Summary
このような毛包と神経終末など - - 空間構成の特徴的なパターンを示す哺乳動物の皮膚は、構造体の多様な配列が含まれています。フラットマウントとして皮膚を分析して皮膚構造の全層の高解像度画像を生成するためにこの組織の2次元形状を利用する。
Abstract
皮膚は非常に不均質な組織である。皮内構造は、毛包、立毛筋（例えばメルケル細胞クラスターなど）の表皮の専門分野、皮脂腺、神経や神経終末、および毛細血管が含まれる。これらの構造の空間的配置を密に顕微鏡スケールで制御されている - と巨視的スケールで - - 、例えば、単一の毛包内の細胞型の整然とした配置に見られるように、毛髪の数千のほぼ同一の向きに見られるように皮膚の局所的領域内の卵胞。物理的に肌を区画することなく、これらの構造を視覚化するため、この器官の2次元ジオメトリに可能である。このプロトコルでは、マウスの皮膚を切開し、固定し、透過処理し、染色し、インタクトな二次元の物体、平坦なマウントとして明確にすることができることを示している。プロトコルは、OPTによる皮膚の広い領域の全厚さを貫通して、その全体が皮膚構造を簡単に可視化を可能にするiCalの切片と復興。これらの構造の画像は、また、体軸に位置及び向きに関する情報と統合することができる。
Introduction
皮膚は体性感覚、断熱材/体温調節、および免疫防御1で重要な機能と体内で最も大きな臓器の一つである。肌の発生と機能の分子細胞基盤を理解することがあるため、生体系および皮膚科学との関連性などの皮膚の基本的に重要で長年注目されています。哺乳類の皮膚は、ケラチノサイトの層状の層、真皮結合組織、毛嚢のいくつかのタイプ、皮脂腺、立毛筋、血管、および求心性の少なくともダースの異なるクラス（感覚）と遠心性神経を含む多細胞構造物の様々な含まれている繊維（ 図1）。身体の異なる領域は、皮膚の特徴的に異なったタイプに関連付けられています。ほとんどの哺乳類では、ほぼ全体表面が密に毛包が充填されている皮膚で覆われている。 [人間と裸のモルラットは番目の例外を構成するパターンです。]髪はまた特殊な表皮パターン（dermatoglyphs）、外分泌腺、および感覚神経終末に関連している手と足の掌表面から欠落しています。増殖、分化、および毛包内の細胞の空間配置を制御する細胞および分子事象は、器官2の中心機能の多くは、小型で、各卵胞の展示として特に興味深い。これらの機能は、幹細胞の存在と幹細胞ニッチ、正確振り付け細胞の移行、および発生学の異なるコンポーネントから多細胞構造のアセンブリを含む。
この記事では、完全な2次元のシートとして、定着、ラベル付け、およびイメージングマウスの皮膚を切開するための方法を説明し、「全体のマウント」または「マウントフラット」の準備と呼ばれる。マウスの皮膚が比較的薄いので、平坦化されたスキー板の全厚を通って画像化することが可能であるnは、従来の共焦点顕微鏡を用いて。哺乳動物の皮膚を撮像するためのフラットマウントアプローチ、それによって構造が光学セクショニングによって完全に再構成することができるように、物理的なセクショニングの必要性をバイパスするため、技術的に有利である。皮膚のほぼ全体が単一のオブジェクトとして処理されるため、本体の軸に相対的な位置姿勢についての情報を保存しながら、フラットマウントアプローチは、体表面の複数の領域の画像化を容易にする。最後に、皮膚内の構造は、典型的には、このように所定の構造の複数の代表者からの画像の収集を容易にする、一定の間隔で繰り返されるパターンで存在する。これらの特性は、網膜ニューロンの形態3の研究のために類似の利点を享受し、中枢神経系の二次元部分で動作神経生物学者にはよく知られている。
ここで説明するフラットマウントのアプローチは、特別なUTILITある皮膚の二次元平面内の比較的大規模に空間的構成を示す構造を研究するためのy。メルケル細胞クラスター、立毛筋、皮脂腺、および神経終末4 -大規模空間的構成の一例としては、毛包や毛包関連構造の協調極性である。毛包、皮膚の平面に対してある角度で配向され、皮膚の2次元平面内にある毛包ベクトルの成分は、一般に、正確に決定されるごとに、本体軸に対して配向を呈するている身体上の位置。例えば、足の背側表面に尾する吻側および毛髪からのバックポイントの毛包は、近位から遠位を指す。毛嚢の向きは、平面細胞極性シグナル伝達によって制御される（PCP;とも呼ばれる組織極性5）。この信号システムは、小さなショウジョウバエで発見されましたコアPCP遺伝子のセットは、クチクラの毛と毛の向きを制御することが見出された。三つの哺乳類コアPCP遺伝子のオルソログ- （もFZ6とも呼ばFZD6、）のfrizzledホモログ6、のEGF LAG 7パスGタイプ受容体1（CELSR1を ）カドヘリン、およびバング様2（Vangl2は ） -哺乳類に類似した役割を果たしている皮膚、身体の軸を毛嚢の向きを調整する。 FZ6ノックアウトマウス（ - / - FZD6 tm1Nat、以下FZ6と称する）の研究は、PCPシグナル伝達の非存在下で一次欠陥は、卵胞の固有の構造に影響を与えず、毛包の向きの初期ランダム化又は無秩序であることを示す6-8。第二の非PCPシステムは、渦巻きや房のような大規模なヘアパターンの生成をもたらす近くの卵胞のローカルアラインメントを促進するために後で役割を果たします。
大規模の第二の例皮膚内の空間的構成は、感覚軸索アーバーの形態を見られます。皮膚を支配する感覚ニューロンは、脊髄後根および三叉神経節に細胞体を持っている。これらのニューロンは、温度、疼痛、かゆみ、皮膚や毛髪9に衝突する機械的変形の様々なタイプを検出する。これらは、軸索の直径および伝導速度、末端神経終末の構造、および受容体、チャネル、および他の分子の発現のパターンに基づいて亜型に分けることができる。そのため皮膚内神経支配の高密度のため、（単一の細胞型は蛍光レポーターの発現によってマークされているときに見られるように）それはすべての軸索（ 例えば 、抗ニューロフィラメント免疫染色）、または単一のクラスであっても、すべての軸索を可視伴う分析する一般的には不可能個々のアーバの形態を定義することが軸索の密な重ね合わせが明らかになった。この問題を回避するために、我々は非常に疎な遺伝的突然変異リットルを使用しているabelingは、個々の十分に単離された軸索アーバは組織化学的レポーター、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ10の発現によって可視化された背部皮膚サンプルを作製した。このアプローチは、個々の軸索アーバの形態を明確に可視化し、形態学的基準に基づいて、体性感覚ニューロンの種類を定義できます。
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Protocol
この研究は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドの推奨事項に厳密に従って実施された。動物のすべてが承認された制度的動物管理使用委員会ジョンズホプキンス医療機関（IACUC）プロトコルMO11M29に従って取り扱った。安楽死の承認された方法については、地域機関動物実験委員会のガイドラインを参照してください。アルデヒド固定剤や有機溶剤を取り扱う際は手袋、白衣、および安全メガネを着用してください。
材料の1。準備
- シルガードプレートを注ぐ
- メーカーの指示に従って、ベースと硬化剤を混合し、プラスチック製の棒でかき混ぜる。
- 直径10cmの組織培養皿あたりピペットは、〜35ミリリットルの液体シルガード。組織培養皿は、標準的な細菌の料理よりも深い。これは虫ピンの垂直クリアランスを提供しています。
- ディを配置室温で一晩水平面にシーズ。混合中に形成された気泡が消えます。
- 重合後、室温でシルガードプレートを格納します。
NOTE：シルガードプレートから外れるまでシルガードプレートを複数回年間、室温で保存し、再使用することができる。
- ソリューション
- 安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール（BBBA）。 2ボリューム安息香酸ベンジル、1ボリュームベンジルアルコールを混ぜる。ガラス栓やテフロントップとガラス瓶内の暗所に保管してください。
注意：BBBA使用され、適切な有機溶剤の廃棄物として処理する必要があります。 BBBAプラスチックを接触させないでください。 - リン酸緩衝食塩水（PBS）。 4グラムPFA 80ミリリットルの水を加えて0.1 mlの1 NのNaOHを追加し、PFAが完全に溶解するまで約5分間〜70°Cのホットプレート上で撹拌し、次いで10ミリリットル10×PBSを添加し、100にボリュームをもたらす水を入れた。
注意：ホルムアルデヒド/ PFAとBBBA蒸気を吸入すると、あるべきふた付きの容器にこれらのソリューションを保つことによって最小化。ホルムアルデヒド/ PFAは発がん性物質である。 - オイルレッドOをイソプロパノール中の0.5％の株式を準備します。使用直前に、0.3％オイルレッドOの最終濃度まで水で希釈し、その後0.2μmのフィルターを通して濾過する。
- 安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール（BBBA）。 2ボリューム安息香酸ベンジル、1ボリュームベンジルアルコールを混ぜる。ガラス栓やテフロントップとガラス瓶内の暗所に保管してください。
2。皮膚の解剖、固定、クリア
- 免疫染色およびメラニンイメージングのための背部皮膚
- 非常に若いマウス（ 例えば 、胎児や生後（P）0-P3の仔）の場合は、イソフルラン吸入によりマウスを安楽死させる。イソフルラン吸入により、または頸椎脱臼が続くケタミン/キシラジン注射により高齢のマウスを安楽死させる。
- 電気かみそりや脱毛ゲルで毛を取り除きます。 P8より若いマウスでは、このステップは省略することができる。
- 耳と最後まで横方向に進む、各肢の基部の背側を通る、各脇腹に沿って尾の付け根から水平カットを作るためにカミソリの刃を使用して、鼻でING。
- 軽く鉗子に挟まれないように手袋をした指の間の皮膚を保持することによって前方の後方から、下にある組織の進行から肌をはがします。耳のレベルで皮膚を剥離する際に、最初にハサミで耳を切断し、皮膚はこの位置で引き裂くことができるように、特にゆっくりと進んでください。
- この時点から以降は、上に向けて内部で皮膚を向けます。ピンに均等に周囲等間隔〜20虫ピンでシルガード皮膚;皮膚（ 図2B）をオーバーストレッチしないでください。 PBSの10〜20 mlの肌をカバーしています。
- 鉗子は、皮膚に浸透するリスクを最小限に抑えるために水平に対向する鉗子の先端に傾斜または湾曲鉗子を使用して皮膚に関連する脂肪および結合組織を解剖離れる。優しく皮膚表面上の綿棒を転がすことにより、皮膚の下に閉じ込められている気泡を押し出す。
注：肌が起こっている場合フラットマウント免疫染色または組織化学に使用される、可能な限り結合組織のできるだけ多くを除去する;皮膚のメラニン色素沈着に基づいて、毛包を可視化するために使用されようとしている場合には、結合組織の少ない完全な除去が良好である。出生前の皮膚が付着し、結合組織の最小限の「クリーニング」を必要とします。 - 10センチメートルシルガードプレートあたり20の新たに調製した4％PFA / PBSのmlまたは10％緩衝ホルマリンを添加することによって固定さ皮膚を修正するか、新たに調製した20mlの（皮膚のメラニンイメージング又はアルカリホスファターゼ（AP）組織化学のために使用される場合） 2％PFA / PBS（皮膚が免疫染色や可視化トランスジェニックケラチン（KRT）17-GFP 11に使用される場合）、ゆっくり低温室で一晩回転させます。次の日、> 10分間、PBSで洗浄します。
注：標準ホルマリンは37％ホルムアルデヒドである。従って、「10％ホルマリン」は、3.7％ホルムアルデヒドである。 - AP染色および免疫染色については、セクション3に進んでください。メラニンIMAGの場合ING、室温で穏やかに水平回転して、ステップごとに一日、段階的エタノールシリーズ（70％、95％、100％）を通って皮膚を脱水する。残留結合組織を除去します。
- 100％エタノール中で皮膚に、昆虫のピンを取り外して、所望であれば、ピンホールで皮膚の最も外周1〜2ミリメートルを除去するためにハサミで皮膚をトリム。
- 10cmの直径のガラス皿に皮膚を転送カールするのを防ぐために皮膚上の2つの顕微鏡用スライドガラスを置き、20mlのBBBAを加える。皮膚はBBBAを追加する前に、ガラススライドの重みで平坦化することが重要であるので、BBBAは急速に組織を硬化する。
- 次の数時間にわたり、BBBAが皮膚上洗うことができるように数秒間皮膚からスライドを持ち上げます。
注：BBBAで作業する際は手袋を着用してください。皮膚の年齢や場所によってBBBAにおける最大30％の収縮がある場合もあります。
- 毛包パットの分析のための足の皮rning
注：一般的に調べた年齢の範囲は、P1〜P8である。- 安楽死の後、足の足関節の上に切断し、足の裏を通して腹面に沿って単一ストレートカットを行います。
- そっと近位から遠位の方向に進んで、下にある組織から皮膚をはがします。
- 肌を解放します（ 図2C）を上に向けて内面とシルガードするためにそれをピンに数字を切る。足の皮膚に最小限の結合組織があります。
- トランスジェニックKRT17-GFPの肌になりましたイメージングのための準備ができました。 2.1節で説明したようにメラニンイメージングのための固定、脱水、BBBAクリアを進める。
- 可視化皮脂腺のための足の皮
- 安楽死の後、手袋をはめた指と親指で皮膚の表面上の毛リムーバージェルを擦って毛を取り除く; 10分間待ちます。
注：デリケートな足のお肌にダメージを与えます電気かみそりを使用しないでください。 - W水道水で皮膚表面を灰、2.2節で説明したようにシルガードに皮膚を解剖し、ピン。
- 室温で30分間、1％PFA / PBSで固定し、次いでPBSで洗浄する。
注：これが最初の毛周期12の間に毛の色素沈着の最下点をマークしているため、皮脂腺ため、最初の出生後の週後に発症するフィート、上の皮脂腺を可視化するため、オイルレッドOを用いた分析のための最適な年齢は、P21ですより容易に見ることができる。アルビノマウスを用いたこの分析は、どの年齢でも行うことができた。アルビノの子孫を得るためにこのようなC57BL/6J-TyrのC-2Jなどのチロシナーゼ突然変異体のラインに着色された変異マウスを渡ります。
- 安楽死の後、手袋をはめた指と親指で皮膚の表面上の毛リムーバージェルを擦って毛を取り除く; 10分間待ちます。
- メラニン分布解析、毛包の向き、皮脂腺の可視化のための尾皮膚の準備
- 安楽死の後、尾の付け根の周りに円形のカットした後、その腹面に沿って尾の長さを実行する縦スリットを作る。 <李>しっかりテール骨および/または1ピンセットや鉗子の第二の対と皮膚と結合組織の先端をつかんで、先端から始まる尾の皮膚をはがし。シルガードに尾の皮膚をピン。
- 2.1節で説明したようにメラニン分布と毛包の向きの分析のために、皮膚を固定し、処理します。皮脂腺の分析のために、一連のセグメントへの尾の皮膚をカット約0.5〜1固定前に、長さがCMと真皮-表皮の接着13を弱めるために37℃で一晩、PBS / 5 mMのEDTA中の皮膚片をインキュベートする。
- そっと、真皮から表皮を剥離シルガード（内面まで）に表皮をピン、室温で1時間、4％PFA / PBSに固定します。 PBSで洗浄し、以下に述べるように、オイルレッドOで染色する。
注：電気かみそりおよび/ または脱毛ゲルは、前の古い尾の皮膚（ 例えば 、P21）を解剖に使用することができますが、尾の毛ではないので、この治療法はオプションです体の他の部分にできるだけ密。
3。染色反応
- 遺伝的に標識された軸索アーバー10,14,15（ 図3A、B）を視覚化するために、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（AP）組織化学
- シルガード上のPFA固定後、10cmのガラス皿で修正スキンを配置し、PBS / 1のMgCl 2の下に沈める。穏やかに内因性ホスファターゼ活性を破壊するために90分間70℃の水浴中で皿を回転させる。
- 通常は、10〜15を使用して、0.1 Mトリス、pHは9.5、0.1MのNaCl、50のMgCl 2、0.34μg/ mlのNBT、および0.175μg/ mlののBCIP、室温で4-48時間培養して組織化学的に、APレポーター活性を可視化するP21の背部皮膚あたりの染色溶液1ml。非特異的NBT沈着を基準に軸索染色強度の目視検査によって判断されるようにそれは、最適な時間より先に進ませないように注意しながら、解剖顕微鏡下で反応をモニターする。 1時間かけてのPBS/0.1％のTween-20を3回交換して洗浄することにより反応を停止、シルガードへの再ピンスキン、エタノール系列を通してスキンを脱水してからで10cmの皿にスキンを転送BBBA。
注：BBBAゆっくりNBT沈殿物を溶解する。 BBBAの最初の数時間の間に、沈殿したNBTの細かい背景が溶解する。結果として、BBBA溶液が暗くなり、肌が明るくなります。数時間後に新鮮なBBBAに変更します。 - AP染色された皮膚を画像化した後、室温で> 1時間エタノールに転送した後、-20℃で新しいエタノールに保管AP染色されたスキンは、信号の損失なしに何ヶ月も、このように保存することができます。
- オイルレッドO染色は皮脂腺4（図3C-F）を可視化するために、
- 昆虫でピンを取り外し、6ウェル組織培養プレートのウェルにシルガード板から軽く固定し、足または尾スキンを転送する、とウェル当たり2の皮膚試料まで。 60:40イソプロパノールで洗浄した：水を室温で5分間。
- 2時間室温で水（セクション1.2を参照）。60:40イソプロパノール中2ミリリットルの0.3％オイルレッドOでの染色。
- 60:40イソプロパノールで洗浄した：水洗浄、続いて室温で5分間、水、。皮膚の表面は、できるだけ平坦にすることができるように、慎重に微細なハサミで、ピンホールを含む皮膚のエッジをトリミングする。
- 上を向く外面にスライド上に皮を置き、水または水性封入剤を数滴を追加し、カバーガラスで皮膚をカバーし、その後、やさしく、さらに肌を平らにするためにスライドにカバースリップをテープで固定します。
- フラットマウント免疫染色4,16,17（ 図3G、H）
- 非対称カット（ 例えば 、前方右上のクリップ）で、その向きをマーク、PFA固定皮膚（ 例えば、1センチメートル×0.5センチメートル）の矩形をカット。インキュベーションを行い、回転水平プラットフォーム上で穏やかに回転して手順を洗う。 6ウェル中 - または12 - ウェル組織培養プレートのhr 5-8にわたってPBSの〜10の変更0.3％トリトンX-100（0.3％PBST）で洗浄し、残留PFAを除去するためにPBSで数回洗浄皮膚を透過するため、室温。
- 室温で5日間、5％ヤギ血清および20％DMSOと0.3％PBST中で一次抗体と共にインキュベートする。蒸発損失を排除するために明確なテープや接着剤をプラスチックでプレートのウェルをカバーしています。
- 5-8時間かけて0.3％PBST 10-15の変化で洗浄し、室温で3日間、5％ヤギ血清および20％DMSOと0.3％PBSTで二次抗体と共にインキュベートする。
- 5-8時間かけて0.3％PBSTを10月15日の変更で洗うこと。
- 各5分間および20分間ずつ3回、次いで100％メタノール中で、25％、50％、および75％メタノール中で脱水する。
- 室温で一晩BBBAをクリア。
注：フラットよりも若い肌の免疫染色をマウント〜P1は、上述のように、より短いインキュベーションで行い、回洗浄することができる。例えば、P1の皮は、一次抗体での一晩のインキュベーション、二次抗体のいくつかの時間のインキュベーションを用いて免疫染色し、0.3％PBST中だけ2〜3時間の洗浄を介在とすることができます。上述したように、若いスキンはまた、BBBAクリアせずに撮像することができるように十分に薄い。
- 蛍光神経ターミナル色素取り込み（3I-Lは図 ）とメルケル細胞クラスターを可視化する
AMI-43（緑）、AM4-65（赤）は非選択的陽イオンチャネル18を介して細胞に侵入し定着可能な蛍光色素である。生きている皮膚では、これらの染料は、選択的に取り込まれ、メルケル細胞に集中。- -80℃で一定分量中の1 mgのAM1-43またはAM4-65 2mlのPBS中、店舗を溶かす
- 29 G針を用いて、グラム体重あたり2-10μgの染料を皮下新生児を注入する。
- 1日後、マウスやディッセを安楽死させる背の皮をカラット
- 一晩4℃で4％PFA / PBS中でスキンを修正し、PBSで洗浄し、3.2節で説明したように肌をマウントします。
4。イメージングと画像解析
- 画像化する毛包の向き（ 図4）
- 、BBBAに沈め、スライドガラスの下に平らにし、まだガラス皿内にある画像背部、足、または尾の皮に解剖顕微鏡を使用する - この方法では、顕微鏡のBBBA汚染を最小限に抑えることができます。
- 下からお皿を照らす。視野を横切る光強度の空間的変化を最小限に抑えるには、〜10センチメートル解剖顕微鏡の標準作業面上の高さにガラス皿を昇格し、光源の上に拡散プラスチックまたはガラス板を配置します。
- -20℃での長期保存のための100％エタノールに皮膚を返す
注：複数の日BBBAで皮膚のままにしておくと、メラニン顆粒が破損する原因となる一部。肌がBBBAが処理された後は、それは硬く以降、その時点から横ばいになる。それらは冷凍庫にスペースを節約するために、一緒に格納することができるように異なるスキンは、その前方及び/又は後方端で一連のノッチで符号化することができる。
- イメージングおよびトレースアクソンアーバー（ 図3A、B）
- 小さなタンパク質ゲルのために使用されるタイプの2枚のガラス板の間に、AP染色した皮膚（3.1.3項）を配置します。プレートと皮膚との間に気泡を導入しないようしてから、慎重にペーパータオルで余分なBBBAを吸い取る。顕微鏡ステージ（ 図2D）の板皮膚プレートのサンドイッチを置きます。
- 10倍の対物レンズと2μm以上5μmのZ軸のステップを明視野またはDIC照明を使用してください。単一の三次元階調データセットを作成するために縫合されているXY画像のモンタージュを捕捉するために機械化されたXYステージを使用する。
注：単一の大きな軸索アーバの場合、このデータセットであり得る5ギガビットとして大S。 - ソフトウェアのパッケージは、任意の種々の持つ軸索アーバーの、手動の自動化された、または半自動トレースを実行します。
注：（http://www.reading.ac.uk/neuromantic/）などNeuromanticなどのソフトウェアは、PC環境で実行され、10をマスターすることは比較的容易である自由神経細胞の再構築ツールです。
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Representative Results
皮膚のフラットマウントの明視野イメージングは、メラニン色素沈着（ 図4）に基づいて画像の皮膚感覚求心性神経（ 図3A 10）及び毛包パターンに使用することができる。皮膚のフラットマウントの共焦点イメージングは、抗サイトケラチン6、または有する抗可視化AM色素取り込み（3I-Lフィギュア ）、（2）立毛筋、で可視化（1）メルケル細胞クラスターの幾何学的形状を定義するために使用することができるオイルレッドO（ 図3C-F）、および（4）毛包で可視化し、平滑筋アクチン（ 図3G、H）、（3）皮脂腺は、KRT17-GFPトランスジーンまたは抗KRT17抗体で染色して可視化4（ 図3E-G、K、L）。これは、手動では、Adobe PhotoshopやIllustratorを使用して構造上の既知の向きのベクトルを配置してから、quantifyinことにより、このような画像内の構造の向きや空間的配置を獲得することは簡単ですG得られたベクター集団。このアプローチは、数百のベクトルの規模で十分が、10日に法外退屈だろう - あるいはより大きな規模を100倍。
図1。主要な構成を示す哺乳類の有毛皮膚の模式図。（著作権、テレーズウィンスロー。）
図2。シルガードプレート。D）に固定シルガードプレートに固定皮膚切開およびサンプル処理。A）解剖ツール。B）AのP5背部皮膚。C）AのP5背後足の皮膚イメージングのための2ガラスゲルプレートの間に取り付けられた背部皮膚W10倍の対物レンズおよびDICまたは明視野照明番目。
図3。フラットマウントビューで皮膚構造。 、B）は 、単一の皮膚感覚アーバー（左）とBrn3a CKOAP / +のP21の背部皮膚からのトレースされた画像（右）。NFL-クレエ/ +マウスは、妊娠17日目にタモキシフェン低線量にさらされるこのプロトコルは、結果後根神経節ニューロンの非常に小さな画分中のレポーターのCre介在組換えため、皮膚感覚アーバーの小部分は、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（AP）リポーターで標識される。標識された軸索は、NBT / BCIP組織化学で可視化される。Brn3a等価的に、皮脂腺を視覚化するためにオイルレッドOで染色したテール皮膚がPou4f1。C、D）と呼ばれるWT（左）とFZ6 - / - P21の（右）マウス。 FZ6 - / -構造が解体です。 P、近位; 、D、先端E、F）背側の足の皮膚WT（左）とFZ6から- / - KRT17-GFPを運ぶ（右）マウス。皮膚はP21で収穫し、オイルレッドOをFZ6で染色した- / -皮膚はその中心につむじがあります。 P、近位; [抗平滑筋アクチン（SMAを用いて視覚化パネルG）および立毛筋; P21示しKRT17-GFP導入遺伝子および抗GFP免疫染色で可視化し、毛包（AT、WTマウスからD、遠位G、H）背部皮膚）免疫染色;パネルH]。共焦点zスタック画像内の深さは、カラーコード化されている。 、前; P、後部。 イリノイ州）cytokeratin8免疫染色やAM11-43色素取り込みで視覚化メルケル細胞クラスター（）とその中央の毛包は、（パネルKRT17-GとKおよびLで可視化FP）。画像が示される遺伝子型からP1の背部皮膚から得た。 FZ6 - / - WTメルケル細胞クラスタは、前方に向かって開かれているのに対し、メルケル細胞クラスターは、閉じた円を形成している。 、前; P、後部。 スケールバー：AとB、300ミクロン; CとD、500ミクロン; EとF、500ミクロン; GとH、200ミクロン;イリノイ、50μmである。 （パネルAおよびBはeLifeや学会から再生されます。シーディング·ナショナル·アカデミー·サイエンス。アメリカ 、許可4,10で） この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図4。髪とP1とP7の背部皮膚における毛包は、メラニン色素沈着を用いて可視化。 WT及びFZ6から、B）は 、P1の皮- / -マウスからFZ6 C、D）P7スキン- / -マウス。 スケールバー：AとB、500ミクロン; C及びDは1mm。
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Discussion
上記の解剖方法の習得だけ忍耐、着実に手を必要とし、いくつかの良い解剖ツール。背部皮膚切開は比較的簡単ですが、尾や足の皮膚切開 - 特に生後初期の年齢では、 - より困難である。 （E15前など ）の早期出生前年齢で、皮膚はそれを引き裂くことなく除去することは困難である。立毛筋19の成長の研究に見られるように、例えば、好都合なことに、マウスにおける皮膚構造の成長及びパターンの多くの研究のために、関心のあるイベントは、出生後に起こる。
皮膚が比較的屈折性組織であるため、フラットマウント構成で、深い皮膚の中に画像化することは困難である。肌が原因で分化し、その構成層の厚さの増加に成熟するにつれて、この課題が大きくなる。この問題に対する一つの部分的な解決策は、真皮および表皮を分離し、表皮を分析することである独立した構造（「表皮ホールマウント」）のようになる。このアプローチは、特に、マウスの尾の皮膚のために、毛包とそれに関連する構造を視覚化するのに便利です。しかし、マウスの背部皮膚から高品質の表皮ホールマウントを得ることはおそらく、真皮に深く延びる毛包の（1）高密度および毛包間表皮13の（2）の薄さに、困難である。
我々の経験では、BBBA処理は、表皮および真皮層を分離する必要なしに免疫蛍光シグナルを維持しながら、光学的に透明な皮膚をレンダリングするための非常に有効な方法である。ベンジルベンゾエートは、数十年20のための組織をクリアするために使用されており、それが広く、カエルや魚の胚をクリアするために使用されている。しかしながら、BBBAそれはGFPおよび他の蛍光タンパク質を変性するという欠点を有し、それはオイルレッドOを溶解し、それは（ 例えば 、顕微鏡）装置を汚染する可能性がある。それがinteresであろう体系的なSeeDB 21、ClearT 22、スケール23、3DISCO 24、および蛍光タンパク質と互換性があり、そのいくつかの明快25などの他の浄化方法で皮膚のBBBA治療を比較するためのT。 BBBAサンプルを処理した場合、解剖顕微鏡を用いて結像される従来の発光/蛍光顕微鏡、または共焦点顕微鏡であり、試料をガラス皿の中又はBBBA汚染を最小限にするには、2つの大型のガラス板の間に配置されるべきである。
これは調査中の生物学的な質問へのより特異体質であるように、我々は、任意の詳細にデータ分析を説明していない。はじめに述べたように、しかし、これらの構造はフラットマウントで画像化することが可能なそのような毛包、メルケル細胞クラスター、および神経終末、および完全性のような多くのほぼ同一の構造の存在は、構造的または形態学的パラメータを測定する機会を提供統計的に厳密なマサチューセッツ州nner、皮膚感覚軸索の形態10の毛包と野生型およびFZ6変異マウス4,8における卵胞関連構造の最近の研究を例に見られるように。より高度な画像解析ツールの開発と、それは、現在、それによって皮膚のより広い使用を容易にする、手動で実行される分析の一部を自動化または半自動化することが可能である平らな原理を調べるための方法として、イメージングマウント多細胞組織。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP) | Roche | 11383221001 | |
| AM1-43 | Biotium | 70024 | |
| AM4-65 | Biotium | 70039 | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B-6630 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cy3-alpha smooth muscle actin antibody | Sigma | C6198 | 1:400 |
| Cytokeratin-8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-c | 1:500 |
| Dissecting microscope | |||
| Dissection tools | Fine Science Tools | scissors and forceps | |
| Electric razor | |||
| Fluoromount G | EM Sciences | 17984-25 | |
| Formalin | Sigma | HT501320 | |
| Glass dishes | Pyrex | 6 cm and 10 cm diameter | |
| Glass plates | Amersham Biosciences | SE202P-10 | 10 cm x 8 cm x 1 mm |
| Hair remover | Nair | ||
| Horizontal rotating platform | Hoefer | PR250 Orbital shaker | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma | K113 | |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Roche | 11383213001 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| Secondary antibodies | Invitrogen | Alexa-dye conjugated | |
| Sylgard-184 | Fisher Scientific | NC9020938 | |
| Tissue culture plastic dishes | 10 cm diameter | ||
| Tissue culture plates | 6- and 12-well |
References
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