Summary
Protocolli per la preparazione efficiente di campioni omogenei di acari, infestazione di piante sperimentali, e la valutazione del danno dell'impianto, come richiesto per gli studi di interazione pianta-parassita sono stati sviluppati.
Abstract
Il ragnetto due maculato, Tetranychus urticae, è un onnipresente erbivoro artropode polifago che si nutre di una notevole vasta gamma di specie, con più di 150 di valore economico. Si tratta di un parassita importante di colture in serra, specialmente in Solanacee e Cucurbitacee (ad esempio, pomodori, melanzane, peperoni, cetrioli, zucchine) e ornamentali serra (ad esempio, rose, crisantemi, garofani), colture annuali di campo (come il mais, cotone, soia e barbabietola da zucchero), e in colture perenni (erba medica, fragole, uva, agrumi, e susine) 1,2. Oltre al polyphagy estremo che rende un importante parassiti agricoli, T. urticae ha una tendenza a sviluppare resistenza ad una vasta gamma di insetticidi e acaricidi che sono usati per il suo controllo 3-7.
T. urticae è un ottimo organismo sperimentale, in quanto ha un ciclo vitale rapido (7 giorni a 27 ° C)e può essere facilmente mantenuta ad alta densità in laboratorio. Metodi per saggiare l'espressione genica (compresi ibridazione in situ e colorazione degli anticorpi) e per inattivare l'espressione del ragnetto geni endogeni utilizzando RNA interference sono stati sviluppati 8-10. Recentemente, l'intera sequenza del genoma di T. urticae è stata riportata, creando l'opportunità di sviluppare questo parassita erbivoro come organismo modello con risorse genomiche equivalenti che già esistono in alcune delle sue piante ospiti (Arabidopsis thaliana e il pomodoro Solanum lycopersicum) 11. Insieme, questi organismi modello potrebbero fornire approfondimenti basi molecolari delle interazioni pianta-parassiti.
Qui, un metodo efficiente per la raccolta rapida e semplice di un gran numero di acari femmina adulta, la loro applicazione su un host impianto sperimentale, e la valutazione del danno pianta causa alimentazione ragnetto sono descritti. Il protocollo presentato enAbles raccolta veloce ed efficiente di centinaia di persone, in qualsiasi stadio di sviluppo (uova, larve, ninfe, maschi adulti e femmine) che può essere utilizzata per la successiva applicazione sperimentale.
Introduction
Interazione pianta-parassita è un argomento di grande importanza scientifica ed economica. È stato storicamente studiata utilizzando entrambe le piante coltivate (come pomodoro) e pianta modello, A. thaliana. In entrambi i casi, la suscettibilità della pianta erbivoro potrebbe essere misurata sia direttamente attraverso la valutazione degli impianti fenotipo dopo l'attacco di erbivori o indirettamente attraverso la valutazione delle prestazioni dei parassiti.
Misure dirette di pianta suscettibilità sono stati utilizzati precedentemente per un certo numero di specie di parassiti utilizzando una serie di metodi. Ad esempio, herbivory di larve di lepidotteri è misurato come una stima della porzione di tessuto vegetale consumata da uno Plutella xylostella (diamondback falena) o Trichoplusia ni (cavolo looper) ad occhio nudo con l'aiuto di una griglia 12. Inoltre, ci sono metodi che utilizzano l'imaging digitale di danni foglia con successiva analisi quantitativa delle immagini. Tali metodi sono stati usati instudi di A. interazione thaliana con Frankliniella occidentalis (tripidi fiore occidentali) 13, Scaptomyza flava (foglia-mining drosophila) 14, e T. ni 15.
Misure indirette di piante suscettibilità sono ampiamente utilizzati negli studi di interazione pianta-parassita. Ad esempio, suscettibilità di A. thaliana Peach afide Myzus persicae erbivori in genere viene valutata attraverso l'analisi dei parassiti fecondità e la descrizione della morfologia lorda di un impianto dopo l'interazione 16,17. Un altro tipico indicatore indiretto di A. thaliana suscettibilità a un parassita è una valutazione del peso secco o umido del erbivoro. Questo parametro è comunemente utilizzato per caratterizzare erbivori di lepidoterans, come Pieris rapae (piccolo bianco), P. xylostella, o T. ni al loro larve o pupe stadi 15,17.
Acari sono cellule-content feeders. Mite danno indotto è riconosciuto come un insieme di macchie clorotiche che variano di colore dal bianco al verde pallido. La suscettibilità di una pianta ospite per ragnetto erbivori è stato precedentemente valutato sia indirettamente attraverso l'analisi dei giorni di spettacolo ragnetto post-infestazione 18,19, o direttamente con morfologia lordo delle piante settimane post-infestazione 18 o utilizzando un imaging digitale di foglie esposte agli acari per giorni con successiva analisi delle immagini automatizzata 19. Questi metodi sono stati sviluppati e utilizzati per lo studio di interazioni tra piante di pomodoro e T. urticae, e in genere utilizzato un piccolo numero di acari (5-15 al trattamento) che sono stati raccolti dalla popolazione di acari mista e sono stati collocati sulla superficie del foglio con una spazzola a setole morbide. Tuttavia, questi metodi non sono adatti per studi in cui devono essere applicate maggior numero di acari. Inoltre, durante l'elaborazione diretta delle immagini foglia in software di analisi dell'immaginecome Adobe Photoshop (San Jose, CA) o ImageJ 20 possono essere utilizzate per l'analisi di danni pomodoro, questi protocolli devono essere modificate in modo da applicare a foglie che hanno una maggiore riflettività della superficie o sono leggermente colorate e hanno tricomi altamente visibili ( ad esempio, A. thaliana) che interferiscono con la selezione automatica delle macchie clorotiche che segnano danni pianta. Inoltre, lo stadio di sviluppo di acari che possono essere facilmente utilizzati con i metodi precedenti si limita alle femmine adulte più diffusi e facilmente identificabili ed esclude l'utilizzo di altri stadi di sviluppo.
Il primo passo fondamentale verso l'analisi high-throughput di interazione acari pianta ragno è di stabilire, protocolli semplici e robuste riproducibili a sfidare le piante con acari e affidabile valutare i risultati di interazione.
In questo video, un metodo efficiente per la raccolta rapida e semplice di un grande numeroro di acari adulti di sesso femminile, la loro applicazione su un host impianto sperimentale, e la valutazione dei danni dell'impianto a causa di alimentazione ragnetto sono descritti. Il protocollo presentato consente la raccolta veloce ed efficiente di centinaia di persone, in qualsiasi stadio di sviluppo (uova, larve, ninfe, maschi adulti e femmine) che può essere utilizzata per la successiva applicazione sperimentale. Inoltre, questi protocolli possono essere applicati a qualsiasi pianta ospite acari, ma sono specificamente dimostrato nel caso di A. thaliana.
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Protocol
1. Manutenzione del ragnetto Popolazione
NOTA: Acari sono allevati in California fagioli rossi (Phaseolus vulgaris).
- Coltivare piante di fagioli da semi per 2-3 settimane prima infestazione.
- Intermix queste piante con piante infestate; acari adulti saranno ben presto colonizzare materiale vegetale fresco.
- Rimuovere le vecchie piante di fagiolo infestate ogni 7-10 giorni, la loro sostituzione con piante fresche.
2. Raccolta Adult Female acari
- Acari Collection utilizzando il metodo di lavaggio
- Per raccogliere gli acari, posizionare un impianto di fagioli freschi in contatto con le piante infestate 1-2 giorni prima dell'esperimento.
- Utilizzare 20-30 piante di fagioli freschi di raccogliere 1.000 a 2.000 acari femmina adulta.
- Preparare una soluzione di Tween 20 a 0,001% con acqua di rubinetto a temperatura ambiente.
- Lavare piante di fagiolo infestate nella soluzione di Tween 20, utilizzando 2 a 3 piante alla volta.
- Passaggio Complete 2.1.4 entro 10 minuti per evitare la mortalità acaro.
- Isolamento di femmina adulta acari dalla filtrazione della sospensione Mite attraverso vagli di definito Mesh Size
- Preparare setacci delle seguenti dimensioni delle maglie: 500 micron (per rimuovere i detriti) e 300 micron (per raccogliere acari adulti di sesso femminile) (Figura 1A).
- Filtrare la sospensione attraverso il setaccio micron 500.
- ReFilter la sospensione attraverso il setaccio 300 micron. Saranno conservati per adulti acari femminili.
- Immergere un setaccio di 300 micron con adulti acari femminili in acqua di rubinetto pulita per rimuovere il Tween 20.
- Diffondere acari in un unico strato sul fondo dello staccio.
- Utilizzare carta assorbente per togliere l'acqua in eccesso dalla rete e sui lati del setaccio. NOTA: Ciò avviene perché gli acari hanno bisogno di asciugarsi rapidamente per recuperare.
- Preparare un assieme come mostrato in Figura 1B; questo permetterà acari di muoversi liberamente, ma impedirà loro di fuggire.
- Posizionare il setaccio da acari in cima al setaccio che viene utilizzato come supporto.
- Surround setaccio fondo con acqua per evitare gli acari di disperdersi. NOTA: Gli acari si avvierà il recupero dopo circa 5 min. Dopo circa 30 minuti, il numero di acari movimento è sufficiente per avviare la raccolta (Figura 1D). Gli acari devono essere raccolti entro 1 ora, in quanto producono la seta che interferirà con la collezione.
3. Infestazione Pianta con acari
NOTA: Una volta che gli acari femmina adulti hanno recuperato, possono essere utilizzati per gli impianti infestazione. Ci sono due metodi utilizzati per infestare impianti sperimentali con gli acari femmina adulta: a) utilizzando un pennello sottile (sezione protocollo 3.1) e b) utilizzando una pompa o linea di vuoto (sezione protocollo 3.2).
- Mite infestazione utilizzando un pennello
NOTA: Spider acaricon un pennello viene usato per l'applicazione di un massimo di 30 acari per pianta.- Utilizzare un capello morbido pennello arte round di dimensioni 00 o più fine.
- Il pennello bagnato con acqua di rubinetto RT.
- Prendere delicatamente acari dal setaccio con la punta del pennello e trasferirli alla pianta.
- Infestazione di acari utilizzando una pompa
NOTA: infestazione delle piante da acari raccolti da una linea / pompa del vuoto viene utilizzato quando vengono applicati più di 30 acari. Per questo metodo, una pompa a vuoto per componenti microelettronici pickup o una linea di vuoto può essere utilizzato. È importante mantenere costante il flusso dell'aria e sufficientemente resistente (2-4 psi).- Attaccare una punta di pipetta 1 ml al tubo che si collega alla linea o pompa del vuoto utilizzando un taglio 1,5 ml provetta da centrifuga a fondo come un adattatore tra il tubo della pompa / del vuoto e la punta.
- Posizionare un pezzo di carta assorbente tra la punta della pipetta e l'adattatore (1,5 ml provetta). NOTA: lo scopo di questo è di acari intrappolare all'interno tegli punta di pipetta durante il processo di aspirazione ed anche per ridurre il flusso d'aria (Figura 1C).
- Raccogliere acari direttamente dal setaccio usando la punta della pipetta.
- In alternativa, raccogliere gli acari uno per uno da foglie infestate con uno stereoscopio.
- Quando il numero di acari è stato raccolto, rimuovere la punta della pipetta dal tubo, facendo in modo che il pezzo di carta assorbente sul retro della punta della pipetta è stata toccata.
- Raccogliere acari toccando la punta della pipetta e aggregazione gli acari insieme. Poi, metterli sulla foglia; in pochi secondi, gli acari inizieranno a disperdersi sulla foglia.
4. Registrazione e valutazione del danno Flora
- Danni registrazione Flora
NOTA: Per A. thaliana, danni pianta viene valutata dopo 4 giorni di alimentazione acaro. Il danno è registrata come la superficie totale di macchie clorotiche. Per la misurazione danni, l'intero rosetta viene tagliato e scansione.Parametri di scansione descritti sono per uno scanner Epson V30, ma agirà come un buon punto di partenza per qualsiasi scanner piano simile. Mantenere parametri di scansione costanti per tutti gli esperimenti che permette il confronto tra singole corse esperimento.- Coprire letto scanner con foglio trasparente per evitare di contaminare la superficie dello scanner con materiale vegetale.
- Tagliare un intero rosone e posto sul piatto dello scanner in modo adaxial (superiore) lato delle foglie si trovano ad affrontare la sorgente luminosa scanner e elemento di cattura. In alternativa, se le rosette sono troppo densi per catturare singole foglie senza sovrapposizione, sezionare la rosetta in fogli singoli o gruppi di foglie non sovrapposte con le forbici sottili prima di mettere sul piatto dello scanner. Più rosette possono essere acquisiti simultaneamente.
- Coprire rosette o foglie con un pezzo di carta bianco per evitare adesione e la contaminazione del coperchio dello scanner.
- Chiudere il coperchio dello scanner ed eseguire una scansione con i seguenti parametri: Risoluzione: 1,200 dpi; Modo colore: Adobe RGB; Luminosità: +25; Tipo di file: JPEG massima qualità.
- Salvare i file di immagine per la successiva analisi dei danni.
- Danni pianta Quantificazione
NOTA: L'area del danno è calcolato manualmente con Photoshop. A causa di notevoli differenze in forma di foglia e l'intensità del colore dei sintomi a seguito dell'alimentazione acari, metodi automatici erano inaffidabili. Così, un metodo griglia viene usata per valutare i danni pianta:- Aprire l'immagine della pianta con Photoshop.
- Create un nuovo livello, poi sovrapporre un'immagine digitalizzata con una griglia di 0,25 mm x 0,25 millimetri divisioni (View o Visualizza - Mostra - Grid, scorciatoia da tastiera Ctrl + ').
- Su uno strato sovrapposto, indicare le zone di foglie danneggiate utilizzando un punto (utilizzare la funzione "Pencil Tool", scorciatoia da tastiera B). Utilizzare un singolo punto per ogni quadrato della griglia di sotto del quale vi è un danno concernente più metà dell'unità griglia. La dimensione del punto è definito in pixel (cioè,
- Quando tutte le caselle della griglia che mostrano i danni stabilimento che copre almeno la metà delle unità di rete sono contrassegnati con un punto, utilizzare lo strumento istogramma (Finestra - Istogramma) per determinare il numero totale di pixel del livello. Lo strumento istogramma consente di misurare il numero di pixel. Poiché ogni punto è rappresentato da un numero costante e nota di pixel, lo strumento istogramma misurerà il numero totale di pixel, che rappresenta il numero totale di punti, e, per estensione, il numero totale di caselle marcate.
- Calcolare il numero di "punti" contrassegnate utilizzando la formula:
Numero di punti = numero totale di pixel / numero di pixel per punto. - Calcolare l'area totale dei danni moltiplicando il numero di punti marcati sul immagine dalla superficie di 1 quadrato della griglia, come un punto corrisponde ad un quadrato della griglia.
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Representative Results
Utilizzo di 20-30 piante di fagiolo infestate, si può raccogliere circa 2.000 acari femmina adulta con setacci. Il tempo necessario per infestare 10 impianti con 20 acari per pianta è di circa 15 minuti se si utilizza un pennello per trasferire gli acari. Combinazioni di metodi di raccolta e di applicazione sono mostrati nella Figura 2.
Questo protocollo genera risultati riproducibili di danni pianta, dimostrando che gli acari raccolti sono stato fisiologico simile e adatto per studi di interazione acaro pianta-ragno (Figura 3). Per valutare il protocollo riproducibilità, acari femmina adulti sono stati raccolti utilizzando il metodo di lavaggio, dove sono stati collocati 20 acari sulle foglie a rosetta di tre settimane vecchio A. piante thaliana (adesione Col-0) con un pennello umido. Piante trattate sono state scansionate 4 giorni postinfestation e zona di danno è stata quantificata utilizzando le tecniche sopra descritte. Confronto dei risultati sperimentali ripetute è stata effettuata utilizzando ANOVA.
Come esempio di applicazione sperimentale, abbiamo valutato la variazione naturale predisposizione al ragnetto erbivori attraverso 3 A. thaliana adesioni di applicazione del 20 femminili acari per pianta con un pennello bagnato e danni di registrazione 4 giorni dopo l'infestazione. Tipico aspetto dei danni in immagini scansionate viene mostrato in Figura 3B. In seguito, la quantificazione dei dati danno può essere presentata come un grafico a barre o un grafico a scatole e analizzato con il metodo statistico di scelta (Figura 3C). In questo esempio, ANOVA seguita dal test di Tukey HSD sono stati utilizzati per l'analisi dei dati.
Figura 1. Sperimentale istituito per l'isolamento di acari adulti di sesso femminile. (A) Set di setacci per consentire la separazione di differenti sviluppo ragnettofasi. (A. 0,5 millimetri formato di apertura - rimuove i detriti dalla sospensione acaro b 0,3 millimetri -.. Raccoglie gli acari femmina adulta c 0,2 millimetri -.. Raccoglie giovani femmine, maschi, e ninfe d 0,16 millimetri -.. Raccoglie larve e ninfe e.. 0,1 millimetri -.. raccoglie le uova), (B) il programma di installazione utilizzato per consentire acari di recuperare, senza fuggire dopo il lavaggio e filtraggio (C) Setup utilizzato per raccogliere gli acari con pompa (D) Sieve con lo spostamento di acari femmina adulta pronti per essere raccolti..
Figura 2. Possibili strategie per isolare acari femmina adulta, secondo il numero di acari da applicare. Se il disegno sperimentale è necessario l'utilizzo di un elevato numero di adulti acari femminili, l'approccio più efficiente è quello di utilizzare il metodo di raccolta pompa del vuoto direttamente da foglie di fagioli.Se un esperimento è necessario l'utilizzo di una fase di sviluppo diverso femmine adulte o un piccolo numero di individui devono essere accuratamente posizionato su piante giovani, si raccomanda di effettuare la raccolta e frazionamento di stadi di sviluppo ragnetto con l'approccio di lavaggio utilizzando setacci seguite da infestazione con un pennello.
Figura 3. Rappresentante dei risultati. (A) riproducibilità dei risultati sperimentali. Area Danni misurata su tre settimana vecchio A. piante thaliana, adesione Col-0, 4 giorni dopo l'applicazione di 20 acari femmina. Confronto dei risultati sperimentali ripetute è stata eseguita utilizzando ANOVA (n = 6, F = 0,621, P = 0,735). (B e C) la variazione naturale nella suscettibilità alla ragnetto erbivori attraverso 3Adesioni A. thaliana: Col-0, Ler-0, e WS2 (B) Aspetto di piante dopo ragnetto erbivori.. Le frecce rosse indicano verso le aree tipiche danneggiate. (C) Le differenze nella suscettibilità alla ragnetto erbivori come valutati per l'area del danno. Suscettibilità al ragnetto erbivori varia significativamente adesioni (ANOVA, n = 6, F = 13.4, P = 0,0004). Le lettere indicano differenze significative tra genotipi a P <0.05 (test di Tukey HSD). I valori sono rappresentati graficamente media ± errore standard della media.
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Discussion
Questo video dimostra protocolli utilizzati per isolare e ad infestare le piante con un gran numero di acari adulti di sesso femminile. Anche se abbiamo presentato questo protocollo usando A. thaliana, può essere usato per qualsiasi sistema di interazione acaro pianta-ragno e viene attualmente applicato con successo anche su piante di pomodoro e vite (Vitis vinifera). I rendimenti protocollo risultati riproducibili, indicando che gli acari raccolti sono stato fisiologico paragonabile (Figura 3).
Mentre questi protocolli sono semplici da eseguire, diversi passaggi critici richiedono particolare attenzione in quanto saranno influenzare il recupero acaro. Acari lavaggio da foglie devono essere fatti su un massimo di tre piante di fagioli contemporaneamente e deve essere completata entro 10 minuti con acqua a temperatura ambiente. Inoltre, acari devono essere distribuiti su un setaccio per la rapida essiccazione. Se il recupero acaro non è soddisfacente, è importante verificare se la quantità raccomandata di Tween 20 detersivo noi eraEd e se il dosaggio è stato completamente rimosso durante la fase di risciacquo.
Esistono due principali limitazioni al protocollo presentati: a) raccolta acaro dalla pompa funziona bene per collezioni di oltre 30 acari ma raccolta di un numero minore di acari richiede l'utilizzo di un pennello ed è relativamente lenta; Tuttavia, raccogliendo e concentrando acari adulti attraverso il metodo di lavaggio facilita notevolmente l'applicazione; b) analisi dei danni attraverso segnando la superficie di macchie clorotiche può essere un tempo e step-effort che consumano; impegno futuro dovrebbe porre per identificare geni marcatori che possono essere utilizzati come una misura di alimentazione acaro.
Rispetto alle metodologie precedentemente pubblicati, il metodo presentato da collezione ragnetto offre un vantaggio di raccogliere un gran numero di individui vitali e la separazione efficiente dei stadi di sviluppo in un solo passaggio. Inoltre, la valutazione dei danni pianta fenotipo nell'interazione pianta-parassita attraverso inspecti visivao analisi di immagine digitale è in genere il primo passo di un'analisi complessa che comporta qualche forma di molecolare di lettura (ad esempio analisi di espressione genica o metabolita profiling). Attuali protocolli sono adatti per l'applicazione di alcuni acari e raccolta di materiali giorni post-infestazione che sono utili per l'analisi delle interazioni a lungo termine tra impianto e parassiti; Tuttavia, questo protocollo permette di applicare centinaia di acari contemporaneamente per catturare efficacemente risposte delle piante che si verificano durante un breve periodo di tempo (ore) e al sito di alimentazione.
In sintesi, sono stati descritti metodi per applicare gli acari femmina adulta su piante ospiti e valutazione dei danni pianta. Questi protocolli sono essenziali per esperimenti volti a comprendere le basi genetiche e molecolari dell'interazione tra piante e il ragnetto due-spotted.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plant material: | |||
| California red kidney bean | Stokes, Thorold, ON, Canada | 2 week old, well infested with spider mites 2 or 3 days before use. Other cultivars of Phaseolus vulgaris can be used. | |
| Chemicals: | |||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 1% stock solution is prepared to simplify aliquoting |
| Tap water | At room temperature, heat- and cold-shock affect mite survival rate and performance | ||
| Other materials and equipment: | |||
| Plastic tray | |||
| Set of scissors | |||
| 2 L beakers | |||
| Paper towels | |||
| Sets of sieves | Manufactured in house | Detailed instructions are available | |
| Thin brush | |||
| Pipettes | |||
| Pipette tips | 0.2 and 1 ml | ||
| 1.5 ml centrifuge tubes | |||
| Air pump | Aquarium type pump with inverted air flow. Vacuum line can be used. Required pressure drop is approx. 2-4 psi | ||
| Stereoscope | |||
| Scanner | Epson | V30 | Any flatbed scanner allowing necessary degree of control over scan quality. We use Epson V30 for our experiments. |
| Computer | Windows or OS X PC which is compatible with scanner hardware and Adobe Photoshop software. | ||
| Adobe Photoshop software | Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA | various | Any version with Histogram tool included. |
References
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