Summary
Bruges åben mark aktivitetsniveauer at vurdere lokomotiv og adfærdsmæssige aktivitetsniveau. Denne protokol giver en veltilrettelagt, standardiseret protokol til brug i prækliniske forsøg for neuromuskulære lidelser.
Abstract
Overvågningssystemet åben mark aktivitet omfattende vurderer bevægelsesmæssigt adfærdsmæssige aktivitetsniveauer af mus og. Det er et nyttigt redskab til at vurdere lokomotiv værdiforringelse i dyremodeller af neuromuskulære sygdomme og effekten af terapeutiske lægemidler, der kan forbedre bevægelse og / eller muskelfunktion. Målingen åben mark aktivitet giver en anden målestok end muskelstyrke, som er almindeligt vurderes af gribestyrke målinger. Det kan også vise, hvordan lægemidler kan påvirke andre organ systemer samt når det bruges med supplerende resultatmål. Hertil kommer, at foranstaltninger såsom samlede distance spejle 6 min gangtest, et klinisk forsøg resultat foranstaltning. Dog er overvågning åben mark aktivitet også forbundet med betydelige udfordringer: Åben Felt Aktivitet målinger varierer i forhold til dyrets stamme, alder, køn og døgnrytme. Desuden kan rumtemperatur, fugtighed, lys, støj og endda lugt påvirke vurdering resultater. Samlet set denne manuscript giver en velafprøvet og standardiseret åbent felt aktivitet SOP til prækliniske forsøg i dyremodeller af neuromuskulære sygdomme. Vi giver en diskussion af vigtige overvejelser, typiske resultater, dataanalyse og detaljeret beskrivelse af de styrker og svagheder i åben afprøvning i marken. Derudover giver vi anbefalinger til optimal studiedesign, når du bruger åben mark aktivitet i et præklinisk forsøg.
Introduction
Dyremodeller har været nyttige for at lære om sygdomsmekanismer, men deres anvendelighed til at forudsige behandlingseffekt i kliniske forsøg er ofte blevet udfordret 1-3. Talrige "lovende" prækliniske undersøgelser offentliggøres hvert år; Men meget få af de foreslåede tiltag viser positive resultater, når flyttes til kliniske forsøg. Disse uoverensstemmelser er ofte tilskrives publikationsbias, overoptimistiske konklusioner og dårligt konstrueret og udført prækliniske studier, der fører til reproducerbare resultater 1-3.
Med de nuværende fremskridt inden for udvikling af lægemidler til neuromuskulære sygdomme, der er et stigende behov for veldesignede prækliniske forsøg. Især er der behov for strenge metoder, der kan udføres på en standardiseret og blindet måde, med validerede, reproducerbare og oversætbare resultatmål. Som medlem af medfødt muskelsygdom Consortium, medønsket om at gennemføre mere grundige prækliniske studier, deler vi her vores Standard Operating Procedure (SOP) for Open Felt Aktivitet. Denne SOP er tidligere valideret 4 og offentliggjort som en del af TREAT-NMD er standardforskrifter for Duchennes muskeldystrofi (DMD) dyremodeller 5. Vi har brugt denne metode til at fænotype og afprøve den terapeutiske virkning af en lang række stoffer i en række dyremodeller for neuromuskulære sygdomme, herunder Lama2 dy-2J / J (Dy2J) mus, den dyremodel for medfødt muskeldystrofi (CMD) 6,7 . Til gengæld er denne artikel tilpasset fra vores tidligere offentliggjorte TREAT-NMD SOP 5.
Overvågningssystemet åben mark aktivitet omfattende vurderer bevægelsesmæssigt adfærdsmæssige aktivitetsniveauer af mus, som kan sammenholdes med lokomotiv funktion og. Testen er også almindeligt anvendt til at vurdere angst ud, og sonderende adfærd 8-10. Især det åbne område er et nyttigt redskab for røvEssing lokomotiv værdiforringelse i dyremodeller af neuromuskulære sygdomme 11,12 og effekten af terapeutiske lægemidler, der kan forbedre bevægelse og / eller motorisk funktion 6,7,13,14. Den åbne vurdering felt aktivitet giver en anden målestok end muskelstyrke, som er almindeligt måles med greb, og det viser, hvordan lægemidler kan påvirke andre organ systemer (dvs. det centrale nervesystem) samt 5. Desuden åben mark aktivitet foranstaltning samlede distance, afspejler 6 min gangtest, et klinisk forsøg effektmål, der fokuserer på submaksimal motion ydeevne og livskvalitet 15,16. Samlet dette gør det åbne område aktivitet teste en gavnlig sekundær eller hjælpende resultat foranstaltning til brug i prækliniske forsøg. Men den åbne overvågningssystem felt aktivitet har også store udfordringer forbundet med det. Testen er adfærdsmæssige og kan være ganske variabel, da det er påvirket af en lang række eksternefaktorer. For eksempel kan denne adfærd påvirkes af sonderende drev (dvs. kognition), angst, sygdom, døgnrytme, miljøfaktorer, genetisk baggrund, foruden motorens udgang 10. Som følge heraf er det bydende nødvendigt at gennemføre denne foranstaltning i en standardiseret måde med et kontrolleret miljø. Protokollen præsenteres her beskriver vores åben mark aktivitet SOP i detaljer. Det giver trin-for-trin procedurer og yderligere diskussion af vigtige overvejelser at kontrollere miljømæssige forhold og medvirke til at reducere variabilitet, typiske resultater, dataanalyse, og vurderingen styrker og svagheder i flere detaljer.
Protocol
BEMÆRK: Åbent landskab overvågningssystem aktivitet anvender et åbent felt plexiglas kammer med fotocellen udledere og receptorer jævnt fordelt langs kanten af kammeret (Figur 1). Disse fotocellen udledere og receptorer skabe en xy gitter af usynlige infrarøde stråler. Når et dyr er placeret i kammeret, bevæger det sig om, hvilket beam pauser. Lodrette sensorer er også til stede for at vurdere vertikale aktivitetsniveau (dvs. opdræt adfærd) samt. Analysatoren registrerer strålen pause oplysninger hurtigt og analyserer den. Den computersoftware beregner derefter flere aktivitet foranstaltninger over forudindstillede periode. Disse foranstaltninger omfatter: horisontal aktivitet (enheder), lodret aktivitet (enheder), den samlede distance (cm), bevægelse (sek), og resten (sek) 5.
NOTE: Generelt test rummet skal være temperatur- og Fugtkontrolleret, med jævn belysning. Afprøvning kamre skal være jævnt dismedvirket om værelse og må ikke placeres i direkte lys, mørke hjørner, eller skygge områder. Alt instrument akklimatisering og test skal udføres på samme tidspunkt hver dag (fx om morgenen) og af de samme personer. Disse personer bør blindet for dyret behandlingsgruppen, og genotype når muligt.
Følgende protokol er blevet udført under vejledning og godkendelse af Børnenes National Medical Center IACUC.
1. Instrument Akklimatisering
- Placer mus i test værelse i deres hjem bure i cirka 10 minutter at akklimatisere. Forlad rummet i løbet af akklimatisering periode.
- Retur til test værelse og tænde aktivitet kamre. Selvom data ikke bliver opsamlet på dette tidspunkt, vil det yderligere efterligne testmiljø.
- Fjern forsigtigt hver mus fra deres hjem bur og straks placere dem i testkamrene. Hvis aktivitetenkammer indeholder et center skillevæg, som opdeler kammeret i kvadrater (figur 1), placeres en mus i hver tomme kvadrant.
- Når alle dyr er indlæst i testkamrene placere låget på toppen af hver testkammer. Forlad rummet i løbet af denne akklimatisering tid.
- Efter 60 minutter, vender tilbage til værelset. Fjern låget fra hver test kammer og forsigtigt tilbage hver mus til hans eller hendes respektive hjem bur.
- Rengør hvert kammer med et desinfektionsmiddel og papirhåndklæder. Sørg for at ingen snavs partikler tilbage i kammeret.
BEMÆRK: Hvis flere sessioner bliver kørt hver dag, grundigt rene hver test kammer i mellem hver session. - Gentag trin 1-6 i 4 dage i træk.
BEMÆRK: Udfør akklimatisering en uge før første dataindsamling. Hvis dyrene er testet flere gange i løbet af en undersøgelse, kun udføre akklimatisering forud for den første runde af testen for at undgå tilvænning. Desuden tilfældigt tildele dyrene til et nytbox hver session. Spor box opgaver under hele undersøgelsen.
2. Dataindsamling
- Placer mus i test værelse i deres hjem bure i 10-30 min for at akklimatisere. Forlad rummet i løbet af denne tid.
- Efter 10-30 minutter, vender tilbage til test værelse. Tænd aktivitet kamre og åbne den medfølgende software på computeren er tilsluttet til kamrene. Hvis kammer indeholder en quad-splitter, skal du indsætte den partition på dette tidspunkt.
BEMÆRK: Hvis testen kammer indeholder en quad-splitter kan to dyr anbringes i testkammeret under dataindsamlingen. Et dyr kan placeres i det forreste venstre kvadrant og en i ryggen højre kvadrant (figur 1).
BEMÆRK: Placer ikke dyr i alle fire kvadranter under dataindsamlingen eller i den samme række eller kolonne. Placering af dyrene i disse retningslinjer vil forstyrre xy gitter af infrarøde stråler og bevægelsen dyr vil væreunøjagtigt målt. - Konfigurere computeren softwaren for at udføre en prebeam check. Denne konfiguration vil tillade en til at køre en pre-stråle kontrol efter forsøgsopstillingen og forud for indsættelse af dyr i testkamrene (se nedenfor).
BEMÆRK: Når prebeam checken er kørt, computersoftware vurderer funktionen af xy infrarøde stråler. For eksempel kan det afgøre, om fotocellen emittere og receptorerne bliver blokeret og ude af stand til på passende vis registrerer bevægelse i kammeret. - Indstil de primære dataindsamling parametre i software til at indsamle seks 10 min blokke af data (dvs. indsamle data for i alt 60 min), og indtast derefter de passende dato, filnavn, og mus ID-numre.
- Når alle parametre er indstillet, skal du køre prebeam check. Hvis et kammer ikke består prebeam tjekke det er mest sandsynligt på grund af dårlig tilpasning af centret kvadrant divider eller testkammer. Hvis dette sker, justere midten kvadrant diviwho og test kammeret, indtil sensorerne er ikke længere blokeret og systemet hedder, at testkammer er klar. Hvis dette ikke løser problemet, referere instrumentets manual.
- Når alle testkamre er klar, forsigtigt fjerne musen fra hans eller hendes hjem bur og straks placere ham eller hende ind i testkammeret. Bemærk ID af musen og sørg for at det passer til den ene indgået computer.
- Når alle dyrene passende belastet i testkamrene placere låget på toppen af hvert kammer. Vælg derefter den relevante kommando i computerens software til at starte dataindsamlingen. På dette tidspunkt, vil analysator og computersoftware starte optagelsen aktivitetsniveauer efter dataindsamlingens parametre.
- Lad test plads til den resterende del af testperioden.
- Ved afslutningen af testperioden (dvs. 60 minutter senere), skal du straks vende tilbage til test værelse. Gem dataene, og derefter vende tilbage hvert dyr til deres respektive hjem bur.
- Rengør alle enheder med et desinfektionsmiddel og papirhåndklæder.
BEMÆRK: Hvis flere sessioner bliver kørt hver dag, grundigt rene hver test kammer i mellem hver session. - Eksportere data til et regneark, og derefter afslutte programmet.
- Kontroller data for at sikre, at de blev optaget. Hvis oplysningerne ikke blev registreret, eller dyrene sov hele hele dataindsamlingen periode, udføre en ekstra dag for dataindsamling.
BEMÆRK: Et dyr anses for at være "sovende", hvis den ikke bevæger sig i hele 60 min test varighed. - Gentag trin 2,1-2,12 i 4 dage i træk.
BEMÆRK: Hvis dyrene testet på forskellige tidspunkter i løbet af varigheden af en undersøgelse, ikke udføre åben Felt Aktivitet målinger mere end en gang om måneden for at undgå tilvænning. Desuden tilfældigt tildele dyrene til en ny kasse hver session. Spor box opgaver under hele undersøgelsen.
3. Dataanalyse
- Beregn den gennemsnitlige horisontale aktivitet (enheder), lodrette aktivitet (enheder), den samlede distance (cm), bevægelse (sek), og resten (sek) pr mus og gruppe. Den computersoftware beregner og rapporterer den samlede horisontale aktivitet (enheder), lodret aktivitet (enheder), den samlede distance (cm), bevægelse (sek), og resten (sek) i dataindsamlingen periode (dvs. 60 min) for hver mus. Beregn middelværdien for hver af de nævnte parametre fra de 4 dage af dataindsamling.
- Forud for udførelse af eventuelle statistiske analyser, vurdere normalitet af data ved hjælp af Shapiro-Wilk test, og tjek for afvigende værdier ved hjælp af Grubb test. Fjern eventuelle væsentlige outliers (p <0,05).
- For normalfordelte data, sammenligne midler mellem grupper ved hjælp af enten en uafhængig prøve t-test eller en envejs ANOVA og post-hoc test med p-værdier korrigeret for multiple sammenligninger afhængering af det samlede antal behandlingsgrupper.
- For ikke-normalfordelte data, sammenligne medianværdier mellem grupper ved hjælp af enten Wilcoxon rank sum test, eller en Kruskal-Wallis test og rangsumtest med deraf p-værdier korrigeret for multiple sammenligninger, afhængigt af det samlede antal behandlingsgrupper.
Representative Results
Når man analyserer åbne felt aktivitetsdata, fokuserer vi på nogle få udvalgte målinger, der giver en vurdering af aktivitetsniveauet, der generelt afspejler lokomotiv funktion. Disse parametre omfatter: horisontal aktivitet, vertikal aktivitet, bevægelse tid, hviletid, og den samlede distance. Generelt vil dyrene med nedsat muskelfunktion være mindre aktive og har lavere ambulant aktivitet. Dette er normalt forbundet med nedsat horisontal aktivitet, vertikal aktivitet, samlede distance og bevægelse tid, og øget hviletid 5,6,12,17. Tværtimod dyr med usvækket muskel funktion eller patienter behandlet med lægemidler, der nedsætter progression af forværrede muskel patologi er mere tilbøjelige til at vise højere aktivitetsniveau 6,7,14,17.
For at vise et eksempel på typiske resultater opnået ved anvendelse af denne protokol i dyremodeller for neuromuskulære sygdomme, vi leveret data fra en forløbsundersøgelse we tidligere gennemført i Dy2J medfødt muskelsvind (CMD) dyremodel 6. Kort sagt, Dy2J modellen indeholder en trunkeret form af LAMA2 gen, der resulterer i paralyse af bagben, demyelinisering og dystrofiske skeletmuskulatur ændringer. Observeres Virkningen af denne muskel patologi på aktivitetsniveauet i disse mus. For eksempel Dy2J mus i undersøgelsen en tendens til at udstille nedre vandrette aktivitetsniveau og mindre distance i forhold til deres alder og køn-matchede BL / 6 vildtype-kontrollen i hele undersøgelsens varighed (figur 2); men disse forskelle var ikke altid signifikant. Den manglende betydning er mest sandsynligt på grund af den lille stikprøvestørrelse, og høj koncernintern variation i BL6 data. Variation er typisk for åben mark aktivitet data Men disse data i særdeleshed mangel tilstrækkelig strøm til at afgøre, om disse grupper er statistisk forskellige fra hinanden. Typisk en n = 10-12 bør anvendes til at detektere statistically signifikante forskelle 5,17. For eksempel, når en større stikprøve anvendes, som det blev gjort i SJL undersøgelsen (se den anden BL6 bar i figur 3B, 3D og 3E) kan observeres signifikante forskelle mellem grupperne. De Dy2J dyr viste også et fuldstændigt tab af vertikale aktivitetsniveauer, der afspejlede deres bagbensparalyse, og til gengæld, en manglende evne til bag (figur 2B) 6. Endelig er det vigtigt at bemærke, kønsforskelle i aktivitetsniveau. For eksempel hunnerne tendens til at være mere aktive end mænd, viser en højere grad af horisontal aktivitet, vertikal aktivitet og total distance (figur 2); men disse forskelle var ikke statistisk signifikant.
Vi har også givet data fra flere tidligere undersøgelser i andre dyremodeller for neuromuskulære sygdomme, samt at fremhæve en række yderligere faktorer, der påvirker handlingude af trit niveauer (figur 3). For eksempel aktivitetsniveau varierer fra genetisk baggrund 10. BL10 vildtypemus udvise større horisontal aktivitet, vertikal aktivitet, og den samlede distance i forhold til aldersrelaterede og køn matchede BL6 vildtypemus (figur 3). Dette er en vigtig observation at konstatere, som udnytter de forkerte kontrolstammer i en undersøgelse kan gengive data ubrugelige. For det andet, aktivitetsniveauer varierer fra sygdom model og fænotype (figur 3). For eksempel SJL musen, dyremodel for lemmer bæltet muskeldystrofi-2B (LGMD-2B), viser det laveste niveau for horisontal aktivitet og den samlede distance, efterfulgt af Dy2J mus og mdx-musen, dyremodel for Duchenne muskeldystrofi (figur 3A, 3C). Men Dy2J mus på grund af deres bagben lammelse, viser det laveste niveau af vertikal aktivitet (figur 3B). Det er også vigtigt at bemærke, at det højere niveau afaktivitet i mdx fænotype sandsynligvis skyldes øget aktivitetsniveau BL10 baggrund stamme. Endelig fremhæver dette tal vigtigheden af animalsk alder / patologi på testtidspunktet. For eksempel ved 30 ugers alderen, kan påvises nogen forskel i aktivitetsniveauet mellem mdx-mus og deres alders og køn matchede BL10 vildtype (Figur 3). Men i 6 ugers alderen, omkring toppen nekrotisk fase i mdx musemodel mdx-mus viser et signifikant fald i vertikal aktivitet og horisontal aktivitet. Et fald er også observeret i den samlede distance, men denne forskel er ikke signifikant (figur 3) 4.
Figur 1. åben mark aktivitet apparater. To åbne felt apparater med center Quadrant dividers, og toppe. Hvis aftagelig center kvadrant dividers er til stede, bør dyrene kun placeres i den forreste venstre (1, 3) og tilbage højre kamre (2, 4) i hver boks under testen for at opnå gyldige aflæsninger.
Figur 2. åben mark aktivitetsdata. Typiske åbne felt aktivitetsdata for Dy2J (grå linje, n = 3) og alders- og matches køn BL6 kontrol stamme (sort linje, n = 3) mus ved 14, 19, 23, 25, og 30 ugers alderen (A - F) a) horisontale aktivitet (arbitrære enheder) mænd, B) Horisontal aktivitet (arbitrære enheder) kvinder, C) Vertikal aktivitet (arbitrære enheder) mænd, D) Vertikal aktivitet (arbitrære enheder) kvinder. E) Samlet distance traveLED (cm) mænd, E) Samlet distance (cm) kvinder. Data blev indsamlet i løbet af 4 dage i træk, og i gennemsnit pr mus og gruppe. De samme mus blev testet ved hvert tidspunkt. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM. Data, som tidligere publiceret 6.. Dy2J og BL6 mus blev sammenlignet med en uafhængig prøve t-test på hver gang-point. En p-værdi <0,05 blev betragtet som signifikant. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.
Figur 3. Åbn felt aktivitetsdata flere stammer Typiske adfærdsmæssige aktivitetsdata fra mandlig BL10 (6 uger gamle, n = 8, 25-30 uger gamle, n = 10)., MDX (6 uger, n = 9; 25-30 uger gamle, n = 15), BL6 (gruppe til Dy2J mus kontrol, n = 3, kontrolgruppe på SJL-mus, n = 13), Dy2J (n = 3) og SJL (n = 13)-mus på vanemføre aldre. A) Vandret aktivitet (arbitrære enheder) data fra BL10 og mdx mus efter 6 og 25-30 ugers alderen, B) Horisontal aktivitet (arbitrære enheder) data fra BL6, Dy2J og SJL mus ved 25-30 uger alder, C) Vertikal aktivitet (arbitrære enheder) data fra BL10 og MDX mus efter 6 og 25-30 ugers alderen, D) Vertikal aktivitet (arbitrære enheder) data fra BL6, Dy2J og SJL mus ved 25-30 ugers alderen , E) Samlet distance (cm) data fra BL10 og mdx mus ved 6 og 25-30 ugers alderen, og F) Samlet distance (cm) data fra BL6, Dy2J og SJL mus ved 25-30 ugers alderen . Dy2J, dyremodel for CMD med laminin α2 genmutation på BL6 baggrund; SJL, dyremodel for lemmer bælte muskelsvind-2B (LGMD-2B); MDX dyremodel for DMD på BL10 baggrund. Der er ingen dysferlin-tilstrækkelig SJL kontrol. Data er middel ± SEM. B, C og D indeholder data, der tidligere offentkaste 6,17. Data blev normalt ikke fordelt; derfor blev data sammenlignet ved anvendelse af en Wilcoxon rank beløb test. En p-værdi på p <0,05 blev betragtet som signifikant. De følgende sammenligninger blev foretaget for hver parameter: a) BL10 og MDX mus ved 6 uger, p <0,05; b) at BL10 og MDX mus ved 25-30 ugers alderen, ikke signifikant; c) Dy2J og BL6 matchede kontrol stamme mus på 25-30 uger, p <0,05; d) SJL og BL6 matchet kontrol stamme på 25-30 uger, p <0,001; e) BL10 mus ved 25-30 ugers alderen og BL6 (gruppe for Dy2J mus kontrol) mus ved 25 ugers alderen, p <0,01; f) BL10 ved 25-30 ugers alderen og BL6 (kontrolgruppe på SJL-mus) ved 25-30 ugers alderen, p <0,001.
Discussion
Målingen åben mark aktivitet er en in vivo-assay, der kan være til gavn for vurdering af sygdomsprogression og narkotika effekt i dyremodeller for neuromuskulære sygdomme 6,7,11-14. Som vist i figur 2, det giver en vurdering af aktivitetsniveauet, der generelt afspejler lokomotiv funktion. Dette er en anden foranstaltning end muskelstyrke, hvilket gør det til et ideelt sekundær eller hjælpende resultat foranstaltning at udføre i et præklinisk stof undersøgelse. Desuden er det en klinisk relevant 15 invasiv foranstaltning, der kan udføres flere gange i løbet af varigheden af en undersøgelse. Dog er adfærdsmæssige og lokomotiv aktivitet også påvirket af andre faktorer så godt (dvs. eksperimentator håndtering, miljøforhold, og kognition) at skabe variation i åbent felt aktivitetsdata. Målet med dette oplæg er at give en velafprøvet og standardiseret protokol, der reducerer variation og giver resultater at være Compared tværs af flere laboratorier, i håb om at forbedre oversættelse inden for vores felt.
En væsentlig ulempe ved denne foranstaltning er, at det er meget variable og påvirket af en række eksterne faktorer. Men vi tog dette i betragtning, når udviklingen af protokollen. Vi vurderede en række testprotokoller spænder i varighed fra 1-5 dage for dataindsamling. I sidste ende, vi fastslået, at udføre instrument akklimatisering forud for dataindsamling til at sætte dyrene med testkammeret miljø og udfører 4 dage af dataindsamlingen betydeligt reduceret mængden af variationen i resultatet oplysninger 5. Denne protokol blev oprindeligt designet til at vurdere adfærdsmæssige og lokomotiv aktivitetsniveau i MDX musemodel; Dette blev imidlertid protokol nylig valideret i Dy2J dyremodel samt 6. Det foreslås, at protokollen skal standardiseres i dit laboratorium for hvert dyr model, inden du bruger det i et præklinisk forsøg.
Åben mark aktivitet varierer fra genetisk baggrund 17, køn 18-20, 18 år, og døgnrytme 21. Dette kræver dyr af samme alder, køn og genetisk baggrund, der skal vurderes på samme tid. I planlægningsfasen, bør nøje overvejelser sættes til at beslutte på, hvad alder eller aldre åben mark aktivitet niveauer vil blive vurderet. Hver dyremodel har sin egen særskilte sygdomsprogression og lokomotiv og adfærdsmæssig fænotype, som varierer i sværhedsgrad og alder 6,15 (figur 2 og figur 3). Derfor er det vigtigt at fastslå klinisk og patologisk relevante tidspunkter for at vurdere åbne Felt Aktivitet foranstaltninger. Det samlede antal dyr, der er nødvendige i hver behandlingsgruppe til at detektere statistisk signifikante forskelle varierer efter dyremodel, alder og køn samt. Derfor bør relevante beregninger stikprøvestørrelse også udføres i planlægningsfasen at determine det samlede antal dyr, der er nødvendige i hver behandlingsgruppe til at detektere statistisk signifikante forskelle. Disse beregninger bør også tage hensyn til yderligere resultatmål anvendt i undersøgelsen (f.eks gribestyrke målinger eller histologiske analyser). Baseret på vores magt beregninger, vi bruger typisk 10-12 dyr pr behandlingsgruppe. Desuden bør man være særlig opmærksom på, hvad kontrol stamme anvendt i undersøgelsen. Der er en tendens til utilstrækkelig kontrol-stammer, der skal anvendes i prækliniske undersøgelser. For eksempel er BL6-mus ofte anvendes som en stamme i mdx-mus kontrol; imidlertid mdx musen er på en BL10 baggrund. Som det ses i figur 3, BL10 mus er meget mere aktive end BL6-mus, hvilket gør det umuligt at sammenligne mdx og BL6-data. Ved udførelse af prækliniske studier med mdx-mus, bør BL10 mus anvendes som kontrolstammen. Desuden, hvis et forsøg gennemføres med Dy2J mus, BL6-mus bør anvendes som control-stamme.
Små miljømæssige ændringer kan også påvirke aktivitetsniveauet betydeligt. Disse omfatter belysning, temperatur, fugtighed, lugt, støj og aktivitet 4,15 menneske. Derfor er det meget vigtigt, at testning udføres i et temperaturreguleret og fugtighed kontrolleret rum uden direkte belysning på samme tidspunkt hver dag 5. Testkamrene skal være jævnt fordelt i hele rummet og ikke placeret under direkte belysning eller i skygge eller mørke hjørner 5. Dyrene randomiseres til deres testkamre hver dag for at mindske virkningerne af varierende miljøforhold i hele rummet, og de skal have lov til at akklimatisere sig til testning plads til 10-30 minutter før dataindsamling. Sørg for at spore boksen tildeling af hvert dyr i hele undersøgelsens varighed for at sikre, at enhver påvirkning af kasse / miljø er ligeligt fordelt mellem de forskellige behandlingsgrupper. De personer loading Animals ind testkamrene og håndtering af dyrene under hele undersøgelsen skal blindet for behandlingsgruppen, og dyrs belastning, når det er muligt. Påvirkes i mange tilfælde genotyper afviger markant fra tilhørende kontroller og blændende er ikke muligt. Dog bør den enkelte altid blive forblændet mellem behandlede og ubehandlede grupper. Desuden bør alle personer forlade lokalet under dataindsamling for at reducere støj og distraktioner i rummet, og alle kamre skal rengøres grundigt efter hver session dataindsamling. Disse tiltag vil reducere variationen i data. Det er vigtigt at bemærke, at dyr er også meget modtagelige for tilpasning 15. Derfor foreslås det, at dyrene fjernes fra testkammer direkte efter 60 min af dataindsamling hver dag, og at åbne felt aktivitetsniveauer vurderes ikke mere end en gang om måneden.
Den samlede distance og den samlede trækment tidsmålinger tendens til at være de mest følsomme åbne felt aktivitetsmålinger 5. I Dy2J model målingen lodret aktivitet tendens til at være den mest følsomme åbne felt aktivitet foranstaltning (figur 3); kan det imidlertid være vanskeligt at fange nøjagtige vertikale aktivitetsmålinger i mindre dyr. For eksempel er det muligt, at en mindre dyr vil udvise opdræt adfærd og sensoren vil ikke optage det på grund af højden af den lodrette sensor. Som et resultat, anbefaler vi test dyr tidligst 5 ugers alderen. Det er også muligt, at et dyr vil sove under hele en dataindsamling session. Hvis dette er tilfældet, er det hensigtsmæssigt at tilføje en ekstra dag for dataindsamling. Endelig kan dårlig tilpasning af kvadrant divider eller blokering af sensorer i kassen resultere i ukorrekte oplysninger så godt. Derfor er det meget vigtigt at udføre en sensor precheck, før afprøvning, og gennemgå alle data efter afslutningen afhver dataindsamling session.
Forsigtighed bør også tages, når man analyserer åbent felt aktivitetsdata. Åbent felt aktivitetsdata har en tendens til at være ikke-normalfordelte og få afvigere 4. Forud for udførelse af eventuelle statistiske analyser, vores biostatisticians anbefales at kontrollere oplysningerne om normalitet og afvigere. Hvis oplysninger ikke normalt fordelt, bør man overveje at bruge en ikke-parametrisk test, når man sammenligner midler. Desuden skal alle data analyseres af en person blindet hvad behandlingsgrupperne er.
Samlet set åben mark aktivitet foranstaltning har store fordele: a) Det er en samlet vurdering af både lokomotorisk og adfærdsmæssig aktivitet, som er stærkt, men ikke altid korreleret med lokomotiv-funktion; b) at det er en nem foranstaltning til at udføre; c) at det kræver ingen dyr håndtering under afprøvning; d) det er en noninvasiv foranstaltning, der kan udføres mere end én gang i hele varigheden af et study; e) ingen særlig uddannelse er nødvendig for at udføre testen; f) flere dyr kan testes på en gang; og g), er det en klinisk relevant effektmål 5,16. Men når der testes terapeutiske, huske på, at andre faktorer kan påvirke et dyrs adfærd, og til gengæld åbent Felt Aktivitet målinger. Narkotika kan have CNS og eller anden myndighed brede effekter og adfærd kan også være påvirket af en stressende miljø. Som et resultat, kan det være svært at skelne mellem om ændringer i lokomotiv eller adfærdsmæssige aktivitetsniveauer er relateret til ændringer i muskel funktion, muskelstyrke, eller er et resultat af bivirkninger fra medicin. Derfor bør yderligere funktionelle, histologiske og eller molekylære assays udføres som godt. Denne standardiserede protokol er også blevet anvendt med succes i andre muskelsygdomme 4,17; Men som det ses i figur 3, pilotundersøgelser bør udføres i første omgang at vurdere følsomheden af foranstaltningen i dyretmodel.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Denne publikation er finansieret gennem Cure CMD, Fransk Muscular Distrophy Association (AFM), en translationel forskning tilskud fra Muskelsvindfonden Association, National Institutes of Health (1K26RR032082, 1P50AR060836-01, 1U54HD071601, 2R24HD050846-06), Department of Defense ( W81XWH-11-1-0330, W81XWH-11-1-0782, W81XWH-10-1-0659, W81XWH-11-1-0809, W81XWH-09-1-0599) og en pilot tilskud fra Parent Project Muscular Distrophy ( PPMD).
Dette papir er en af flere i en serie af standardforskrifter for rutinemæssigt anvendte metoder i medfødt muskelsygdom område. Det afspejler den indsats drøftet og fastlagt af over 20 eksperter inden for området medfødt muskelsygdom på det seneste medfødt muskelsygdom Consortium Workshop, som blev afholdt i april 2013, Washington, DC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| VersaMax Open Field Activity Monitoring system with acrylic test chambers, and X, Y, Z axis sensors | AccuScan Instruments, Inc. Columbus Ohio, USA | Retired | |
| Fusion Open Field Activity Monitoring system with acrylic test chambers, and X, Y, Z axis sensors | Omnitech Electronics, Inc. Columbus Ohio, USA | Suggested system currently on the market | |
| Computer | Dell, Inc. | ||
| Materials | |||
| Virkon-S Broad spectrum disinfectant (potassium peroxymonosulfate/ sodium chloride) | Pharmacal Research Laboratories, Inc. | ||
| Mice | |||
| B6.WK-Lama2dy-2J/J (Dy2J) | Jackson Lab | 000524 | |
| C57BL/6J (BL6) | Jackson Lab | 000664 | |
| SJL/J (SJL) | Jackson Lab | 000686 | |
| C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J (mdx) | Jackson Lab | 001801 | |
| C57BL/10ScSnJ (BL10) | Jackson Lab | 000476 | |
References
- Worp, H. B., Howells, D. W., Sena, E. S., Porritt, M. J., Rewell, S., O'Collins, V., Macleod, M. R. Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies?. PLoS Med. 7 (3), 1000245-10 (2010).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Spurney, C., et al. Preclinical drug trials in the mdx mouse: Assessment of reliable and sensitive outcome measures. Muscle Nerve. 39, 591-602 (2009).
- Nagaraju, K., Carlson, G., De Luca, A. Behavioral and locomotor measurements using open field animal activity monitoring system. TREAT-NMD SOP Number M2.1.002. 2, (2010).
- Yu, Q., et al. Omigapil treatment decreases fibrosis and improves respiratory rate in dy(2J) mouse model of congenital muscular dystrophy. PLoS One. 8 (6), e65468 (2013).
- Sali, A., et al. Glucocorticoid-treated mice are an inappropriate positive control for long-term preclinical studies in the mdx mouse. PLoS One. 7 (4), e34204 (2012).
- Belzung, C., Griebel, G. Measuring normal and pathological anxiety-like behaviour in mice: a review. Behav Brain Res. 125, 141-149 (2001).
- Prut, L., Belzung, C. The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors: a review. Eur J Pharmacol. 463, 3-33 (2003).
- Walsh, R. N., Cummings, R. A. The open-field test: A critical Review. Psychological Bulletin. 83, 482-504 (1976).
- Raben, N., Nagaraju, K., Lee, E., Plotz, P. Modulation of disease severity in mice with targeted disruption of the acid alpha-glucosidase gene. Neuromuscul Disord. 10, 283-291 (2000).
- Nagaraju, K., et al. Conditional up-regulation of MHC call I in skeletal muscle leads to self-sustaining autoimmune myositis and myositis-specific autoimmune myositis and myositis-specific autoantibodies. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (16), 9209-9214 (2000).
- Erb, M., et al. Omigapil ameliorates the pathology of muscle dystrophy caused by laminin-alpha2 deficiency. J Pharmacol Exp Ther. 331 (3), 787-795 (2009).
- Malerba, A., et al. Chronic systemic therapy with low-dose morpholino oligomers ameliorates the pathology and normalizes locomotor behavior inmdxmice. Mol Ther 1. 9 (2), 345-354 (2011).
- Grounds, M. D., Radley, H. G., Lynch, G. S., Nagaraju, K., De Luca, A. Towards developing standard operating procedures for pre-clinical testing in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Neurobiol Dis. 31 (1), 1-19 (2008).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscul Disord. 22 (1), 34-42 (2012).
- Rayavarapu, S., Van de meulen, J. H., Gordish-Dressman, H., Hoffman, E. P., Nagaraju, K., Knoblack, S. M. Characterization of Dysferlin Deficient SJL/J Mice to Assess Preclinical Drug Efficacy: Fasudil Exacerbates Muscle Disease Phenotype. PLoSOne. 5 (9), e12981 (2010).
- Valle, F. P. Effects of strain, sex, and illumination on open-field behavior of rats. Am J Psychol. 83, 103-111 (1970).
- Ramos, A., et al. Evaluation of Lewis and SHR rat strains as a genetic model for the study of anxiety and pain. Behav Brain Res. 129, 113-123 (2002).
- Bowman, R. E., Maclusky, N. J., Diaz, S. E., Zrull, M. C., Luine, V. N. Aged rats: sex differences and responses to chronic stress. Brain Res. 1126, 156-166 (2006).
- Sakai, K., Crochet, S. Differentiation of presumed serotonergic dorsal raphe neurons in relation to behavior and wake-sleep states. Neuroscience. 104, 1141-1155 (2001).
