pipette tips | 0.2 and 1 ml | ||
| 1.5 ml centrifuge tubes | |||
| Air pump | Aquarium type pump with inverted air flow. Vacuum line can be used. Required pressure drop is approx. 2-4 psi | ||
| Stereoscope | |||
| Scanner | Epson | V30 | Any flatbed scanner allowing necessary degree of control over scan quality. We use Epson V30 for our experiments. |
| Computer | Windows or OS X PC which is compatible with scanner hardware and Adobe Photoshop software. | ||
| Adobe Photoshop software | Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA | various | Any version with Histogram tool included. |
References
- Jeppson, L. R., Keifer, H. H., Baker, E. W. Mites injurious to economic plants. , University of California Press. (1975).
- Migeon, A., Dorkeld, F. Spider Mites Web: a comprehensive database for the Tetranychidae. http://www.montpellier.inra.fr/CBGP/spmweb. , (2013).
- Croft, B. A., Vandebaan, H. E. Ecological and Genetic-Factors Influencing Evolution of Pesticide Resistance in Tetranychid and Phytoseiid Mites. Exp Appl Acarol. 4, 277-300 (1988).
- Van Leeuwen, T., et al. Mitochondrial heteroplasmy and the evolution of insecticide resistance: Non-Mendelian inheritance in action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 5980-5985 (2008).
- Van Leeuwen, T., Vontas, J., Tsagkarakou, A., Dermauw, W., Tirry, L. Acaricide resistance mechanisms in the two-spotted spider mite Tetranychus urticae and other important Acari: A review. Insect Biochem Molec. 40, 563-572 (2010).
- Dermauw, W., et al. The cys-loop ligand-gated ion channel gene family of Tetranychus urticae: Implications for acaricide toxicology and a novel mutation associated with abamectin resistance. Insect Biochem Molec. 42, 455-465 (2012).
- Van Leeuwen, T., et al. Population bulk segregant mapping uncovers resistance mutations and the mode of action of a chitin synthesis inhibitor in arthropods. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4407-4412 (2012).
- Dearden, P. K., Donly, C., Grbic, M. Expression of pair-rule gene homologues in a chelicerate: early patterning of the two-spotted spider mite Tetranychus urticae. Development. 129, 5461-5472 (2002).
- Khila, A., Grbic, M. Gene silencing in the spider mite Tetranychus urticae: dsRNA and siRNA parental silencing of the Distal-less gene. Development genes and evolution. 217, 241-251 (2007).
- Grbic, M., et al. Mity model: Tetranychus urticae, a candidate for chelicerate model organism. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 29, 489-496 (2007).
- Grbic, M., et al. The genome of Tetranychus urticae reveals herbivorous pest adaptations. Nature. 479, 487-492 (2011).
- Kliebenstein, D., Pedersen, D., Barker, B., Mitchell-Olds, T. Comparative analysis of quantitative trait loci controlling glucosinolates, myrosinase and insect resistance in Arabidopsis thaliana. Genetics. 161, 325-332 (2002).
- Abe, H., et al. Function of jasmonate in response and tolerance of Arabidopsis to thrip feeding. Plant & cell physiology. 49, 68-80 (2008).
- Whiteman, N. K., et al. Mining the plant-herbivore interface with a leafmining Drosophila of Arabidopsis. Molecular ecology. 20, 995-1014 (2011).
- Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4674-4677 (2012).
- Kim, J. H., Lee, B. W., Schroeder, F. C., Jander, G. Identification of indole glucosinolate breakdown products with antifeedant effects on Myzus persicae (green peach aphid). The Plant journal : for cell and molecular biology. 54, 1015-1026 (2008).
- Adio, A. M., et al. Biosynthesis and defensive function of Ndelta-acetylornithine, a jasmonate-induced Arabidopsis metabolite. Plant Cell. 23, 3303-3318 (2011).
- Li, L., et al. The tomato homolog of CORONATINE-INSENSITIVE1 is required for the maternal control of seed maturation, jasmonate-signaled defense responses, and glandular trichome development. Plant Cell. 16, 126-143 (2004).
- Kant, M. R., Ament, K., Sabelis, M. W., Haring, M. A., Schuurink, R. C. Differential timing of spider mite-induced direct and indirect defenses in tomato plants. Plant Physiol. 135, 483-495 (2004).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
