Fluorescens Imaging med One-nanometer Nøyaktighet (FIONA)

Summary

Enkelt fluoroforene kan lokaliseres med nanometerpresisjon ved hjelp FIONA. Her en oppsummering av FIONA teknikken er rapportert, og hvordan å utføre FIONA eksperimenter er beskrevet.

Abstract

Fluorescens bildebehandling med én nanometer nøyaktighet (FIONA) er en enkel, men nyttig teknikk for lokalisering av enkelt fluoroforene med nanometerpresisjon i xy-planet. Her en oppsummering av FIONA teknikken er meldt og eksempler på forskning som er utført ved hjelp av FIONA beskrives kort. Først, hvordan sette opp nødvendig utstyr for FIONA eksperimenter, dvs. en total intern refleksjon fluorescens mikroskopi (TIRFM), med detaljer om justering av optikk, er beskrevet. Deretter hvordan man kan gjennomføre en enkel FIONA forsøket på å lokalisere immobilisert Cy3-DNA enkle molekyler ved hjelp av hensiktsmessige protokoller, etterfulgt av bruk av FIONA for å måle den 36 nm trinnstørrelsen for en enkelt avkortet myosin Va motor er merket med en prikk kvante, er illustrert. Endelig er siste forsøk på å utvide anvendelsen av FIONA til tykke prøver rapportert. Det er vist at ved hjelp av en vannimmersjonsobjektiv og kvanteprikker dynket dypt i sol-gel og kaninøyne hornhinner (>200 mikrometer), lokaliseringspresisjon på 2-3 nm kan oppnås.

Introduction

Rundt 1882, Ernst Abbe fant at oppløsningen på en synlig lys mikroskop er ~ λ / 2NA, eller ~ 200 nm (der λ er bølgelengden og NA er numerisk apertur) ^1,2. Derfor hvilket som helst objekt som er mindre enn denne dimensjonen ville fremstå som en diffraksjon-begrenset plass i en optisk mikroskop. Det er imidlertid mulig å bestemme senteret av stedet, det vil si plasseringen av gjenstanden, med en mye høyere presisjon ^3. Fluorescens bildebehandling med én nanometer nøyaktighet (FIONA) er en enkel, men nyttig teknikk for lokalisering av enkelt fluoroforene med nanometerpresisjon i xy planet ^fire. Presisjonen av lokalisering, _σ μ (dvs. standardfeilen for gjennomsnittet), avhenger av den totale antall innsamlede fotoner, , Der N er fotontelling, er s standardavviket for det fluorescerende flekk, er enpikselstørrelse på bildedetektoren, og b er standardavviket av bakgrunnen ^3,4. For en Fluoroforen emitting ~ 10.000 fotoner, kan FIONA oppnå ~ 1 nm presisjons ^fire.

Fiona kan brukes til å bestemme den nøyaktige posisjonen til en stasjonær emitter, eller et bevegelig en (forutsatt at bilder kan tas raskt nok). Fiona kan påføres sekvensielt til rammene av filmen og således følge bevegelsen av enkelt molekyl ^{4- 8.} Foto-beskyttende reagenser kan være nødvendig for å sikre at prøven ikke photodegrade. Videre kan den fluorescerende gjenstand i seg selv være av en hvilken som helst størrelse, mindre eller større enn den diffraksjon limit- f.eks, kan det bestå av et organeller (~ 1 mm) med mange fluorescerende proteiner dispergert på sin membran. Bruke FIONA kan fortsatt gi en svært nøyaktig (nanometer) gjennomsnittet av gjennomsnittlig sentrum-of-mass. Den store forbedringen i lokalisering presisjon av Fiona kan løse nanometer-skala bevegelser over tid. Dette har presset mikros inn i den molekylære lengdeskala ^{4- 8.}

Siden oppfinnelsen sin, har varianter av FIONA blitt utviklet. For eksempel, lyse-feltet bildebehandling med én nanometer nøyaktighet (bFIONA) ^9, en liten variant av FIONA, bilder og lokaliserer tette objekter som melanosomer in vivo (mørke objekter som inneholder pigmentet melanin) med lyset. I tillegg har Fiona blitt benyttet for å løse flere fargestoffer. For eksempel har ¹² blitt utviklet single-molekyl bildebehandling med høy oppløsning med fotobleking (reker) ^10,11 eller enkelt-molekyl høy oppløsning colocalization (SHREC) for å løse to fargestoffer innenfor ca 10 nm. (Legg merke til at dette er oppløsning, dvs. hvor nøyaktig man kan si identiske fargestoffer fra hverandre.) Mer nylig har FIONA analyse bidratt til lokaliseringsprosessen av visse super-oppløsning mikroskopi som stokastiske optiske anbefanstruction mikroskopi (STORM) ^{13- 15} og foto-aktivert lokalisering mikroskopi (PALM) ^16, i hvilket midlertidige mørke fluoroforer er spent, og fluorescensen er lokalisert. Ved gjentatte ganger spennende en ganske lav densitet av fargestoffer (mindre enn én pr diffraksjon begrenset sted), og deretter oppsamling av fluorescens, analysere hver av dem av Fiona, kan man bygge opp et kart med høy oppløsning. Oppløsningen er da bare begrenset av antallet av fotoner hver fargestoff legger ut, samt ting som å holde prøven i ro (inkludert, for eksempel, objektbordet) i ervervet.

I denne utredningen, et sammendrag av FIONA teknikk og kort beskrive eksempler på forskning som er utført ved hjelp av Fiona er rapportert. Først, hvordan sette opp nødvendig utstyr for FIONA eksperimenter, dvs. en total intern refleksjon fluorescens mikroskopi (TIRFM), med detaljer om justering av optikk, er beskrevet. Deretter hvordan duutføre en enkel FIONA forsøket på å lokalisere immobilisert Cy3-DNA enkle molekyler ved hjelp av hensiktsmessige protokoller, er illustrert. Etter det, til bruk av FIONA måle 36 nm trinnstørrelsen for en enkelt avkortet myosin Va motor er merket med en prikk quantum er presentert. Myosin Va er en viktig processive motor protein som bærer cellular last mens translocating langs aktin filamenter. Her en myosin Va konstruere avkortede brukes til å fjerne irrelevante domener til trinnstørrelsen, og med en FLAG tag tilsatt til C-terminus for å tillate enkel merking med kvanteprikker funksjon med anti-FLAG-antistoffer. Dette eksperimentet er gjort under lav ATP å forsinke myosin og tillate bruk av lange nok eksponeringstider for å få en god foton teller i hver ramme. Enhver tilstrekkelig sterkt fluorescerende markør kan være substituert i den følgende protokoll. Endelig er siste innsats for å utvide anvendelsen av FIONA til tykke prøver rapportert. Som en proof-of-prinsippet, ble kvanteprikker gjennomvåti sol-gel og kaninøyne hornhinner og deretter avbildes og lokalisert ved hjelp FIONA. For bildebehandling, en 60X vannimmersjonsobjektiv med NA = 1.2 ble brukt fordi dette målet har en lengre arbeidsavstand enn tidligere brukte 100X oljeneddyppingsobjektivet. For å kompensere tapet i forstørrelsen i målet, ble en ekstra forstørrelse objektivet (3,3X eller 4,0X) satt i utslippsbanen. I tillegg, epi-fluorescens (ikke TIR) mikroskopi må brukes for å få tilgang dype områder i de tykke prøver. Det er vist at kvanteprikker dynket dypt i sol-gels og i kaninøyne hornhinner (Z> 200 mikrometer) kan lokaliseres med 2-3 nm presisjon.

Protocol

Etikk Uttalelse: Hornhinnen vev fra kaniner ble innhentet i samsvar med University of Illinois Institutional Animal Care og bruk retningslinjer. 1. TIRFM Setup MERK: Bruk laser-vernebriller hele tiden. Kontroller at alle nødvendige optiske komponenter som er oppført i listen over Materialene er tilgjengelige og klare for justering. Du kan eventuelt bruke substitutter med tilsvarende funksjoner fra andre selskaper. Sørg for at speil og linser bør ha…

Representative Results

Et typisk mål-type TIRFM oppsettet er vist i figur 3.. Først ble overflate-immobilisert Cy3-DNA-prøven avbildes. Et typisk bilde er vist på figur 4a. Bildet ble tatt med eksponeringstid 0,5 sek, med EM gevinst = 50 og CCD følsomhet = 12.13 for kameraet. Den punkt-spredning-funksjon (PSF) av et enkelt Cy3-DNA-molekylet er vist i figur 4b (fra stedet indikert med pilen i figur 4a), hvor farge-bar viser skalaen piksel intensiteter. Den faktiske foton …

Discussion

Fiona er en teknikk for å lokalisere posisjonen til et fluorescerende emitter (organisk fluoroforen eller quantum dot) med nanometer presisjon og tidsmessig oppløsning ned til 1 ms ^{4- åtte.} Når nok fotoner er samlet, gir denne teknikken for å bestemme plasseringen av et fluorescerende emitter mye mer nøyaktig enn diffraksjon grense (~ 200 nm) og dermed denne teknikken åpner en måte å observere hva som ikke har blitt sett med konvensjonell / tradisjonell optisk mikros ^{4 – 8.} Siden oppfinnel…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Double-sided tape	3M	—	~ 75 um thick
EMCCD camera	Andor Technology	DU-897E-CS0-#BV
Ultrasonic cleaner	Branson	2510
Fluorescence filter set	Chroma	49016
Actin polymerization buffer	Cytoskeleton	BSA02
Biotin G-actin	Cytoskeleton	AB07
G-actin	Cytoskeleton	AKL95
General actin buffer	Cytoskeleton	BSA01
Laser shutter (with driver)	Electro-Optical Products Corp.	SH-10-MP
IDL	Exelis Visual Information Solutions	—
Neutravidin	Fisher Scientific	PI-31000
Coverslip	Fisherbrand	22X30-1.5	0.16-0.19 mm thick
Microscope slide	Gold Seal Microslides	30103X1	0.93-1.05 mm thick
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001
Glass bottom dish	In Vitro Scientific	D35-20-1.5-N
Cy3-DNA oligos	Integrated DNA Technologies	—	5'-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3'Bio
Fluorescent beads	Invitrogen	T-7280
Qdot 605-streptavidin	Invitrogen	Q10101MP
Qdot605	Invitrogen	Q21301MP
Qdot705	Invitrogen	Q22021MP
Qdot705 Antibody Conjugation Kit	Invitrogen	Q22061MP
Matlab	MathWorks	—
Optical table	Newport Corp	—	RS4000 Series
60X Objective	Nikon	Plan Apo VC 60x WI
100X Objective	Olympus	PlanApo 100X/1.45 Oil ∞/0.17
60X Objective	Olympus	UPlanApo 60X/1.20W
Inverted microscope	Olympus	IX71/IX70/IX81
Origin	OriginLab	—
Anti-FLAG antibody	Sigma Aldrich	F7425-.2MG
ATP	Sigma Aldrich	A7699
BME	Sigma Aldrich	63689-25ML-F
BSA	Sigma Aldrich	A7906
BSA-biotin	Sigma Aldrich	A8549-10MG
CK	Sigma Aldrich	C3755	Creatine Phosphokinase from rabbit muscle
CP	Sigma Aldrich	P1937	Phosphocreatine di(tris) salt
DTT	Sigma Aldrich	43815	DL-Dithiothreitol
EGTA	Sigma Aldrich	E3889	Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid
HCl	Sigma Aldrich	93363-500G
HEPES	Sigma Aldrich	H0887
KCl	Sigma Aldrich	P9333
MgCl2	Sigma Aldrich	M1028
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
PCA	Sigma Aldrich	03930590	Protocatechuic acid
PCD	Sigma Aldrich	P8279	Protocatechuate-3,4-dioxygenase
TMOS	Sigma Aldrich	341436-25G	Tetramethyl orthosilicate
Tris-HCl	Sigma Aldrich	93363
Trolox	Sigma Aldrich	238813	6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid
1” diameter broadband dielectric mirrors with mounts	Thorlabs	BB1-E02, KM100	Quantity: 2
½” diameter posts	Thorlabs	TR4	Quantity ≥ 6
10x beam expander	Thorlabs	BE10M-A
2” diameter broadband dielectric mirrors with mounts	Thorlabs	BB2-E02, KM200	Quantity: 2
2” diameter f = 300 mm lens with mount	Thorlabs	LA1256-A, LMR2	TIR lens
Fluorescent alignment target	Thorlabs	VRC2SM1
Laser safety goggles	Thorlabs	LG3
ND filter(s)	Thorlabs	FW1AND
Optical beam profiler	Thorlabs	BP209-VIS
Post-mounted iris diaphragm	Thorlabs	ID25	Quantity: 2
Shearing interferometer	Thorlabs	SI100
XYZ translation stage, ½” travel	Thorlabs	T12XYZ
Laser	World Star Technologies	TECGL-30	532 nm, 30 mW