Summary
Säugetier-Haut enthält eine Vielfalt von Strukturen - wie Haarfollikel und Nervenenden - das charakteristische Muster der räumlichen Organisation zu zeigen. Die Analyse der Haut als flache Halterung nutzt die Vorteile der 2-dimensionalen Geometrie dieses Gewebe voller Dicke hochauflösende Bilder der Strukturen der Haut zu produzieren.
Abstract
Die Haut ist ein sehr heterogenes Gewebe. Intra-dermalen Strukturen umfassen Haarfollikel, arrector Pili Muskeln, epidermale Spezialisierungen (wie Merkel-Zell-Cluster), Talgdrüsen, Nerven und Nervenenden, und Kapillaren. Die räumliche Anordnung dieser Strukturen fest auf einer mikroskopischen Skala gesteuert - wie zu sehen ist, beispielsweise in der geordneten Anordnung von Zelltypen in einer einzelnen Haarfollikel - und in einem makroskopischen Maßstab - wie durch die nahezu identischen Orientierungen von Tausenden von Haaren gesehen Follikel in einem lokalen Bereich der Haut. Visualisierung dieser Strukturen ohne physikalisch Schneiden der Haut ist wegen der 2-dimensionalen Geometrie des Organs möglich. In diesem Protokoll zeigen wir, dass der Mäusehaut zerlegt werden kann, fixiert, permeabilisiert und gefärbt, und als intakte zweidimensionales Objekt, einem Flachmontage geklärt. Das Protokoll ermöglicht die einfache Visualisierung von Hautstrukturen in ihrer Gesamtheit durch die gesamte Dicke der große Bereiche der Haut durch optsche Schnitte und Wiederaufbau. Bilder dieser Strukturen kann auch mit Informationen über die Position und Orientierung relativ zu den Körperachsen integriert werden.
Introduction
Die Haut ist eines der größten Organe im Körper, mit wichtigen Funktionen in somato-Sensation, Isolierung / Wärmeregulation und Immunabwehr ein. Das Verständnis der molekularen und zellulären Grundlagen der Entwicklung und Funktion der Haut hat der langjährige Interesse wegen der grundlegenden Bedeutung der Haut als biologisches System und seine Bedeutung für Dermatologie gewesen. Säugetierhaut enthält eine Vielzahl von multizellulären Strukturen, einschließlich geschichteten Lagen von Keratinozyten, dermale Bindegewebe, verschiedene Arten von Haarwurzeln, Talgdrüsen, arrector Pili Muskeln, Blutgefäße, und mindestens ein Dutzend verschiedene Klassen von afferenten (sensorischen) und ableitenden Nerven Fasern (Abbildung 1). Verschiedene Regionen des Körpers mit charakteristisch unterschiedliche Hauttypen zugeordnet. In den meisten Säugetieren wird fast die gesamte Körperoberfläche mit der Haut, die dicht mit Haarfollikel verpackt ist abgedeckt. [Menschen und Nacktmulle Ausnahmen von thist Muster.] Das Haar ist von den Hohlhandflächen der Hände und Füße, die auch mit spezialisierten epidermalen Muster (Dermatoglyphen), exokrine Drüsen und sensorischen Nervenenden verbunden sind, fehlt. Die zellulären und molekularen Ereignisse, die das Wachstum, die Differenzierung und die räumliche Anordnung der Zellen innerhalb der Haarfollikel zu steuern sind von besonderem Interesse, da jedes Follikel aufweist, in Miniatur viele der zentralen Merkmale der Organogenese 2. Zu diesen Funktionen gehören die Existenz von Stammzellen und Stammzellnische, präzise choreographierte Zelle Migrationen und die Montage von mehrzelligen Strukturen aus embryologisch unterschiedliche Komponenten.
Dieser Artikel beschreibt Methoden zum Präparieren, Fixieren, Kennzeichnung und Imaging-Mäusehaut als intakte zweidimensionalen Blatt, bezeichnet als "whole mount" oder "flat mount" Vorbereitung. Seit Mäusehaut relativ dünn ist, ist es möglich, Bild durch die gesamte Dicke des abgeflachten Skin mit herkömmlichen konfokalen Mikroskopie. Die flache Halterung Ansatz auf Säugetierhaut Bildgebung ist technisch vorteilhaft, weil es umgeht die Notwendigkeit für physische Schnitte, wodurch Strukturen vollständig durch optische Schnitte rekonstruiert werden. Da fast die gesamte Haut wird als ein einzelnes Objekt bearbeitet, die flache Montage Ansatz ermöglicht auch die Darstellung von mehreren Bereichen der Körperoberfläche unter Beibehaltung Informationen über Position und Orientierung relativ zu den Körperachsen. Schließlich sind die Strukturen innerhalb der Haut typischerweise in Mustern, die in regelmäßigen Abständen wiederholt werden und erleichtert so die Sammlung von Bildern aus verschiedenen Vertretern einer gegebenen Struktur vorhanden. Diese Eigenschaften sind dem Neurobiologen, die auf der Netzhaut eines zweidimensionalen Teil des zentralen Nervensystems, die analog Vorteile für die Untersuchung der neuronalen Morphologie 3 befindet arbeiten.
Die hier beschriebene Wohnung montieren Ansatz ist von besonderer utility für die Untersuchung Strukturen, die räumliche Organisation in der zweidimensionalen Ebene der Haut zeigen auf einem relativ großen Maßstab. Ein Beispiel von Großraumorganisation ist die koordinierte Polarität der Haarfollikel und Haarfollikel-assoziierte Strukturen - Merkel-Zell-Cluster, arrector Pili Muskeln, Talgdrüsen und Nervenenden 4. Haarfollikel in einem Winkel bezüglich der Ebene der Haut, und die Komponente des Vektors Follikel, die in den 2-dimensionalen Ebene der Haut liegt orientierten zeigt im allgemeinen eine Orientierung in Bezug auf die Körperachsen, die jeweils genau bestimmt ist Position auf dem Körper. Zum Beispiel, um die Haarfollikel auf der Rückseite Punkt von rostral nach kaudal und Haare auf der dorsalen Oberfläche der Füße zeigen von proximal nach distal. Haarfollikel Orientierung wird durch planare Zellpolarität Signalisierung gesteuert (PCP, auch als Gewebe Polarität 5). Dieses Signalisierungssystem wurde in Drosophila gefunden, wo ein kleinesSatz von Kern PCP Genen gefunden wurde, um die Orientierung kutikulärer Haare und Borsten steuern. Drei Säugetier-Orthologe von Kern PCP Gene - frizzled Homolog 6 (Fzd6, die auch als Fz6 genannt) Cadherin EGF LAG sieben Pass G-Typ-Rezeptor 1 (Celsr1) und Vang-like 2 (Vangl2) - analog zu spielen Rollen in Säuger Haut, die Koordination der Orientierungen der Haarfollikel mit den Körperachsen. Studium der Fz6 Knockout-Mäusen (Fzd6 tm1Nat, im Folgenden bezeichnet Fz6 - / -) zeigen, dass der primäre Defekt in der Abwesenheit von PCP-Signalisierung ist eine erste Randomisierung oder Desorganisation der Haarfollikel Orientierung, ohne Wirkung auf die intrinsische Struktur der Follikel 08.06. Ein zweiter nicht-PCP-System wirkt später auf lokale Ausrichtung der Nähe Follikel, die auf die Produktion von großen Haarmuster wie Quirle und Büschel führt fördern.
Ein zweites Beispiel für Großräumliche Organisation in der Haut ist in den Morphologien der sensorischen Axon Lauben gesehen. Sensorische Neuronen, die die Haut innervieren haben ihre Zellkörper in der Hinterwurzel und Trigeminalganglien. Diese Neuronen erfassen Temperatur, Schmerz, Juckreiz, und verschiedene Arten von mechanischen Verformungen Auftreffen auf die Haut-und Haar 9. Sie können in Untergruppen, basierend auf Axondurchmesser und Leitungsgeschwindigkeit, Anschluß Nervenende Struktur, und die Muster der Expression von Rezeptoren, Kanäle und andere Moleküle unterteilt werden. Aufgrund der hohen Dichte der Innervation in der Haut, Analysen beinhalten, dass Visualisierung aller Axone (zB Anti-Neurofilament-Immunfärbung) oder sogar alle Axone von einer einzelnen Klasse (so gesehen, wenn ein Zelltyp wird durch Expression eines fluoreszierenden Reporter markiert) offenbart im allgemeinen eine dichte Überlagerung der Axone, die es unmöglich macht, die Morphologie eines einzelnen Dorn definiert ist. Um dieses Problem zu umgehen, haben wir sehr spärlich genetisch gerichteten l verwendetAbeling, um Rückenhautproben, in denen einzelne gut isoliert Axon Lauben sind Ausdruck einer histochemischen Reporter menschlichen Plazenta-alkalische Phosphatase 10 visualisiert produzieren. Dieser Ansatz ermöglicht die eindeutige Visualisierung der einzelnen Axon Laube Morphologien und eine Definition des somatosensorischen Neuronen Typen basierend auf morphologischen Kriterien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen in der Bedienungsanleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Alle Tiere wurden nach anerkannten institutionellen Tierpflege und Verwendung Ausschuss (IACUC)-Protokoll MO11M29 der Johns Hopkins Medical Institutions abgewickelt. Fragen Sie Ihren örtlichen Richtlinien Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss für genehmigte Methoden der Euthanasie. Tragen Sie Handschuhe, Kittel und Schutzbrille beim Umgang mit Aldehyd-Fixiermittel oder organischen Lösungsmitteln.
1. Herstellung von Materialien
- Gießen SYLGARD Platten
- Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, mischen die Härter mit der Basis, und rühren Sie mit einem Kunststoffstab.
- Pipette ~ 35 ml Flüssigkeit pro Sylgard Durchmesser von 10 cm Gewebekulturschale. Zellkulturschalen sind tiefer als die Standard-Bakterien Gerichte; Diese bietet vertikale Freiraum für die Insekten-Pins.
- Legen Sie die dishes auf einer horizontalen Fläche bei Raumtemperatur über Nacht. Bubbles während des Misch gebildet wird verschwinden.
- Nach der Polymerisation Sylgard speichern die Platten bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Sylgard Platten bei Raumtemperatur Jahren mehrfach gespeichert werden und wiederverwendet werden, bis die Sylgard von der Platte löst.
- Lösungen
- Benzylbenzoat und Benzylalkohol (BBBA). Mix 2 Bände Benzylbenzoat und 1 Volumen Benzylalkohol. Shop in der Dunkelheit in einer Glasflasche mit einem Glasstopfen oder Teflon Spitze.
ACHTUNG: Gebrauchte BBBA sollten entsprechend als organisches Lösungsmittel Abfall behandelt werden. Nicht BBBA Kunststoff kontaktieren. - Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). In 4 g PFA bis 80 ml Wasser, 0,1 ml 1 N NaOH, rühren auf einer heißen Platte bei ~ 70 ° C für ca. 5 min, bis das PFA vollständig gelöst ist, und fügen Sie 10 ml 10x PBS und bringen das Volumen auf 100 ml mit Wasser.
ACHTUNG: Das Einatmen von Formaldehyd / PFA und BBBA Dämpfe solltenindem sie diese Lösungen in abgedeckten Behältern minimiert. Formaldehyd / PFA ist krebserregend. - Oil Red O Bereiten Sie eine 0,5% Lager in Isopropanol. Unmittelbar vor der Verwendung mit Wasser verdünnt, um eine Endkonzentration von 0,3% Oil Red O, und dann durch einen 0,2 &mgr; m Filter.
- Benzylbenzoat und Benzylalkohol (BBBA). Mix 2 Bände Benzylbenzoat und 1 Volumen Benzylalkohol. Shop in der Dunkelheit in einer Glasflasche mit einem Glasstopfen oder Teflon Spitze.
2. Haut-Dissection, Fixierung und Clearing
- Rückenhaut für Immunfärbung und Melanin Imaging
- Bei sehr jungen Mäusen (zB Föten und postnatalen Tag (P) 0-P3 Jungtiere), einschläfern die Mäuse durch Isofluran-Inhalation. Euthanize älteren Mäusen durch Isofluran-Inhalation oder durch Ketamin / Xylazin Injektion, gefolgt von Genickbruch.
- Entfernen Sie die Haare mit einem elektrischen Rasierer und Haarentfernung Gel. Bei Mäusen, die jünger als P8, kann dieser Schritt übersprungen werden.
- Verwenden einer Rasierklinge, um einen horizontalen Schnitt von der Basis des Schwanzes entlang jeder Flanke machen, vorbei an der dorsalen Seite der Basis jedes Schenkels ausgehend seitlich zu den Ohren und am Endeten an der Nase.
- Schale sanft die Haut von dem darunterliegenden Gewebe ausgehend von dorsal, indem die Haut zwischen behandschuhten Finger, so dass es nicht durch die Zange eingeklemmt ventral. Beim Schälen der Haut auf der Höhe der Ohren, zuerst schneiden Sie die Ohren mit einer Schere und fahren Sie besonders langsam, wie die Haut an dieser Stelle reißen.
- Von diesem Punkt an, richten Sie die Haut mit der Innenseite nach oben. Pin der Haut Sylgard mit ~ 20 Insektenstifte gleichmäßig um den Umfang angeordnet sind; nicht überdehnen die Haut (Abbildung 2B). Decken Sie die Haut mit 10-20 ml PBS.
- Präparieren Sie die Haut weg-assoziierten Fett-und Bindegewebe mit abgewinkelten oder gebogenen Pinzette mit dem spitzen Ende der Zange ist horizontal ausgerichtet, um das Risiko, dass die Zange wird die Haut durchdringen zu minimieren. Extrudieren Sie alle Luftblasen, die unter der Haut, die durch einen sanften Wattestäbchen über die Hautoberfläche eingefangen worden sind.
HINWEIS: Wenn die Haut gehtfür Flachmontage Immunfärbung oder Histochemie verwendet werden, entfernen Sie so viel des Bindegewebes wie möglich; wenn die Haut wird verwendet, um die Haarfollikel auf der Grundlage Melaninpigmentierung visualisieren, weniger vollständige Entfernung von Bindegewebe zufriedenstellend. Pränatale Haut benötigt minimal "Reinigung" von adhärenten Bindegewebe. - Befestigen Sie das merken Haut durch Zugabe von 20 ml frisch zubereiteten 4% PFA / PBS oder 10% Formalin pro 10 cm Sylgard Platte oder 20 ml frisch zubereitet (wenn die Haut Melanin für Bildgebung oder alkalische Phosphatase (AP) Histochemie verwendet werden) 2% PFA / PBS (wenn die Haut für die Immunfärbung oder Visualisierung von transgenen Keratin (KRT) 17-GFP-11 verwendet werden), und sanft drehen über Nacht in einem kalten Raum. Am nächsten Tag, waschen in PBS für> 10 min.
HINWEIS: Standard Formalin 37% Formaldehyd; Daher ist "10% Formalin" 3,7% Formaldehyd. - Für AP-Färbung und Immunfärbung, weiterhin in Abschnitt 3. Für Melanin imagtion, trocknen die Haut durch eine abgestufte Ethanolreihe (70%, 95%, 100%), ein Tag für jeden Schritt unter leichtem horizontale Dreh bei Raumtemperatur. Rückstände von Bindegewebe.
- Mit der Haut in 100% Ethanol, entfernen Sie die Insekten Stifte und, wenn gewünscht, schneiden Sie die Haut mit einer Schere, um die meisten Peripherie 1-2 mm der Haut mit dem Stiftlöcher zu entfernen.
- Übertragen Sie die Haut mit einem Durchmesser von 10 cm Glasschale, legen zwei Glasobjektträger auf der Haut, um sie vom Eisstockschießen zu verhindern, und 20 ml BBBA. BBBA schnell härtet Gewebe so ist es wichtig für die Haut, unter dem Gewicht der Glasobjektträger vor der Zugabe des BBBA abgeflacht werden.
- In den nächsten Stunden, heben die Folien von der Haut für ein paar Sekunden, bis die BBBA über die Haut zu waschen.
HINWEIS: Tragen Sie Handschuhe, wenn Sie mit BBBA. Je nach Alter und Lage der Haut kann es so viel wie 30% Schrumpfung in BBBA sein.
- Fuß-Haut für die Analyse der Haarfollikel Patterning
HINWEIS: Das Altersspektrum ist in der Regel untersucht P1-P8.- Nach Euthanasie, schneiden Sie die Füße über dem Sprunggelenk und einen einzigen geraden Schnitt entlang der Bauchseite durch die Sohlen der Füße.
- Schälen Sie die Haut von der darunter liegenden Gewebe, Vorgehen in einer von proximal nach distal.
- Schneiden Sie die Ziffern, um die Haut zu lösen und stecken Sie es mit der Innenfläche nach oben zeigt (Abbildung 2C) SYLGARD. Es ist minimal Bindegewebe der Haut auf dem Fuß.
- Transgene KRT17-GFP Haut ist nun bereit für die Bildgebung. Für Melanin Bildgebung weiter mit Fixierung, Entwässerung und BBBA Clearing, wie in Abschnitt 2.1 beschrieben.
- Fuß-Haut für Visualisierung Talgdrüsen
- Nach Euthanasie, entfernen die Haare durch Reiben Haarentferner Gel über die Hautoberfläche mit einem behandschuhten Finger und Daumen; 10 Minuten warten.
HINWEIS: Verwenden Sie keinen elektrischen Rasierer, der die zarte Fußhaut beschädigt. - WAsche die Hautoberfläche mit Leitungswasser, sezieren und stecken die Haut Sylgard wie in Abschnitt 2.2 beschrieben.
- Fix mit 1% PFA / PBS für 30 min bei Raumtemperatur und dann in PBS waschen.
HINWEIS: Für die Visualisierung Talgdrüsen an den Füßen, die nach der ersten Lebenswoche zu entwickeln, die optimale Zeit für die Analyse mit Oil Red O P21, weil dies markiert den Tiefpunkt der Haarpigmentierung bei der ersten Haarzyklus 12, und daher werden die Talgdrüsen können leichter gesehen werden. Mit Albino-Mäusen konnte diese Analyse in jedem Alter durchgeführt werden. Um Albino Nachkommen Quer pigmentierte mutierten Mäusen zu einer Tyrosinasemutante Linie wie C57BL/6J-Tyr c-2J erhalten.
- Nach Euthanasie, entfernen die Haare durch Reiben Haarentferner Gel über die Hautoberfläche mit einem behandschuhten Finger und Daumen; 10 Minuten warten.
- Schwanz Hautvorbereitung zur Analyse von Melanin Distribution, Haarfollikel Orientierung und Talgdrüse Visualisierung
- Nach Euthanasie, einen Rundschnitt um die Basis des Schwanzes, und dann einen Längsschlitz, die die Länge des Schwanzes entlang ihrer Bauchseite läuft. <li> Ziehen Sie die Schwanzhaut ab an der Spitze an, indem Sie die Spitze der Schwanz Knochen und / oder Bindegewebe mit einer Pinzette und die Haut mit einer zweiten Pinzette. Pin den Schwanz Haut Sylgard.
- Für die Analyse der Melaninverteilung und Haarfollikel Orientierung, zu beheben und zu verarbeiten, die Haut, wie in Abschnitt 2.1 beschrieben. Für die Analyse der Talgdrüsen, schneiden Sie die Schwanzhaut in eine Reihe von Segmenten ~ 0,5 bis 1 cm in der Länge vor der Fixierung und bebrüten die Hautstücke in PBS / 5 mM EDTA über Nacht bei 37 ° C, um die Dermis-Epidermis Haft 13 schwächen.
- Ziehen Sie leicht die Epidermis von der Dermis, Epidermis, um die Pin Sylgard (Innenfläche nach oben), und fixieren Sie sie in 4% PFA / PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Mit PBS waschen, färben und mit Oil Red O wie unten beschrieben.
HINWEIS: Ein elektrischer Rasierer und / oder Haarentfernung Gel kann vor Sezieren älteren Schwanzhaut (z. B. P21) verwendet werden, aber diese Behandlung ist optional, da das Haar am Schwanz ist nichtso dicht wie an anderer Stelle im Körper.
3. Färbung Reaktionen
- Menschliche Plazenta-alkalische Phosphatase (AP) Histochemistry Visualisieren genetisch markierten Axon Lauben 10,14,15 (3A, B)
- Nach PFA Fixierung auf Sylgard, legen festen Häute in einem 10 cm Glasschale und tauchen unter PBS / 1 mM MgCl 2. Drehen Sie vorsichtig die Schale in einem Wasserbad bei 70 ° C für 90 min, um die endogene Phosphatase-Aktivität zu zerstören.
- Visualisieren AP Reporteraktivität histochemisch mit 4-48 h Inkubation bei Raumtemperatur in 0,1 M Tris, pH 9,5, 0,1 M NaCl, 50 mM MgCl 2, 0,34 &mgr; g / ml NBT und 0,175 &mgr; g / ml BCIP, typischerweise mit 10-15 ml Färbelösung pro P21 Rückenhaut. Überwachen Sie die Reaktion unter dem Binokular, kümmert sich um sie über die optimale Zeit gehen, wie durch visuelle Inspektion der Axon-Färbung Intensität relativ unspezifische Ablagerung NBT beurteilt zu lassen. Die Reaktion durch Waschen mit drei Änderungen von PBS/0.1% Tween-20 im Laufe von 1 h, Re-Stift den Schalen zu Sylgard, dehydrieren die Felle durch eine Ethanol-Serie, und dann übertragen die Felle auf eine 10 cm-Schale mit BBBA.
HINWEIS: BBBA löst sich langsam die NBT Niederschlag. In den ersten paar Stunden in BBBA, wird eine feine Hintergrund gefällt NBT aufzulösen; Als Ergebnis wird die Lösung BBBA verdunkeln und die Haut aufzuhellen. Ändern Sie die frische BBBA nach ein paar Stunden. - Nach der Abbildung des AP-gefärbte Haut, überträgt es auf> 1 h bei Raumtemperatur in Ethanol und dann speichern Sie es in frischem Ethanol bei -20 ° C AP-gefärbten Häute können auf diese Weise für viele Monate ohne Signalverlust gelagert werden.
- Oil Red O Färbung zu visualisieren Talgdrüsen 4 (3C-F)
- Insektenstifte entfernen und übertragen die leicht behoben Fuß oder Schwanz Skins aus dem Sylgard Platte mit den Vertiefungen einer 6-Loch-Gewebekulturplatte mitbis zu zwei Hautproben pro Vertiefung. Für 5 min bei Raumtemperatur Wasser: Waschen mit Isopropanol 60:40.
- Stain in 2 ml 0,3% Oil Red O in 60:40 Isopropanol: Wasser (siehe Abschnitt 1.2) bei Raumtemperatur für 2 Stunden.
- 5 min bei Raumtemperatur, gefolgt von einem Wasserwaschwasser waschen mit Isopropanol 60:40. Sorgfältig schneiden Sie die Ränder der Haut, auch die Stiftlöcher, mit einer feinen Schere, so dass die Oberfläche der Haut kann so flach wie möglich gemacht werden.
- Legen Sie die Haut auf einem Objektträger mit der Außenseite nach oben, ein paar Tropfen von Wasser oder wässrigen Eindeckmedium, decken Sie die Haut mit einem Deckglas, und dann sanft kleben Sie das Deckglas auf den Objektträger weiter glätten die Haut.
- Wohnung Berg Immunfärbung 4,16,17 (Abbildungen 3G, H)
- Schneiden Sie ein Rechteck aus PFA fixiert Haut (z. B. 1 cm x 0,5 cm), Kennzeichnung seiner Ausrichtung mit einem asymmetrischen Schnitt (z. B. Clip die vordere rechte Ecke). Führen Sie die Inkubation undWaschschritte mit sanften Drehung auf einer rotierenden horizontalen Plattform. In die Vertiefungen einer 6 - oder 12-Well-Gewebekulturplatte, mehrmaliges Waschen mit PBS, um Rest PFA entfernen, mit ~ 10 Wechseln von PBS mit 0,3% Triton X-100 (0,3% PBST) über 5-8 Stunden bei Raumtemperatur auf die Haut durchlässig zu.
- Inkubieren mit dem primären Antikörper in 0,3% PBST mit 5% Ziegenserum und 20% DMSO für fünf Tage bei Raumtemperatur. Die Vertiefungen der Platte mit durchsichtigem Klebeband oder Klebstoff Kunststoffverdunstungsverluste zu beseitigen.
- 10-15 Änderungen von 0,3% PBST waschen über 5-8 h und Inkubation mit sekundärem Antikörper in 0,3% PBST mit 5% Ziegenserum und 20% DMSO für 3 Tage bei Raumtemperatur.
- 10-15 mit Änderungen von 0,3% PBST über 5-8 Stunden waschen.
- Dehydratisierung in 25%, 50% und 75% Methanol und dann mit je 3x in 100% Methanol für jeweils 20 min 5 min.
- Klar in BBBA über Nacht bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Wohnung montieren Immunfärbung von Haut jünger als~ P1, wie oben beschrieben, jedoch mit kürzeren Inkubationszeiten durchgeführt und Waschzeiten. Zum Beispiel kann die Haut mit einem P1-Nacht-Inkubation in primärem Antikörper und einem mehrstündigen Inkubation in sekundären Antikörper immungefärbt werden und mit dazwischen Wäschen 2-3 h in 0,3% PBST. Wie oben erwähnt, sind jünger Skins auch dünn genug, dass sie ohne BBBA Clearing abgebildet werden.
- Visualisierung Merkelzell-Cluster mit fluoreszierenden Nerven Terminal-Farbstoffaufnahme (Abb. 3I-L)
AMI-43 (grün) und AM4-65 (rot) fixierbar sind Fluoreszenzfarbstoffe, die Zellen über nicht-selektiven Kationenkanal 18 eintreten. In der lebenden Haut diese Farbstoffe selektiv aufgenommen und in Merkel-Zellen konzentriert.- Lösen Sie 1 mg AM1-43 oder AM4-65 in 2 ml PBS und Speicher in Aliquots bei -80 ° C
- Inject neugeborenen Welpen subkutan mit 2-10 ug Farbstoff pro Gramm Körpergewicht mit einer 29 G-Nadel.
- Einen Tag später einschläfern die Mäuse und disseCT Die Rückenschalen.
- Fix die Felle in 4% PFA / PBS bei 4 ° C über Nacht, waschen mit PBS, und montieren Sie die Haut, wie in Abschnitt 3.2 beschrieben.
4. Imaging und Bildanalyse
- Imaging Haarfollikel Orientierung (Abbildung 4)
- Verwenden Sie ein Binokular für Bild in Rücken-, Fuß-oder Schwanz Skins, die in BBBA in der Glasschale eingetaucht sind, unter einem Glasobjektträger abgeflacht, und noch immer - dieser Ansatz minimiert BBBA Kontamination des Mikroskops.
- Beleuchten Sie die Schale von unten. Um räumliche Variation der Lichtintensität über das Sichtfeld zu minimieren, erhöhen die Glasschale zu einer Höhe ~ 10 cm über der Standard-Arbeitsoberfläche des Binokular und legen eine Streu Kunststoff-oder Glasplatte über der Lichtquelle.
- Rückgabe die Haut 100% Ethanol für langfristige Lagerung bei -20 ° C.
HINWEIS: Lassen Sie die Haut in BBBA für mehr als einen Tag bewirkt, dass die Melanin-Granula zu brechen einTeil. Sobald die Haut wurde BBBA behandelt es wird hart und flach bleiben ab diesem Zeitpunkt. Verschiedenen Häute mit einer Reihe von Kerben an ihrem vorderen und / oder hinteren Enden kodiert werden, so dass sie zusammen lagern kann, um Platz im Gefrierfach zu speichern.
- Imaging and Tracing Axon Lauben (3A, B)
- Zeigen AP gefärbten Haut (Abschnitt 3.1.3) zwischen zwei Glasplatten des Typs für kleine Protein-Gele verwendet. Vermeiden Sie die Einführung von Luftblasen zwischen den Platten und der Haut, und dann sorgfältig Docht entfernt überschüssiges BBBA mit einem Papiertuch. Legen Sie die Sandwich-Platte Haut-Platte auf einem Mikroskoptisch (2D).
- Verwenden Hellfeld oder DIC Beleuchtung mit einer 10X-Objektiv und 2 um oder 5 um Z-Schritte. Verwenden Sie einen mechanisierten XY-Tisch, um eine Montage von XY Bilder, die zusammengenäht sind, um einen einzigen dreidimensionalen Graustufen-Datensatz erstellen zu erfassen.
HINWEIS: Für einen großen Axon Laube, diese Datenmenge kann eine seins groß wie 5 Gb. - Eine manuelle, automatische oder halbautomatische Ablaufverfolgung von Axon Dorne mit einem aus einer Vielzahl von Software-Paketen.
HINWEIS: Software wie Neuromantic (http://www.reading.ac.uk/neuromantic/) ist ein kostenloses Tool, das neuronale Rekonstruktion in einer PC-Umgebung läuft und ist relativ einfach zu meistern 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hellfeld-Abbildung der Hautflatmounts können Bild kutane sensorische Afferenzen (3A 10) und Haarfollikel-Muster basierend auf Melaninpigmentierung (Fig. 4) verwendet werden. Konfokale Abbildung der Hautflatmounts kann verwendet werden, um die Geometrie (1) Merkel-Zell-Clustern, mit Anti-Cytokeratin-6 oder mit AM Farbstoffaufnahme (Fig. 3I-L), (2) arrector pili Muskeln, mit Anti visualisiert visualisiert definieren Aktin glatter Muskeln (Fig. 3G, H), (3) Talgdrüsen mit Oil Red O (3C-F), und (4) Haarfollikel mit KRT17-GFP-Transgens oder durch Färbung mit Anti-Antikörpern sichtbar visualisiert KRT17 4 (3E-G, K, L). Es ist einfach, die Orientierung und die räumliche Anordnung der Strukturen in solchen Bildern manuell punkten, indem Vektoren bekannter Orientierung an den Strukturen mit Hilfe von Adobe Photoshop oder Illustrator, und dann quantifying die daraus resultierenden Vektorpopulationen. Während dieser Ansatz reicht für einer Skala von einigen hundert Vektoren, wäre es untragbar mühsam sein, auf einem 10 - oder 100-fach größeren Maßstab.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Säugetier behaarter Haut, die die Hauptstrukturen. (Urheberrecht, Terese Winslow.)
2. Haut-Dissektion und Probenhandhabung. A) Dissection-Tools. B) A P5 Rückenhaut zu einem Sylgard Platte fixiert. C) Ein P5 Rücken Hinterfuß Haut zu einem Sylgard Platte. D) merken Eine Rückenhaut zwischen zwei Glasplatten für Gel Imaging montiert wit einem 10X-Objektiv und DIC oder Hellfeldbeleuchtung.
Abbildung 3. Haut-Strukturen in Flachmontage Blick. A, B) Eine einzelne Hautsinnes Laube (links) und seiner verfolgt Bild (rechts) aus einer P21 Rückenhaut eines Brn3a CKOAP / +;. NFL-Creer / + Maus zu niedrige Dosis an Tag 17 Schwangerschafts Tamoxifen ausgesetzt Dieses Protokoll Ergebnisse in Cre-vermittelte Rekombination des Reporters in einem sehr kleinen Bruchteil der Hinterwurzelganglienneuronen und daher ein kleiner Teil der kutanen Sensor Dorne mit dem humanen plazentalen alkalischen Phosphatase (AP) Reporter markiert. Die markierten Axone sind mit NBT / BCIP Histochemie visualisiert. Brn3a äquivalent als Pou4f1. C, D) bezeichnet Schwanz Haut mit Oil Red O gefärbt, um die Talgdrüsen aus visualisierenWT (links) und Fz6 - / - (rechts) Mäusen bei P21. Die Fz6 - / - Strukturen sind desorganisiert. P, proximalen; . D, distalen E, F) Rücken Fuß Haut von WT (links) und Fz6 - / - (rechts) Mäusen, die KRT17-GFP. Die Haut wurde bei P21 geerntet und mit Oil Red O. Die Fz6 gefärbt - / - Haut hat eine Haar Quirl in der Mitte. P, proximalen; . D, distalen G, H) Rückenhaut von einem WT Maus auf P21, die Haarfollikel (mit KRT17-GFP-Transgen und anti-GFP-Immunfärbung sichtbar gemacht; Platte G) und arrector Pili Muskeln [mit anti-smooth muscle Aktin (SMA visualisiert )-Immunfärbung; Panel H]. Tiefe in dem Bild konfokalen Z-Stapel ist farbcodiert. A, vordere; P, posterior. IL) Ein Merkel-Zell-Cluster (mit cytokeratin8 Immunfärbung oder AM11-43 Farbstoffaufnahme visualisiert) und seine zentrale Haarfollikel (in K-und L-Panels mit KRT17-G visualisiertFP). Die Bilder wurden von P1 Rückenhaut von den angegebenen Genotypen erhalten. Die Fz6 - / - Merkel-Zell-Cluster bildet einen geschlossenen Kreis, während der WT Merkel-Zell-Cluster ist in Richtung der vorderen geöffnet. A, vordere; P, posterior. Maßstabsbalken: A und B 300 um; C und D, 500 &mgr; m; E und F, 500 um; G und H, 200 um; IL, 50 um. (Felder A und B aus eLife und Proc wiedergegeben. Natl. Acad. Sci. USA, mit Genehmigung 4,10) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Haar und Haarfollikel in Rückenhaut an P1 und P7 visualisiert mit Melanin-Pigmentierung. A, B) P1 Haut von WT und Fz6 - / -. Mäusen C, D) P7 Haut von Fz6 - / - Mäusen. Maßstabsbalken: A und B 500 um; C und D, 1 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die Beherrschung der oben beschriebenen Methoden Dissektion erfordert nur Geduld, eine ruhige Hand und ein paar gute Dissektion Werkzeuge. Die Rückenhaut Dissektion ist relativ einfach, aber die Schwanz-und Fuß-Haut Dissektionen - vor allem in der frühen postnatalen Alters - sind anspruchsvoller. Am frühen pränatalen Altersgruppen (z. B. vor dem E15), die Haut ist schwer zu entfernen, ohne es zu zerreißen. Günstig für viele Untersuchungen über das Wachstum und Musterbildung der Hautstrukturen in Mäusen, die Ereignisse von Interesse auftreten postnatal, wie zum Beispiel in Untersuchungen des Wachstums arrector pili Muskeln 19 ersichtlich.
Imaging tief in die Haut in einer flachen Montagekonfiguration ist schwierig, weil die Haut ist eine relativ lichtbrechenden Gewebe. Diese Herausforderung wird größer, wenn die Haut reift aufgrund der Differenzierung und erhöhte Dicke der einzelnen Schichten. Eine Teillösung für dieses Problem ist es, die Dermis und die Epidermis zu trennen und zu analysieren epidermist als eine separate Struktur ("epidermal Gesamtpräparate"). Dieser Ansatz ist sinnvoll, für die Visualisierung Haarfollikel und die damit verbundenen Strukturen, vor allem für die Mausschwanzhaut. , Die Beschaffung qualitativ hochwertiger epidermalen ganze Lager von Maus Rückenhaut ist jedoch schwierig, was vermutlich auf (1) die hohe Dichte der Haarfollikel, die tief in die Dermis zu verlängern und (2) die Dünnheit der Epidermis interfollikuläre 13.
Nach unserer Erfahrung ist BBBA Behandlung eine sehr wirksame Methode für die Darstellung von Haut optisch transparent unter Wahrung Immunfluoreszenz-Signale, ohne die Notwendigkeit der Trennung der epidermalen und dermalen Schichten. Benzyl-Benzoat wurde verwendet, um Gewebe für 20 Jahrzehnten zu löschen und es wird allgemein verwendet, um Frosch und Fischembryonen zu löschen. Allerdings hat BBBA den Nachteil, dass es denaturiert GFP und andere fluoreszierende Proteine, löst es Oil Red O, und es kann Gerät (zB Mikroskope) verunreinigen. Es wäre interes seint auf BBBA Behandlung von Haut mit anderen Methoden wie Klärung SeeDB 21, ClearT 22, Mensur 23, 3DISCO 24 und CLARITY 25, von denen einige mit fluoreszierenden Proteinen kompatibel sind systematisch zu vergleichen. Wenn BBBA behandelten Proben sind mit einem Binokular abgebildet werden, ein herkömmliches Licht / Fluoreszenzmikroskop oder ein konfokales Mikroskop, sollten die Proben in einer Glasschale oder zwischen zwei großen Glasplatten platziert werden, um BBBA Kontamination zu minimieren.
Wir haben nicht die Datenanalyse im Detail diskutiert, da dies mehr idiosynkratische zur biologischen Frage untersucht. , Wie in der Einleitung erwähnt, ist die Anwesenheit von vielen nahezu identischen Strukturen wie Haarfollikel, Merkel-Zell-Cluster und Nervenenden, und die Vollständigkeit, mit der diese Strukturen können in flachen Halterungen abgebildet werden, bietet jedoch die Möglichkeit, strukturelle oder morphologische Parameter zu messen in einer statistisch strenge manner, wie zum Beispiel in aktuellen Studien der kutanen sensorischen Axon Morphologien 10 und der Haarfollikel und Follikel-assoziierte Strukturen in Wildtyp-und mutierten Mäusen Fz6 4,8 gesehen. Mit der Entwicklung von anspruchsvoller Bild-Analyse-Tools, kann es möglich sein, zu automatisieren oder semi-automatisiert einige der Analysen, die, zur Zeit, werden manuell durchgeführt, wodurch breitere Verwendung von Haut Erleichterung Flachbildmontage als eine Methode für die Untersuchung der zugrunde liegenden Prinzipien mehrzellige Organisation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP) | Roche | 11383221001 | |
| AM1-43 | Biotium | 70024 | |
| AM4-65 | Biotium | 70039 | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B-6630 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cy3-alpha smooth muscle actin antibody | Sigma | C6198 | 1:400 |
| Cytokeratin-8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-c | 1:500 |
| Dissecting microscope | |||
| Dissection tools | Fine Science Tools | scissors and forceps | |
| Electric razor | |||
| Fluoromount G | EM Sciences | 17984-25 | |
| Formalin | Sigma | HT501320 | |
| Glass dishes | Pyrex | 6 cm and 10 cm diameter | |
| Glass plates | Amersham Biosciences | SE202P-10 | 10 cm x 8 cm x 1 mm |
| Hair remover | Nair | ||
| Horizontal rotating platform | Hoefer | PR250 Orbital shaker | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma | K113 | |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Roche | 11383213001 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| Secondary antibodies | Invitrogen | Alexa-dye conjugated | |
| Sylgard-184 | Fisher Scientific | NC9020938 | |
| Tissue culture plastic dishes | 10 cm diameter | ||
| Tissue culture plates | 6- and 12-well |
References
- Rook's Textbook of Dermatology. 8th ed. Burns, T., Breathnach, S., Cox, N., Griffiths, C. , Wiley Blackwell. (2010).
- Lee, J., Tumbar, T. Hairy tale of signaling in hair follicle development and cycling. Semin. Cell Dev. Biol. 23, 906-916 (2012).
- Masland, R. H. The neuronal organization of the retina. Neuron. 76, 266-280 (2012).
- Chang, H., Nathans, J. Responses of hair follicle-associated structures to loss of planar cell polarity signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, (2013).
- Wallingford, J. B. Planar cell polarity and the developmental control of cell behavior in vertebrate embryos. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 627-653 (2012).
- Guo, N., Hawkins, C., Nathans, J. Frizzled6 controls hair patterning in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 9277-9281 (2004).
- Wang, Y., Badea, T., Nathans, J. Order from disorder: Self-organization in mammalian hair patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 19800-19805 (2006).
- Wang, Y., Chang, H., Nathans, J. When whorls collide: the development of hair patterns in frizzled 6 mutant mice. Development. 137, 4091-4099 (2010).
- Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
- Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, (2012).
- Bianchi, N., Depianto, D., McGowan, K., Gu, C., Coulombe, P. A. Exploiting the keratin 17 gene promoter to visualize live cells in epithelial appendages of mice. Mol. Cell. Biol. 25, 7249-7259 (2005).
- Alonso, L., Fuchs, E. The hair cycle. J. Cell Sci. 119, 391-393 (2006).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 30, 5241-5255 (2003).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J. Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Rotolo, T., Smallwood, P. M., Williams, J., Nathans, J. Genetically-directed, cell type-specific sparse labeling for the analysis of neuronal morphology. PLoS One. 3, (2008).
- Devenport, D., Fuchs, E. Planar polarization in embryonic epidermis orchestrates global asymmetric morphogenesis of hair follicles. Nat. Cell Biol. 10, 1257-1268 (2008).
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147, 1615-1627 (2011).
- Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).
- Fujiwara, H., et al. The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche. Cell. 144, 577-589 (2011).
- Orsini, M. W. Technique of preparation, study and photography of benzyl-benzoate cleared material for embryological studies. J. Reprod. Fertil. 3, 283-287 (1962).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Aal Ertürk,, et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat. Methods. 10, 508-513 (2013).
