Summary
Leukocytes paracellular या transcellular मार्ग का उपयोग endothelial monolayer पार. हम अंतर्जात junctional का वितरण VE-cadherin और PECAM -1 ल्युकोसैट transendothelial प्रवास के दौरान शारीरिक प्रवाह के तहत दो स्थानांतरगमन मार्गों के बीच भेदभाव करने का पालन करने के लिए एक सरल परख का विकास किया.
Abstract
सूजन के दौरान, leukocytes परिसंचरण छोड़ और अंतर्निहित ऊतकों में रोगजनकों हमलावर से लड़ने के लिए अन्तःचूचुक पार. इस प्रक्रिया ल्युकोसैट transendothelial प्रवास के रूप में जाना जाता है. Endothelial monolayer पार करने leukocytes के लिए दो मार्गों में वर्णित किया गया है: यानी सेल सेल जंक्शनों और transcellular मार्ग, के माध्यम से paracellular मार्ग, यानी, endothelial सेल शरीर के माध्यम से. हालांकि, यह पैरा और transcellular मार्ग के बीच विभेद करने के लिए तकनीकी रूप से कठिन रहा है. हम अंतर्जात का वितरण VE-cadherin और PECAM -1 शारीरिक प्रवाह परिस्थितियों में न्युट्रोफिल transendothelial प्रवास के दौरान अध्ययन करने के लिए एक सरल इन विट्रो परख का विकास किया. न्युट्रोफिल छिड़काव करने से पहले, endothelial कोशिकाओं संक्षिप्त VE-cadherin और PECAM-1 के खिलाफ fluorescently लेबल एंटीबॉडी के साथ इलाज किया गया. विद्युत सेल substra द्वारा निर्धारित किया गया था के रूप में ये एंटीबॉडी, दोनों प्रोटीन के समारोह के साथ हस्तक्षेप नहीं कियाते प्रतिबाधा संवेदन और FRAP माप. इस परख का उपयोग करना, हम अंतर्जात का वितरण प्रवाह शर्तों के तहत transendothelial प्रवास के दौरान और PECAM-1-cadherin VE और अन्तःचूचुक भर leukocytes के पैरा और transcellular प्रवास मार्गों के बीच भेदभाव का पालन करने में सक्षम थे.
Introduction
कुशल और कसकर नियंत्रित ल्युकोसैट transendothelial माइग्रेशन (मंदिर) इस तरह के प्रतिरक्षा निगरानी और तीव्र सूजन के रूप में शारीरिक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण महत्व का है. हालांकि, कुछ Patho शारीरिक शर्तों के तहत, अनियंत्रित और अत्यधिक मंदिर जीर्ण सूजन रोगों (जैसे, रुमेटी गठिया, atherosclerosis, अस्थमा) में जिसके परिणामस्वरूप मनाया जाता है. ट्यूमर कोशिकाओं को 1-3 metastasize को प्रचलन छोड़ने के लिए भी ट्यूमर सेल मेटास्टेसिस के दौरान, transendothelial प्रवास की प्रक्रिया महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है. विशेष रूप से अत्यधिक ल्युकोसैट या ट्यूमर सेल मंदिर के साथ हस्तक्षेप करने के लिए, इस प्रक्रिया के विनियमन की एक विस्तृत समझ की आवश्यकता है.
यह मंदिर प्रक्रिया विभिन्न चरणों के माध्यम से होता है कि माना जाता है. कसाई और स्प्रिंगर ने दो दशक पहले की समीक्षा की मौलिक अध्ययन, मंदिर 4,5 की प्रक्रिया का वर्णन multistep मॉडल का नेतृत्व किया. यह मॉडल अभी भी कुछ विज्ञापन हालांकि, सच हैपारंपरिक चरणों 6 शामिल किया गया है. Alon एट अल. अन्तःचूचुक 7 की सतह पर स्थिर chemokines की उपस्थिति के लिए जरूरत का वर्णन किया. हाल ही में, वे अन्तःचूचुक ही endothelial शिखर सतह 8 में प्रस्तुत कर रहे हैं जो chemokines उत्पन्न करता है कि पता चला है. इसके अलावा, एक ही समूह के मंदिर 7 दौरान प्रवाह की स्थिति के महत्व पर बल दिया. हाल ही में, दो अलग अलग मार्गों leukocytes पर केंद्रित कई प्रकाशनों मंदिर की अंतिम diapedesis स्तर पर ले जा सकते हैं. वे, यानी, सेल सेल जंक्शनों के माध्यम से paracellular माइग्रेशन मार्ग जाना, या transcellular माइग्रेशन मार्ग 9 के रूप में जाना endothelial सेल शरीर के माध्यम से पार कर सकते हैं या तो. गाड़ीवान और उनके सहयोगियों ने विस्तार से इन रास्ते का अध्ययन किया और एक नाल की नस endothelial monolayer 10 पार कर जब leukocytes preferentially transcellular मार्ग (10%) से अधिक paracellular माइग्रेशन मार्ग (90%) का चयन संपन्न हुआ.हालांकि, अन्य मूल से endothelial कोशिकाओं का उपयोग किया गया है जब, जैसे, मस्तिष्क या microvasculature, अधिक leukocytes transcellular मार्ग (30%) 11 का इस्तेमाल किया. एक VE-cadherin-अल्फा catenin के लिए कल्पना Vestweber समूह ने हाल ही में सेल सेल जंक्शनों अंतर्जात की जगह, एक दस्तक में पशु मॉडल का उपयोग करके एक दूसरे से अलग कर देना करने में असमर्थ थे जब कि VE-cadherin दिखाया, ल्युकोसैट मंदिर पूरी तरह से 12 ब्लॉक किया गया था . हैरानी की बात है, लेखकों मंदिर कई में अवरुद्ध है, लेकिन सभी नहीं, ऊतकों था कि देखा. कुल मिलाकर, इन सुरुचिपूर्ण प्रयोगों इस निर्णय को ट्रिगर कि नियामक संकेत अभी भी अज्ञात है, हालांकि leukocytes, transcellular मार्ग पर paracellular मार्ग वरीय कि संकेत दिया.
Leukocytes के बहुमत paracellular प्रवास मार्ग को पसंद करते हैं, भले ही यह दोनों रास्ते के बीच विभेद करने के लिए अभी भी मुश्किल है. Endothelial सेल सेल junct की भूमिका पर ध्यान केंद्रित कई अध्ययनों के बावजूद कि के अलावा,आयनों, इन जंक्शनों की गतिशीलता, विशेष रूप से junctional प्रोटीन VE-cadherin और PECAM -1, ल्युकोसैट पार बहस के तहत अब भी है के दौरान. हम इन जंक्शन अणुओं fluorescently लेबल एंटीबॉडी का उपयोग शारीरिक प्रवाह परिस्थितियों में ल्युकोसैट diapedesis दौरान वास्तविक समय में निगरानी रखी जा सकता है जिसमें एक अपेक्षाकृत सरल परख का विकास किया. ये एंटीबॉडी के साथ हस्तक्षेप या लक्षित प्रोटीन की junctional अखंडता या गतिशीलता को ब्लॉक नहीं किया. इस परख हमें paracellular मंदिर की प्रक्रिया के दौरान junctional प्रोटीन की गतिशीलता का पालन करने की अनुमति देता है. साथ ही, यह परख भी पैरा और transcellular प्रवास मार्गों के बीच भेदभाव की अनुमति देता है.
Protocol
न्यूट्रोफिल एक सूचित सहमति पर हस्ताक्षर किए हैं, जो स्वस्थ स्वयंसेवकों से अलग थे. अनुसंधान मानव कल्याण के लिए संस्थागत और राष्ट्रीय दिशा निर्देशों के अनुपालन में किया गया है.
1 चढ़ाना और मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं के रखरखाव
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार संस्कृति मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं (HUVECs). फ़ाइब्रोनेक्टिन पर HUVECs बढ़ो (एफ एन) मीडिया का उपयोग (Demineralized पानी में भंग कर 10 माइक्रोग्राम / एमएल) व्यंजन लिपटे (endothelial वृद्धि मध्यम (ईजीएम -2) SingleQuots साथ पूरक Endothelial बेसल मध्यम (EBM-2) मध्यम). प्रयोगों के लिए 4-8 मार्ग के बीच सेल संस्कृति का प्रयोग करें.
- दिन 1: 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 2 घंटे के लिए फ़ाइब्रोनेक्टिन के 100 μl (पीबीएस में 10 माइक्रोग्राम / एमएल) और 5% सीओ 2 के साथ कोट प्रवाह कोठरियों.
- दिन 2: कोशिकाओं 80-90% संगम तक पहुँचते हैं, आरटी फॉस्फेट बफर खारा के साथ सावधान धोने के बाद कोशिकाओं trypsinize (पीबी एस) 7.4 पीएच, मीडिया का इस्तेमाल 800,000 कोशिकाओं / एमएल पर 800 XG पर अपकेंद्रित्र और resuspend. प्लेट 80,000 एफ एन लेपित प्रवाह कक्षों की हर एक चैनल में कोशिकाओं और धीरे से ऊपर और नीचे सेल निलंबन पिपेट. एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर और 5% सीओ 2 में संस्कृति ओ / एन.
- दिन 3: धीरे एक 45 डिग्री के कोण पर स्लाइड झुकने से प्रवाह चैम्बर स्लाइड में मीडिया को ताज़ा करें. (चित्रा 1 ए देखें).
नोट: यह केवल जलाशयों में नहीं है और चैनल अपने आप में मीडिया को दूर करने के लिए सिफारिश की है. चैनलों में मीडिया को हटाने के कारण pipetting की वजह से मीडिया की खींच बल को endothelial सेल नुकसान और मौत में परिणाम हो सकता है. - Endothelial कोशिकाओं एक monolayer (यानी, 100% मिला हुआ) का गठन किया है, तो चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा जाँच करें. कोशिकाओं 100% मिला हुआ नहीं हैं, तो वे 100% संगम तक पहुँचने तक, एक दिन मीडिया को दो बार बदल जाते हैं.
- कोशिकाओं confluency तक पहुँच चुके हैं एक बार, (कदम देख मीडिया के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित1.1) भड़काऊ मध्यस्थ (TNF-α (10 एनजी / एमएल) युक्त). , अन्तःचूचुक की एक भड़काऊ फेनोटाइप में TNF-α परिणामों के साथ HUVECs हे / एन (यानी, 12 घंटा) उत्तेजक यानी., ऊपर विनियमन ऐसे ICAM-1 और Vcam-1 के रूप में 13 सेल आसंजन अणुओं की.
Percoll अनुपात का प्रयोग 2 Polymorphonuclear ल्युकोसैट अलगाव
- Polymorphonuclear leukocytes (PMN) को अलग करने से पहले: N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic एसिड (प्रवाह बफर इसके बाद कहा जाता है) (HEPES) -buffer तैयार करें. प्रवाह बफर अलग PMNs धोने के लिए इस्तेमाल किया जाता है और प्रवाह परख में बफर के रूप में. प्रवाह के बफर तैयार करने के लिए: 7.72 ग्राम सोडियम क्लोराइड (132 मिमी), 4.76 ग्राम HEPES (20 मिमी), 0.45 छ KCl (6 मिमी), 0.25 छ 4 MgSO • 7 2 हे (1 मिमी), कश्मीर 2 HPO 4 • 3H पतला 2 हे Demineralized पानी का 1 एल में (1.2 मिमी) और (इस शेयर कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है) 7.4 पीएच को समायोजित करें.
- ताजा 100 μl 1 एम 2 CaCl & # जोड़ें160, (1 मिमी), 2.5 मिलीग्राम एक 200 छ / एल शेयर एकाग्रता 100 मिलीलीटर (0.5% वी / वी) और 0.1 ग्राम ग्लूकोज से मानव एल्बुमिन (डब्ल्यू 0.1% / वी) प्रवाह बफर की. इसके बाद, एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग प्रवाह बफर फिल्टर. नोट: इस प्रवाह के बफर हर प्रयोग के लिए नए सिरे से तैयार करने की जरूरत है.
- पहले PMN के अलगाव के लिए, पीबीएस, पीएच 7.4 में 10% trisodium साइट्रेट (टीएनसी) समाधान तैयार है.
- एक स्वस्थ स्वयंसेवक से सोडियम heparine vacuettes में पूरे रक्त का 20 मिलीलीटर लीजिए. 50 मिलीलीटर ट्यूब में 10% पीबीएस / टीएनसी के साथ 1 और पिपेट 20 मिलीलीटर ((छ / एमएल 1.130 के घनत्व के साथ पानी में कोलाइडयन समाधान) डब्ल्यू / डब्ल्यू 23%) 12.5 Percoll की मिलीलीटर पर ध्यान से खून पतला: पूरे रक्त 1 पतला एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब में. ध्यान अपकेंद्रित्र में ट्यूबों की जगह और 800 कम त्वरण के साथ XG और आरटी पर सेट नहीं तोड़ने पर 20 मिनट के लिए स्पिन.
नोट: Percoll पतला खून जोड़ने, एक 45 डिग्री कोण में Percoll युक्त ट्यूब झुकाव और धीरे ट्यूब बुद्धि में पतला खून पिपेटज धीरे पिपेट लड़का सेटिंग. - सभी तरल निकालें और बाद में 500 मिलीलीटर ठंडा एरिथ्रोसाइट lysis बफर (4.15 छ एनएच 4 सीएल [0.155 एम], 0.5 ग्राम KHCO 3 [0.01 एम] और 18.5 मिलीग्राम EDTA (triplex तृतीय) [0.1 मिमी] के साथ ट्यूब भरना ) ठंडा एच 2 ओ की एरिथ्रोसाइट्स lyse करने के लिए. निलंबन सक्षम टूट के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए centrifugation 500 XG द्वारा पीछा गहरे लाल, बदल जाता है जब तक, कभी कभी ट्यूब inverting, बर्फ पर ट्यूब छोड़ दें.
नोट: गोली अंश एरिथ्रोसाइट्स के साथ एक साथ PMNs (neutrophils, इयोस्नोफिल्स, basophils) शामिल हैं. - सतह पर तैरनेवाला निकालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर ठंडा lysis बफर में दो बार गोली धोने.
- आरटी पर प्रवाह बफर के साथ गोली Resuspend और एक hemocytometer या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग PMNs एकाग्रता का निर्धारण. 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल में प्रवाह के बफर में PMNs सस्पेंड और आरटी पर रहते हैं.
Endothelial जंक्शन से 3 लेबलअल VE-cadherin और PECAM-1
- एक 1 पर PECAM एलेक्सा Fluor 647 एंटीबॉडी (क्लोन WM59) जोड़ें: एक 1:50 कमजोर पड़ने HUVEC के लिए संस्कृति के माध्यम से कम 100 कमजोर पड़ने और कैल्शियम स्वतंत्र VE-cadherin-FITC एंटीबॉडी (क्लोन 55-7H1), (1.1 कदम देखें) और पूर्व शारीरिक प्रवाह परिस्थितियों में न्युट्रोफिल स्थानांतरगमन दौरान endothelial कोशिकाओं की junctional गतिशीलता कल्पना करने के लिए प्रवाह प्रयोग शुरू करने के लिए 30 मिनट के लिए सेते हैं.
नोट: प्रवाह कोठरियों को सीधे लेबल एंटीबॉडी जोड़ने से पहले, हर चैनल में मात्रा 100 μl से अधिक नहीं है कि यह सुनिश्चित करें. यह संभव के रूप में कम एंटीबॉडी का खर्च रखने में मदद करता है.
4 PMN मंदिर परख के तहत फ्लो
- पूर्व प्रवाह प्रणाली में उन्हें इंजेक्शन लगाने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए एक पानी के स्नान में PMNs रखें.
- वें सेट करते समय एक खाली प्रवाह चैम्बर के लिए टयूबिंग कनेक्ट और के गठन को रोकने के लिए (जैसे, 37 डिग्री सेल्सियस) प्रवाह बफर गर्म (देखें कदम 4.3) के साथ भरने हवा के बुलबुलेई प्रवाह प्रणाली.
- एक 20 मिलीलीटर सिरिंज युक्त सिलिकॉन टयूबिंग का उपयोग करके सिरिंज पंप प्रवाह प्रणाली के लिए एक खाली प्रवाह चैम्बर के एक तरफ से कनेक्ट, और माइक्रोस्कोप चरण में प्रवाह चैम्बर डाल दिया.
- 37 डिग्री सेल्सियस प्रवाह बफर (चित्रा 1 बी) के साथ भरा जलाशय कुप्पी के लिए एक खाली प्रवाह कक्ष के दूसरी ओर कनेक्ट और प्रवाह के बफर के साथ सभी ट्यूबिंग भरने के क्रम में सिरिंज पंप शुरू. पंप सिरिंज में प्रवाह कक्ष के माध्यम से जलाशय से प्रवाह के बफर खींच लेंगे. नोट: इस ट्यूबिंग भी प्रवाह को रोकने और हवा बुलबुले बनाने के बिना PMNs एक चल प्रयोग में एक सुई के साथ इंजेक्शन की अनुमति देता है जो एक में लाइन Luer इंजेक्शन बंदरगाह, शामिल हैं.
- TNF-α इलाज HUVECs युक्त प्रवाह चैम्बर के साथ खाली प्रवाह चैम्बर बदलें, प्रवाह बफर युक्त टयूबिंग कनेक्ट और खुर्दबीन मंच (चित्रा 1C) में जगह. रखती है और reconnecting से पहले ट्यूब चुटकीबंद बन्द रखो के रूप में नहीं, HUVECs युक्त कक्षों एम ट्यूबिंग और / या प्रवाह कक्षों के अंदर हवा के बुलबुले के गठन में हो सकता है.
- पोस्ट केशिका venules में शारीरिक प्रवाह की गति के अनुसार, 1 DYN / 2 सेमी करने के लिए प्रवाह की गति को समायोजित (1-5 DYN / 2 सेमी).
- रिकार्ड अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी), FITC (488 एनएम) और एलेक्सा Fluor 647 (647 एनएम) एक साथ एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग का उपयोग.
- PMNs 1 मिलीलीटर सीरिंज का प्रयोग करने में लाइन Luer इंजेक्शन बंदरगाह (चित्रा -1) के माध्यम से धीरे धीरे प्रवाह प्रणाली में (कदम 4.1) इंजेक्षन.
- कुछ ही मिनटों के बाद, leukocytes पालन करना है, और बसना, दिखाई देते हैं. प्रवाह के चेंबर में प्रवाह चैम्बर और pipetting लगानेवाला (पीबीएस में 3.7% formaldehyde) से ट्यूबिंग रखती द्वारा किसी भी इच्छित समय पर प्रयोग बंद करें. 10 मिनट के लिए निर्धारण की अनुमति दें, पीबीएस के साथ धोने से पीछा किया. डाटा इमेजिंग सॉफ्टवेयर (सामग्री और उपकरण तालिका देखें) का उपयोग करते हुए विश्लेषण किया है.
नोट: 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर एक लगातार तापमान के साथ एक जलवायु चैम्बर से लैस एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग, और एक 63X उपयोग कर वह प्रयोग तेल उद्देश्य को पूरा करें.
Representative Results
एंटीबॉडी अन्तःचूचुक की बाधा समारोह के साथ हस्तक्षेप नहीं किया तो हम पहले परीक्षण किया. हम बिजली सेल सब्सट्रेट प्रतिबाधा संवेदन (ECIS) का उपयोग करके endothelial monolayers के विरोध को मापा. जानकारी के लिए, वान Buul एट अल. 13 विरोधी VE-cadherin fluorescently लेबल एंटीबॉडी कोशिकाओं (चित्रा 2A) जोड़ा गया है जब प्रतिरोध में कोई परिवर्तन नहीं देखा गया है देखते हैं. ब्लॉक करने के लिए अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त है कि एक विरोधी VE-cadherin एंटीबॉडी समारोह में नाटकीय रूप से (2A चित्रा) प्रतिरोध कम cadherin VE. इसके अलावा, की गतिशीलता बदल नहीं इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी VE-cadherin, फोटो विरंजन (FRAP) के बाद फ्लोरोसेंट वसूली को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया गया था के रूप में (चित्रा 2B)-cadherin-GFP VE.
1-2 मिनट के बाद, न्यूट्रोफिल डीआईसी चैनल (चित्रा 3 ए) में देखे जा सकता है के रूप में सक्रिय endothelial monolayer का पालन किया. 5-30 एसई के लिए रेंगने के बादसी, neutrophils के विशाल बहुमत PECAM-1 के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के साथ लेबल और VE-cadherin गया कि सेल सेल जंक्शनों के माध्यम से endothelial monolayer के माध्यम से transmigrated. Diapedesis की प्रक्रिया के दौरान, का वितरण VE-cadherin और PECAM -1 वास्तविक समय (3B चित्रा) में किया गया. न्युट्रोफिल diapedesis की साइटों पर, VE-cadherin स्थानीय रूप से बाधित और PECAM-1 एक अधिक अंगूठी जैसी संरचना दिखाया गया था. Diapedesis के पूरा होने के बाद, करीब और जंक्शनों VE-cadherin और PECAM -1 स्पष्ट रूप से diapedesis की साइटों (चित्रा -3 सी) में जगह बदली. न्युट्रोफिल endothelium की Baso पार्श्व की ओर पहुंच गया एक बार विरोधी PECAM-1 एंटीबॉडी के कुछ हिस्सों न्युट्रोफिल की सतह पर पाया गया कि ध्यान दें. हालांकि, इस अन्तःचूचुक पार करने से neutrophils रोकने नहीं किया. न्युट्रोफिल transendothelial प्रवास के दौरान वास्तविक समय में मनाया गतिशीलता VE-cadherin शॉ और उनके सहयोगियों द्वारा काम के साथ समझौते में थे जोconfocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग, दिखाया और VE-cadherin-GFP ट्रांसफ़ेक्ट VE-cadherin-GFP कि leukocytes endothelial सेल सेल जंक्शनों 14 को पार कर जब पार्श्व दूर तक फैला हुआ endothelial कोशिकाओं,. र और सहकर्मियों PECAM-1 के बारे में हमारी टिप्पणियों को रेखांकित भी काम करते हैं. वे ल्युकोसैट बीतने पर पार्श्व के बगल में, कि VE-cadherin प्रसार दिखाया, PECAM -1 स्थानीय स्तर transmigrating न्यूट्रोफिल 15 के आसपास एक अंगूठी में पुनः वितरित किया गया था.
इन विट्रो प्रवाह चैम्बर में चित्रा 1. (ए) तीर मध्यम ताजा होने की जरूरत है जिसमें से जलाशय इंगित करता है. ट्यूबिंग (नोक) रखती बिना PMNs इंजेक्शन लगाने के लिए इस्तेमाल में लाइन Luer इंजेक्शन पोर्ट के साथ प्रवाह कक्ष जोड़ता है (बी) सिलिकॉन टयूबिंग. (सी) क्ोन37 डिग्री सेल्सियस प्रवाह बफर (नोक) से भरा जलाशय कुप्पी के लिए एक खाली प्रवाह चैम्बर के ection. (डी) प्रवाह बफर युक्त ट्यूबिंग को TNF-α इलाज HUVECs साथ प्रवाह चैम्बर के कनेक्शन और खुर्दबीन मंच (नोक) में रखा.
चित्रा 2 VE-cadherin junctional गतिशीलता या समारोह के साथ हस्तक्षेप नहीं करते एंटीबॉडी. (ए) Endothelial सेल monolayer प्रतिबाधा ECIS का उपयोग कर मापा जाता है. शाफ़्ट ओम में प्रतिबाधा व्यक्त किया और एक्स अक्ष घंटों में समय का प्रतिनिधित्व करता है. एंटीबॉडी cl75 (काला लाइन) अवरुद्ध-cadherin VE जबकि VE-cadherin एंटीबॉडी Alexa647 (ब्लू लाइन) के साथ लेबल क्लोन 55-7H1, या प्रतिबाधा कम, endothelial सेल monolayer प्रतिबाधा बदल नहीं आईजीजी Alexa647 नियंत्रण (लाल रेखा) था निर्धारण . (बी
चित्रा 3 VE-cadherin और PECAM -1 वितरण वास्तविक समय में न्युट्रोफिल मंदिर दौरान. (ए) न्युट्रोफिल अन्तःचूचुक पर पालन और के वितरण को प्रभावित किए बिना सेल सेल जंक्शन को पार (सफेद लाइन के साथ चिह्नित) VE-cadherin और PECAM -1. (बी) न्युट्रोफिल सेल सेल जंक्शनों के माध्यम से endothelial monolayer पार. की एक स्थानीय फैलाव VE-cadherin एक न्युट्रोफिल सेल सेल जंक्शनों के माध्यम से protrudes और जब PECAM -1 मनाया जा सकता है. व्हाइट लाइन अन्तःचूचुक के शीर्ष पर अभी भी न्युट्रोफिल उपस्थिति दिखाता है. पीली लाइन न्युट्रोफिल झिल्ली था पता चलता हैटी अन्तःचूचुक नीचे पहले से ही है. (सी) न्युट्रोफिल पूरी तरह endothelial monolayer पार कर गया है. VE-cadherin और PECAM -1 diapedesis की साइटों पर दूसरी जगह कर रहे हैं. पीली लाइन transmigrated न्युट्रोफिल की सीमाओं को दिखाता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
Discussion
इस सेल apoptosis और एक बाधित monolayer में परिणाम होगा क्योंकि इस प्रोटोकॉल के लिए, यह प्रवाह कोठरियों में हवा के बुलबुले के गठन को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है. इससे बचने के लिए, हम ट्यूब प्रवाह चैम्बर से जुड़े हैं, जहां कदम 4.2 और 4.5, विशेष रूप से ब्याज का भुगतान करने के लिए तनाव की कामना करते हैं. प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम पूर्व प्रवाह चैम्बर (4.1 कदम) के लिए उन्हें इंजेक्शन लगाने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 15-30 मिनट के लिए उन्हें incubating द्वारा आरटी पर रखा जाता है कि PMNs का भड़काना है. इससे उन्हें ऐसे अन्तःचूचुक पर ICAM-1 या Vcam-1 के रूप में आसंजन अणुओं का पालन करने की इजाजत दी, ल्युकोसैट integrins का भड़काना में यह परिणाम है.
इस प्रोटोकॉल neutrophils की स्थानांतरगमन अध्ययन करने के लिए ही सीमित नहीं है. ऐसे monocytes या लिम्फोसाइटों के रूप में इसके अलावा अन्य ल्युकोसैट प्रकार इस्तेमाल किया जा सकता है. ल्युकोसैट प्रकार के बीच भिन्न हो सकती है leukocytes भड़काना, यानी कि कदम 4.1, ध्यान दें. इसके अलावा, endothelial कोशिकाओं के अन्य प्रकार का इस्तेमाल किया जा सकता है. इस के लिए यह महत्वपूर्ण रहता हैऐसे TNF-α या आईएल 1β के रूप में उपयुक्त भड़काऊ उत्तेजनाओं के साथ endothelial कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए. Neutrophils transmigrating में जवाब नहीं देते तो, एक एन formyl एल मेथियोनाइल एल leucyl एल फेनिलएलनिन (fMLP) पेप्टाइड 16 के साथ neutrophils संक्षिप्त (5 मिनट) के इलाज पर विचार कर सकते. इस अन्तःचूचुक का पालन करने के लिए उन्हें अधिक खतरा बना, आगे भी, विशेष रूप से उनके integrins में, neutrophils को प्रोत्साहित करेंगे.
आम तौर पर 1 DYN / 2 सेमी प्रवाह गति प्रयोग किया जाता है. इस प्रवाह की गति के बाद केशिका venules, सबसे ल्युकोसैट transendothelial माइग्रेशन 17 होती है जहां साइटों में मापा जाता है. वर्णित प्रवाह कक्षों का उपयोग करना, यह 10 DYN / 2 सेमी करने के प्रवाह की गति को बढ़ाने के लिए संभव है. हालांकि, यह आगे कतरनी बढ़ाने के लिए सिफारिश नहीं है. यह प्रवाह चैम्बर से कोशिकाओं के ट्यूबिंग और टुकड़ी के अवांछित रिसाव में परिणाम हो सकता है.
चित्रा 3 में वर्णित परिणाम ये दर्शाते हैं किएंटीबॉडी कल्पना और ल्युकोसैट diapedesis दौरान endothelial सेल सेल जंक्शनों की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. विशेष रूप से, मौजूदा स्थानांतरगमन assays के अलावा इस प्रोटोकॉल वास्तविक समय में शारीरिक प्रवाह शर्तों के तहत transcellular प्रवास से paracellular भेदभाव करने की अनुमति देता है. एंटीबॉडी सेल सेल जंक्शनों दाग के बाद से, एक / PECAM -1 साइटों-cadherin VE nonpositive बनाम VE-cadherin / PECAM-1-सकारात्मक जंक्शनों पार कि leukocytes की संख्या स्कोर कर सकते हैं. इस तरह, transcellular प्रवास paracellular प्रवास से भेदभाव किया जा सकता है.
इस अध्ययन में इस्तेमाल PECAM-1 एंटीबॉडी दूसरा बाह्य डोमेन के खिलाफ निर्देशित है: यह इन एंटीबॉडी वे करने के लिए बाध्य प्रोटीन के समारोह के साथ हस्तक्षेप नहीं करते कि रेखांकित करने के लिए महत्वपूर्ण है. एंटीबॉडी कम से कम नहीं था सुझाव है कि प्रसार या एक monolayer के गठन में कोई दोष नहीं दिखा था एंटीबॉडी की उपस्थिति में चढ़ाया गया है कि endothelial कोशिकाओं,endothelial कोशिकाओं के बीच homotypic बातचीत के साथ हस्तक्षेप. इसके अलावा, दोनों एंटीबॉडी endothelial monolayer के माध्यम से विस्थापित करने के लिए neutrophils की क्षमता क्षीण नहीं है. साथ ही, अभाव या एंटीबॉडी की उपस्थिति में endothelial monolayer भर में बसना कि neutrophils की संख्या (नहीं दिखाया डेटा) बदला नहीं जाता है. महत्वपूर्ण बात है, लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग हमें एक साथ अलग फ्लोरोसेंट चैनलों और डीआईसी रिकॉर्ड करने के लिए संभावना देता है.
एक न्युट्रोफिल endothelial सेल सेल जंक्शन पार और leukocytes transcellular बनाम अन्य, यानी, paracellular पर एक मार्ग का चयन क्यों समझने में मदद मिलेगी जब इस प्रकार, इस परख एक ही समय में VE-cadherin और PECAM-1 की गतिशीलता के अध्ययन की अनुमति देता है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| μ-Slide VI | IBIDI | 80606 | Flow-chamber |
| 0.45 μm filter | Whatman/GE Lifesciences | 10462100 | |
| 1 ml Syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| 20 ml Syringe | BD Discardit II | 366296 | |
| 21 G Needle | BD Microlance | 301155 | |
| Albumin | Sanquin | 15522644 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Merck | 1009245000 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | 449709 | |
| EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors | Lonza | CC-3156 + CC-4176 | media |
| EDTA (Titriplex III) | Merck | 1370041000 | |
| Falcon tubes | Corning Life Sciences | 352096 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-2MG | FN |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| In-line Luer injection port | IBIDI | 10820 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4•7H2O) | Merck | 105886 | |
| PECAM-1-ALEXA-647 | BD Pharmingen | 561654 | clone WM59 |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-09 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fresenius Kabi Nederland | M090001/01NL | PBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium hydrogen carbonate (KHCO3) | Merck | 1048540500 | |
| Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | |
| Silicone Tygon 3350 tubing | VWR | 228-4331 | tubing |
| Sodium chloride (NaCl) | Calbiochem (Millipore) | 567441 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | model number 55-5920 | |
| TNF-α | Peprotech | 300-01A | tumor necrosis factor |
| Trisodium citrate | Merck | 1.06447.5000 | TNC |
| Vacuettes | Greiner, Germany | 980044 | |
| VE-Cadherin-FITC | BD Pharmingen | 560411 | clone 55-7H1 |
| Zeiss LSM510 META | Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany | ||
| Zen Software 2008 | Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany |
References
- Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. N. Engl. J. Med. 340, 115-126 (1999).
- Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).
- Szekanecz, Z., Koch, A. E. Vascular involvement in rheumatic diseases: ' vascular rheumatology. Arthritis Res. Ther. 10, 224 (2008).
- Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67, 1033-1036 (1991).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76, 301-314 (1994).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Cinamon, G., Shinder, V., Shamri, R., Alon, R. Chemoattractant signals and beta 2 integrin occupancy at apical endothelial contacts combine with shear stress signals to promote transendothelial neutrophil migration. J. Immunol. 173, 7282-7291 (2004).
- Shulman, Z., Cohen, S. J., Roediger, B., et al. Transendothelial migration of lymphocytes mediated by intraendothelial vesicle stores rather than by extracellular chemokine depots. Nat. Immunol. 13, 67-76 (2012).
- Carman, C. V., Springer, T. A. Trans-cellular migration: cell-cell contacts get intimate. Curr. Opin. Cell Biol. 20, 533-540 (2008).
- Carman, C. V., Springer, T. A. A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them. J. Cell Biol. 167, 377-388 (2004).
- Millan, J., Hewlett, L., Glyn, M., et al. Lymphocyte transcellular migration occurs through recruitment of endothelial ICAM-1 to caveola- and F-actin-rich domains. Nat. Cell Biol. 8, 113-123 (2006).
- Schulte, D., Kuppers, V., Dartsch, N., et al. Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability. EMBO J. 30, 4157-4170 (2011).
- Buul, J. D., Mul, F. P., van der Schoot, C. E., Hordijk, P. L. ICAM-3 activation modulates cell-cell contacts of human bone marrow endothelial cells. J. Vasc. Res. 41, 28-37 (2004).
- Shaw, S. K., Bamba, P. S., Perkins, B. N., Luscinskas, F. W. Real-time imaging of vascular endothelial-cadherin during leukocyte transmigration across endothelium. J. Immunol. 167, 2323-2330 (2001).
- Su, W. H., Chen, H., Jen, C. J. Differential movements of VE-cadherin and PECAM-1 during transmigration of polymorphonuclear leukocytes through human umbilical vein endothelium. Blood. 100, 3597-3603 (2002).
- Paulsson, J. M., Jacobson, S. H., Lundahl, J. Neutrophil activation during transmigration in vivo and in vitro: A translational study using the skin chamber model. J. Immunol. Methods. 361, 82-88 (2010).
- Williams, M. R., Azcutia, V., Newton, G., Alcaide, P., Luscinskas, F. W. Emerging mechanisms of neutrophil recruitment across endothelium. Trends Immunol. 32, 461-469 (2011).
