Summary
Örümcek akarları, deney bitkilerin istilası ve bitki hasar değerlendirme homojen numune etkili hazırlanması için protokoller, bitki-zararlı etkileşim çalışmaları için gerekli olan geliştirilmiştir.
Abstract
Iki benekli örümcek, Tetranychus urticae, ekonomik değeri 150'den fazla olan türlerin derece geniş bir dizi, beslenen bir yerde polifag Eklembacaklıların otobur olduğunu. Bu, özellikle Solanaceae ve Cucurbitaceae mısır, pamuk gibi (örneğin, domates, patlıcan, biber, salatalık, kabak) ve sera süs bitkileri (örneğin, gül, krizantem, karanfil), yıllık tarla bitkileri (içinde, sera bitkileri önemli bir zararlı olduğunu soya, şeker pancarı), ve çok yıllık kültürler (yonca, çilek, üzüm, narenciye, ve erik) 1,2. Önemli bir tarımsal böcek, T. yapan uç polyphagy ek olarak, urticae, kontrolü 3-7 için kullanılan insektisit ve akarisit geniş bir yelpazeye karşı direnç geliştirmek için bir eğilim vardır.
T. urticae o (27 ° C'de 7 gün) hızlı bir yaşam döngüsüne sahip olarak, mükemmel bir deneysel organizmadırve kolay bir şekilde, laboratuarda, yüksek yoğunlukta muhafaza edilebilir. (In situ hibridizasyon ve antikor lekelemesi de dahil) gen ekspresyonunu analiz etmek için ve RNA girişimi kullanılarak örümcek kenesi, endojen genlerin ekspresyonunu etkisiz hale getirmek için yöntemler 8-10 geliştirilmiştir. Son zamanlarda, T. bütün genom sekansı, urticae zaten konukçu bitkiler (Arabidopsis thaliana ve domates Solanum lycopersicum) 11 bazı mevcut eşdeğer genomik kaynaklara sahip bir model organizma olarak bu haşere otobur geliştirmek için bir fırsat yaratma, rapor edilmiştir. Birlikte, bu model organizmalar bitki-böcek etkileşimleri moleküler üsleri içgörüler sağlayabilir.
Burada, hızlı ve kolay bir yetişkin dişi kene, çok sayıda toplama, deneysel bitki ev sahibi üzerindeki uygulama ve nedeniyle örümcek akarı beslenme için bitki hasar değerlendirmesi için etkili bir yöntem tarif edilmiştir. Tr sunulan protokoldaha sonra deney uygulama için kullanılabilecek herhangi bir gelişim aşamasında (yumurta, larva, kurtçuklar, yetişkin erkek ve kadın) bireyler yüzlerce hızlı ve etkin bir toplama ables.
Introduction
Bitki-böcek etkileşimi büyük bilimsel ve ekonomik öneme sahip bir konudur. Bu tarihsel (örneğin domates gibi) hem de bitki ve bitki modeli, A. kullanılarak incelendi thaliana. Her iki durumda da, otobur için bitki duyarlılık otobur saldırı sonrasında ya da dolaylı zararlı performans değerlendirmesi yoluyla doğrudan bitki fenotip değerlendirilmesi yoluyla ölçülebilir.
Bitki duyarlılık doğrudan ölçümleri çeşitli yöntemler kullanılarak böcek pest türlerin bir dizi için daha önce kullanılmıştır. Örneğin, lepidopteran larvaların herbivory bir ızgara 12 yardımıyla, çıplak göz ile Plutella xylostella (diamondback moth) veya Trichoplusia ni (Lahana kurdu) tarafından tüketilen ya da bitki dokusunun bir bölümünün bir tahmin olarak ölçülür. Ayrıca, daha sonra kantitatif görüntü analizi ile yaprak hasarı dijital görüntüleme kullanan yöntem vardır. Bu yöntemler kullanılmıştırA. çalışmaları Frankliniella occidentalis (batı çiçek bitleri) 13, Scaptomyza flava (yaprak-madencilik Drosophila) 14 ve T. ile thaliana'nın etkileşim ni 15.
Bitki duyarlılık dolaylı ölçümleri yaygın bitki-böcek etkileşimi çalışmalarında kullanılmaktadır. A. Örnek olarak, duyarlılık herbivory persicae yaprak biti Myzus şeftali thaliana'nın genellikle haşere doğurgan ve etkileşim 16,17 sonra bitkinin brüt morfolojisi açıklaması analizi ile değerlendirilir. A. başka tipik dolaylı gösterge Bir haşereye thalianadan duyarlılık otçulun kuru veya ıslak ağırlık değerlendirmedir. Bu parametre genellikle böyle Pieris rapae (küçük beyaz), P. gibi lepidoterans arasında herbivory, karakterize etmek için kullanılır xylostella, veya T. onların larva veya pupa da ni 15,17 aşamaları.
Örümcek akarları hücre içeriğini fe vardıreders. Mite kaynaklı hasar soluk yeşil rengi beyazdan aralığı klorotik noktalar topluluğu olarak kabul edilmektedir. Örümcek akarı herbivory bir bitki konakçının duyarlılığı önceden örümcek akarı performans günlerin analizi yoluyla dolaylı olarak değerlendirildi sonrası istila 18,19, ya da doğrudan bitkiler hafta sonrası istilası 18 brüt morfolojisini kullanarak veya maruz kalan yaprakların bir dijital görüntüleme kullanarak sonraki otomatik görüntü analizi 19 gün boyunca akarları için. Bu yöntemler geliştirilmiş ve domates bitki ve T. arasındaki etkileşimleri çalışmaları için kullanılmaya başlandı urticae, ve tipik olarak karma akar popülasyonundan toplandı ve yumuşak bir fırça ile yaprak yüzeyine yerleştirildi örümcek akarlarının az sayıda (tedavi başına 5-15) kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu yöntemler, akarların daha fazla sayıda uygulanması gereken çalışmalar için uygun değildir. Buna ek olarak, yaprak ise görüntülerin doğrudan işleme resim analiz yazılımıAdobe Photoshop (San Jose, CA) veya ImageJ 20 domates hasar analizi için kullanılabilen gibi, bu protokol yüzeyinin daha büyük bir yansıtma yapabilirliği vardır veya açık renkli ve yüksek görünür trikomlar, var (yapraklara uygulanması için değişiklik ihtiyacı bitki hasar işaretlemek klorotik noktalar otomatik seçim ile müdahale, örneğin, A. thaliana). Bundan başka, hali hazırda önceki yöntemlerle kullanılabilir örümcek akarlarının gelişim aşamasında, en yaygın ve kolayca tanımlanabilir yetişkin kadın sınırlı değildir ve diğer gelişim aşamaları kullanımını önleyen edilir.
Bitki örümcek akarı etkileşimi yüksek verimlilik analizi doğru ilk kritik adım örümcek akarları ile bitkiler meydan ve güvenilir bir etkileşim sonuçlarını değerlendirmek için tekrarlanabilir, basit ve sağlam protokoller kurmaktır.
Bu video, büyük bir num hızlı ve kolay toplanması için etkin bir yöntem olarakber yetişkin dişi akarlar, bir deney tesisi ana ve bağlı örümcek akarı beslenmeye bitki zarar değerlendirilmesine ilişkin uygulama açıklanmıştır. Sunulan protokol takip eden deney uygulama için kullanılabilecek herhangi bir gelişim aşamasında (yumurta, larva, kurtçuklar, yetişkin erkek ve kadın) bireyler yüzlerce hızlı ve etkin bir toplama sağlar. Buna ek olarak, bu protokoller bir akarı ana bitkiye uygulanabilir, ama özellikle A. durumunda gösterilmektedir thaliana.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Örümcek Mite Nüfus 1. Bakım
NOT: Örümcek akarları (Phaseolus vulgaris) Kaliforniya kırmızı barbunya fasulye yetiştirilir.
- Önce istilası 2-3 hafta süreyle tohum fasulye bitkileri büyütün.
- Istila bitkilerle Intermix bu bitkiler; Yetişkin akarlar hızla taze bitki materyali kolonize edecek.
- Taze bitkiler ile bunların yerine, her 7-10 gün eski musallat fasulye bitkileri sökün.
2.. Yetişkin Kadın Akarlar Toplama
- Yıkama Yöntemi kullanılarak Koleksiyon mite
- Akarları toplamak için, 1-2 gün önce deney enfekte bitkiler ile temas halinde olan bir taze fasulye bitki yer.
- 1,000 2,000 yetişkin dişi akarları toplamak için 20 ila 30 taze fasulye bitkileri kullanın.
- Oda sıcaklığında musluk suyu ile% 0.001 Tween 20 ihtiva eden bir çözelti hazırlayın.
- Her seferinde 2-3 bitkileri kullanarak, Tween 20 çözeltisi içinde istila edilmiş fasulye bitkileri yıkayın.
- Komple adım akarı ölümlerini önlemek için 10 dakika içinde 2.1.4.
- Tanımlı Mesh Boyutu Elek ile Mite Süspansiyon Filtrasyon ile Yetişkin Kadın Akarlar İzolasyonu
- Aşağıdaki örgü boyutları elekler hazırlayın: 500 mikron (enkaz kaldırmak için) ve 300 mikron (dişi yetişkin akarları toplamak için) (Şekil 1A).
- 500 um elekten süspansiyon filtre.
- 300 um elekten süspansiyon Refilter. Yetişkin dişi akarlar muhafaza edilecektir.
- Tween 20 kaldırmak için temiz musluk suyu, yetişkin dişi akarları ile 300 mikron elek batırın.
- Eleğin altındaki bir tek kat olarak akarlar yayıldı.
- Eleğin ağ gözü ve taraftan fazla suyu almak için kağıt havlu kullanın. NOT: akarları kurtarmak için hızla kurumasını gerekir, çünkü bu yapılır.
- Şekil 1 'de gösterildiği gibi bir montaj hazırlayınB; Bu akarlar serbestçe hareket sağlayacak, ama onları kaçmasını önleyecektir.
- Bir destek olarak kullanılan elek üstünde akarları elek yerleştirin.
- Dağılmasını akarları önlemek için su ile alt elek Surround. NOT: Akarlar sonra yaklaşık 5 dakika kurtarma başlayacak. Yaklaşık 30 dakika sonra, hareketli akar sayısı toplama (Şekil 1D) başlatmak için yeterlidir. Onlar koleksiyonu ile engel olacak ipek üretmek gibi Akarlar, 1 saat içinde alınmalıdır.
Akarlar ile 3. Bitki istila
NOT: Erişkin dişi kene iyileşti sonra, onlar bitki istilası için kullanılabilir. A) ince bir fırça (protokol bölüm 3.1) kullanılarak ve b) bir pompa veya vakum hattı (protokol bölüm 3.2) kullanılarak: Erişkin dişi kene ile deneysel bitkileri istila etmek için kullanılan 2 yöntem vardır.
- Bir fırça kullanarak Akar istila
NOT: Örümcek istilasıBir fırça bitki başına 30 kadar akar uygulanması için kullanılan ile.- Büyüklüğü 00 veya daha ince bir yumuşak saçlar yuvarlak sanat fırça kullanın.
- RT musluk suyu ile fırça ıslatın.
- Yavaşça fırça ucu kullanarak elekten akarları pick up ve tesisine aktaracaktır.
- Bir Pompa kullanarak Infestationu mite
NOT: 30'dan akarlar tatbik edildiğinde, bir pompa / vakum hattı ile toplanmıştır akarları ile bitki istilası kullanılır. Bu yöntem için, mikro-elektronik bileşenler alıcı veya bir vakum hattı için bir vakum pompası kullanılabilir. Bu hava akımı sabit ve yeterli mukavemet (2-4 psi) tutmak için önemlidir.- Pompa / vakum tüpü ile ucu arasında bir adaptör olarak altındaki bir 1.5 ml santrifüj tüpü kesme kullanılarak pompa ya da vakum hattına bağlayan bir tüpe 1 ml pipet takın.
- Pipet ve adaptörü (1.5 ml santrifüj tüpü) arasında kağıt havlu bir parça yerleştirin. Not: Bu amaçla t içine tuzak akarları içino aspirasyon işlemi sırasında pipet ucu ve aynı zamanda hava akımı (Şekil 1C) azaltmak için.
- Pipet kullanarak elekten doğrudan akarları toplayın.
- Seçenek olarak ise, bir Stereoskop kullanılarak Sirayet ettirilmiş yapraklardan akarları tek tek toplar.
- Akarların gerekli sayıda alındıktan sonra, pipet ucu arkasında kağıt havlu parçası rahatsız olduğundan emin olun, tüpten pipet çıkarın.
- Pipet dokunarak ve birlikte akarları kümeleyerek akarları toplayın. Daha sonra, yaprak üzerine koyun; saniye içinde, akarlar yaprak dağılmaya başlar.
4.. Kayıt ve değerlendirilmesi Bitki Hasar
- Kayıt Bitki Hasar
NOT: A için thaliana, bitki hasar akar besleme 4 gün sonra değerlendirilir. Hasar klorotik noktaların toplam yüzey alanı olarak kaydedilir. Hasar ölçümü için, tüm rozet kesilir ve taranır.Açıklanan tarama parametreleri Epson V30 tarayıcı için ancak benzer herhangi bir masaüstü tarayıcı için iyi bir başlangıç noktası olarak hareket edecektir. Sağlayan tüm deneyler için sabit tarama parametrelerini tutmak bireysel deneme seferleri arasında karşılaştırma.- Bitki materyali ile tarayıcı yüzeydeki önlemek için şeffaflık levha ile tarayıcı yatak örtün.
- Yani yaprakların adaxial (üst) taraf tarayıcı ışık kaynağı ve yakalama elemanı karşı karşıya tarayıcı yatağına bütün bir rozet ve yeri kesin. Alternatif olarak, rozet tarayıcı yatağa koymadan önce tek tek yaprakların veya ince makas ile örtüşmeyen yaprakları gruba rozet teşrih, örtüşme olmadan bireysel yaprakları yakalamak için çok yoğun eğer. Çoklu prizler aynı anda taranabilir.
- Bağlılık ve tarayıcı kapağının kirlenmesini önlemek için beyaz bir kağıt parçası ile rozet veya örtün.
- Yakın tarayıcı kapağı ve aşağıdaki parametreler ile bir tarama gerçekleştirin: Çözünürlük: 1,200 dpi; Renk modu: Adobe RGB; Parlaklık: +25; Dosya türü: maksimum kalite JPEG.
- Sonraki zarar analiz için görüntü dosyaları kaydedin.
- Bitki Hasar miktarının
NOT: hasar alan elle Photoshop kullanılarak hesaplanır. Nedeniyle akarı beslenme sonucu yaprak şekli ve semptomların renk yoğunluğundaki büyük farklılıklara bağlı olarak, otomatik yöntemler güvenilmez. Bu durumda, bir ızgara yöntem bitki hasarı değerlendirmek için kullanılır:- Photoshop ile bitkinin görüntü açın.
- (- Show - Izgara, klavye kısayolu Ctrl + 'görüntüleme veya Display), yeni bir katman oluşturun, sonra da 0.25 mm x 0.25 mm bölünmeleri bir ızgara ile taranan görüntüyü kaplayabilirsiniz.
- Kalıplı bir katmanda, bir nokta ("Kalem Aracı", klavye kısayolu B kullanımı) kullanarak hasarlı yaprak alanları işaretleyin. Izgara birimi birden fazla yarısını kapsayan bir hasar var olduğu aşağıdaki ızgaranın her bir kare için bir tek bir nokta kullanın. Nokta büyüklüğü (piksel tanımlanır, yani,
- Katmanda piksel sayısını belirlemek için - ızgara ünitesinin en az yarısını kaplayan bitki zarar göstermek ızgara tüm kareler bir nokta ile işaretli olduğunda, histogram aracı (Histogram Penceresi) kullanabilirsiniz. Histogram aracı, piksel sayısını ölçmek için bir izin verir. Her bir nokta piksel sabit ve belli bir sayı ile temsil edildiğinden, histogram aracı, uzantısı, noktaların toplam sayısını temsil eden toplam piksel sayısını ölçmek ve işaretlenmiş olan kareler toplam sayısı.
- Formül kullanılarak işaretlenen "nokta" sayısını hesaplayın:
Nokta sayısı = nokta başına piksel piksel sayısı / toplam sayısı. - Bir nokta ızgara bir kare karşılık olarak, ızgara 1 kare alanı ile görüntü üzerinde işaretlenen noktaların sayısını çarparak hasar toplam alanı hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
20 ile 30 musallat fasulye bitkileri kullanarak bir elekler kullanılarak yaklaşık 2.000 yetişkin dişi akarları toplayabilirsiniz. Keneden aktarmak için bir fırça kullanıyorsanız, bitki başına 20 akarları ile 10 bitkilerin istila için gerekli süre yaklaşık olarak 15 dk. Toplanması ve uygulama yöntemleri kombinasyonları, Şekil 2'de gösterilmiştir.
Bu protokol toplanan akarları benzer fizyolojik durumuna ve bitki örümcek akarı etkileşim çalışmaları için uygundur (Şekil 3 A) olduğunu gösteren, bitki zarar tekrarlanabilir sonuçlar üretir. Protokol tekrarlanabilirlik değerlendirmek için, yetişkin dişi kene 20 akarlar 3 haftalık A. rozet yapraklar üzerine yerleştirilmiştir yıkama yöntemi kullanılarak toplandı ıslak bir fırça ile thaliana'nın bitkiler (katılım Col-0). Muamele edilen bitkiler 4 gün tarandı postinfestation ve hasar alanı, yukarıda tarif edilen teknikler kullanılarak ölçülmüştür. Tekrarlanan deney sonuçlarının karşılaştırılması ANOVA kullanılarak yapıldı.
Deneysel bir uygulama örnek olarak, 3 A karşısında örümcek akarı herbivory duyarlılığındaki doğal varyasyon değerlendirildi ıslak bir fırça ve kayıt hasara 4 gün sonrası istilası kullanarak bitki başına 20 dişi örümcek akarları uygulaması ile thaliana'nın Bağlanma. Taranan görüntüler hasar tipik bir görünüm Şekil 3B'de gösterilmiştir. Daha sonra, hasar veri miktar, bir ya da bir çubuk grafik olarak sunulur Boxplot ve seçim istatistik metodu ile (Şekil 3C) ile analiz edilebilir. Bu örnekte, ANOVA veri analizi için kullanılmıştır Tukey HSD testi ile takip etti.
Şekil 1.. Deneysel yetişkin dişi akarların izolasyonu için ayarlayın. Farklı örümcek akarı gelişimsel ayrılmasına olanak sağlamak için elekler Seti (A)aşamaları. (A. 0.5 mm açılış boyutu - akar süspansiyon enkaz kaldırır b 0.3 mm -.. Erişkin dişi akarları toplayan c 0.2 mm -.. Genç kadın, erkek, ve perileri toplayan d 0.16 mm -.. Larva ve perileri toplayan e.. 0.1 mm -.. pompayı kullanarak akarları toplamak için kullanılan akarlar yıkama ve filtreleme sonra kaçan olmadan kurtarmak için izin vermek için kullanılan yumurta toplar) (B) Kurulum (C) Kurulum (D) Elek toplanacak hazır yetişkin dişi akarları hareketli..
Deneysel tasarım yetişkin dişi örümcek akarlar yüksek sayıda kullanımını gerektirir ise Şekil 2,. Uygulamak için akarlar sayısına göre yetişkin dişi kene izole etmek mümkün stratejileri., En etkili yaklaşım dolaysız olarak vakum pompası toplama yöntemini kullanmaktır fasulye yaprağı.Bir deneme yetişkin dişi ya da bireyler dikkatli bir şekilde daha küçük bitkiler üzerinde yerleştirilmesi gereken küçük bir sayı dışında bir gelişim aşamasında kullanımını gerektirir, bu ve ardından elekler kullanılarak yıkama yaklaşımla örümcek kenesi gelişim aşamalarında toplanması ve fraksiyonasyon yapılması önerilmektedir Bir fırça ile istilası.
Şekil 3,. Örnek sonuçlanır. Deneysel sonuç (A) Tekrarlanabilirlik. 3 haftalık A. ölçülen hasar alan thaliana bitkileri, katılım Col-0, 4 gün 20 dişi örümcek akarlarının uygulanmasından sonra. Tekrarlanan deney sonuçlarının karşılaştırılması ANOVA kullanılarak yapılan (n = 6, = 0,621 F, P = 0.735) oldu. 3 arasında örümcek akarı herbivory yatkınlık (B ve C) Doğal varyasyonA. thaliana katılmalar: Col-0, örümcek akarı herbivory sonra bitkilerin Ler-0 ve Ws2 (B) Görünüş.. Kırmızı oklar tipik hasar görmüş yerlerde işaret eder. Örümcek akarı herbivory duyarlılığındaki (C) farklar hasar alanı ile değerlendirildi. Örümcek akarı herbivory duyarlılık önemli ölçüde katılımlar karşısında (ANOVA, n = 6, F = 13.4, p = 0.0004) değişir. Mektuplar P <0.05 (Tukey HSD test) genotipler arasında önemli farklılıklar göstermektedir. Grafikle değerleri, ortalamanın ortalama ± standart hatası vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu video izole etmek ve yetişkin dişi kene, çok sayıda bitkileri istila için kullanılan protokoller gösterir. Biz A. kullanarak bu protokolü sunulmasına rağmen thaliana, herhangi bir bitki örümcek akarı etkileşim sistemi için kullanılabilir ve halen başarılı bir şekilde, domates ve üzüm (Vitis vinifera) bitkiler üzerinde de tatbik edilmektedir. Toplanan akar (Şekil 3) benzer fizyolojik durumu olduğuna işaret protokol verimleri tekrarlanabilir sonuçlar.
Bu protokoller gerçekleştirmek için basit olsa da akarı kurtarma etkileyecek gibi, pek çok kritik adımlar özel dikkat gerektirir. Yapraklarından yıkama akarlar aynı anda üç fasulye bitkileri üzerinde yapılır ve oda sıcaklığında su kullanılarak 10 dakika içinde tamamlanması gerekmektedir gerekir. Buna ek olarak, akar hızlı kurutma için bir elek üzerine yayılmış olması gerekir. Akarı kurtarma tatmin edici değilse, o Tween 20 deterjan önerilen miktarda bize olup olmadığını kontrol etmek önemlidired ve deterjan tam durulama aşaması esnasında çıkarıldı ise.
A) bir pompa ile akar toplama fazla 30 akar, ancak akarlar daha az sayıda toplanması bir fırça kullanılmasını gerektirmektedir ve nispeten yavaş koleksiyonları için iyi çalışır: yer alan protokol iki önemli sınırlamalar vardır Ancak, toplama ve yıkama yöntemi ile yetişkin akarları yoğunlaşarak büyük ölçüde onların uygulanmasını kolaylaştırır; b) klorotik noktalar yüzeyini puanlama yoluyla hasar analizi, zaman ve çaba harcayan bir adım olabilir; gelecek çaba akar besleme bir ölçüsü olarak kullanılabilir marker genleri tespit geçmelidir.
Daha önce yayınlanan yöntemler ile karşılaştırıldığında, örümcek kenesi toplama sunulan yöntem uygulanabilir bireyler ve tek bir adımda gelişim aşamalarının ayrılması etkin çok sayıda toplama bir avantaj sunar. Buna ek olarak, görsel Inspecti yoluyla bitki-böcek etkileşimi bitki hasar fenotip değerlendirmesiveya dijital görüntü analizi tipik olarak (örneğin, gen ekspresyon analizi ya da metabolit profil gibi) moleküler Okuması çeşit içeren karmaşık bir analizinin ilk adımdır. Mevcut protokolleri birkaç akar ve bitki ve zararlı arasında uzun süreli etkileşimlerinin analizi için değerlidir malzeme gün post-istilası toplama uygulama için uygundur; Bununla birlikte, bu protokol etkili bir zaman daha kısa bir süre (saat) boyunca ve besleme yerinde meydana bitki yanıtları yakalamak için aynı anda akarlar yüzlerce uygulamak için bir olanak sağlar.
Özet olarak, bir ev sahibi bitki ve bitki hasar değerlendirmesi ile ilgili yetişkin dişi akarlar tatbik edilmesi için yöntemler tarif edilmiştir. Bu protokoller, bitki ve iki benekli örümcek kenesi arasındaki etkileşimin moleküler genetik ve temel anlayışı amaçlayan deneyler için gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plant material: | |||
| California red kidney bean | Stokes, Thorold, ON, Canada | 2 week old, well infested with spider mites 2 or 3 days before use. Other cultivars of Phaseolus vulgaris can be used. | |
| Chemicals: | |||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 1% stock solution is prepared to simplify aliquoting |
| Tap water | At room temperature, heat- and cold-shock affect mite survival rate and performance | ||
| Other materials and equipment: | |||
| Plastic tray | |||
| Set of scissors | |||
| 2 L beakers | |||
| Paper towels | |||
| Sets of sieves | Manufactured in house | Detailed instructions are available | |
| Thin brush | |||
| Pipettes | |||
| Pipette tips | 0.2 and 1 ml | ||
| 1.5 ml centrifuge tubes | |||
| Air pump | Aquarium type pump with inverted air flow. Vacuum line can be used. Required pressure drop is approx. 2-4 psi | ||
| Stereoscope | |||
| Scanner | Epson | V30 | Any flatbed scanner allowing necessary degree of control over scan quality. We use Epson V30 for our experiments. |
| Computer | Windows or OS X PC which is compatible with scanner hardware and Adobe Photoshop software. | ||
| Adobe Photoshop software | Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA | various | Any version with Histogram tool included. |
References
- Jeppson, L. R., Keifer, H. H., Baker, E. W. Mites injurious to economic plants. , University of California Press. (1975).
- Migeon, A., Dorkeld, F. Spider Mites Web: a comprehensive database for the Tetranychidae. http://www.montpellier.inra.fr/CBGP/spmweb. , (2013).
- Croft, B. A., Vandebaan, H. E. Ecological and Genetic-Factors Influencing Evolution of Pesticide Resistance in Tetranychid and Phytoseiid Mites. Exp Appl Acarol. 4, 277-300 (1988).
- Van Leeuwen, T., et al. Mitochondrial heteroplasmy and the evolution of insecticide resistance: Non-Mendelian inheritance in action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 5980-5985 (2008).
- Van Leeuwen, T., Vontas, J., Tsagkarakou, A., Dermauw, W., Tirry, L. Acaricide resistance mechanisms in the two-spotted spider mite Tetranychus urticae and other important Acari: A review. Insect Biochem Molec. 40, 563-572 (2010).
- Dermauw, W., et al. The cys-loop ligand-gated ion channel gene family of Tetranychus urticae: Implications for acaricide toxicology and a novel mutation associated with abamectin resistance. Insect Biochem Molec. 42, 455-465 (2012).
- Van Leeuwen, T., et al. Population bulk segregant mapping uncovers resistance mutations and the mode of action of a chitin synthesis inhibitor in arthropods. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4407-4412 (2012).
- Dearden, P. K., Donly, C., Grbic, M. Expression of pair-rule gene homologues in a chelicerate: early patterning of the two-spotted spider mite Tetranychus urticae. Development. 129, 5461-5472 (2002).
- Khila, A., Grbic, M. Gene silencing in the spider mite Tetranychus urticae: dsRNA and siRNA parental silencing of the Distal-less gene. Development genes and evolution. 217, 241-251 (2007).
- Grbic, M., et al. Mity model: Tetranychus urticae, a candidate for chelicerate model organism. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 29, 489-496 (2007).
- Grbic, M., et al. The genome of Tetranychus urticae reveals herbivorous pest adaptations. Nature. 479, 487-492 (2011).
- Kliebenstein, D., Pedersen, D., Barker, B., Mitchell-Olds, T. Comparative analysis of quantitative trait loci controlling glucosinolates, myrosinase and insect resistance in Arabidopsis thaliana. Genetics. 161, 325-332 (2002).
- Abe, H., et al. Function of jasmonate in response and tolerance of Arabidopsis to thrip feeding. Plant & cell physiology. 49, 68-80 (2008).
- Whiteman, N. K., et al. Mining the plant-herbivore interface with a leafmining Drosophila of Arabidopsis. Molecular ecology. 20, 995-1014 (2011).
- Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4674-4677 (2012).
- Kim, J. H., Lee, B. W., Schroeder, F. C., Jander, G. Identification of indole glucosinolate breakdown products with antifeedant effects on Myzus persicae (green peach aphid). The Plant journal : for cell and molecular biology. 54, 1015-1026 (2008).
- Adio, A. M., et al. Biosynthesis and defensive function of Ndelta-acetylornithine, a jasmonate-induced Arabidopsis metabolite. Plant Cell. 23, 3303-3318 (2011).
- Li, L., et al. The tomato homolog of CORONATINE-INSENSITIVE1 is required for the maternal control of seed maturation, jasmonate-signaled defense responses, and glandular trichome development. Plant Cell. 16, 126-143 (2004).
- Kant, M. R., Ament, K., Sabelis, M. W., Haring, M. A., Schuurink, R. C. Differential timing of spider mite-induced direct and indirect defenses in tomato plants. Plant Physiol. 135, 483-495 (2004).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
