Summary
Öppna fältaktivitetsnivåer används för att bedöma lok och beteendeaktivitetsnivå. Detta protokoll ger en väl utformad, standardiserat protokoll som ska användas i prekliniska studier för neuromuskulära sjukdomar.
Abstract
Det öppna övervakningssystem fältverksamhet bedömer omfattande rörelse och beteende aktivitet av möss. Det är ett användbart verktyg för att bedöma lok försämring i djurmodeller av neuromuskulär sjukdom och effekten av terapeutiska läkemedel som kan förbättra rörelseförmåga och / eller muskelfunktion. Det öppna fältet aktivitetsmätning ger en annan åtgärd än muskelstyrka, som ofta bedöms av greppstyrkemätningar. Det kan också visa hur läkemedel kan påverka andra delar av kroppen samt vid användning med ytterligare effektmått. Dessutom åtgärder såsom sammanlagda sträcka spegla 6 min gångtest, en klinisk prövning effektmått. Dock är öppet fält aktivitet övervakning också förenad med betydande utmaningar: Öppen fältaktivitetsmätningar varierar beroende på djurstam, ålder, kön, och dygnsrytm. Dessutom kan rumstemperatur, fuktighet, belysning, buller, och även lukt påverka utfall bedömning. Sammantaget denna manuscript ger en väl beprövad och standardiserad öppet fält aktivitet SOP för prekliniska studier i djurmodeller av neuromuskulära sjukdomar. Vi tillhandahåller en diskussion om viktiga överväganden, typiska resultat, dataanalys och detaljer styrkor och svagheter i öppna fälttester. Dessutom ger vi rekommendationer för optimal studiedesign vid användning av öppet fält aktivitet i en preklinisk studie.
Introduction
Djurmodeller har varit användbara för att lära sig om sjukdomsmekanismer, men deras användbarhet i att förutsäga behandlingseffekt i kliniska studier har ofta ifrågasatts 1-3. Många "lovande" prekliniska studier publiceras varje år; Men mycket få av de föreslagna insatserna visar positiva resultat när de flyttas till klinisk prövning. Dessa skillnader är ofta tillskrivs publikationsbias, alltför optimistiska slutsatser, och dåligt utformade och avrättade prekliniska studier som leder till reproducerbara resultat 1-3.
Med nuvarande framsteg inom läkemedelsutveckling för neuromuskulära sjukdomar, finns det ett ökande behov av väl utformade prekliniska studier. Framför allt finns det ett behov av rigorösa metoder som kan genomföras på ett standardiserat och blint sätt, med validerade, reproducerbara och översättningsbara effektmått. Som medlem i den Congenital Muscle Disease Consortium, medviljan att genomföra strängare prekliniska studier, delar vi här vår Standard Operating Procedure (SOP) för Open Field aktivitet. Denna SOP har tidigare validerat 4 och publiceras som en del av TREAT-NMD: s standardrutiner för Duchennes muskeldystrofi (DMD) djurmodeller 5. Vi har använt denna metod för att fenotyp och testa den terapeutiska effekten av många läkemedel i en mängd olika djurmodeller av neuromuskulära sjukdomar, inklusive Lama2 dy-2J / J (Dy2J) möss, djurmodell för kongenital muskeldystrofi (CMD) 6,7 . I sin tur, är den här artikeln anpassas från våra tidigare publicerade TREAT-NMD SOP 5.
Det öppna övervakningssystem fältverksamhet bedömer omfattande rörelse och beteendeaktivitetsnivåer hos möss, som kan korreleras med lok funktion. Testet är också allmänt används för att bedöma ångest ut och undersökande beteenden 8-10. I synnerhet är det öppna fältet ett användbart verktyg för assEssing lok försämring i djurmodeller av neuromuskulär sjukdom 11,12 och effekten av terapeutiska läkemedel som kan förbättra rörelseförmåga och / eller motorik 6,7,13,14. Det öppna fältet aktivitetsbedömning ger ett annat mått än muskelstyrka, som vanligen mäts med greppstyrka, och det visar hur läkemedel kan påverka andra delar av kroppen (dvs det centrala nervsystemet) och 5. Dessutom det öppna fältet aktivitetsåtgärd sammanlagda sträcka, speglar 6 min gångtest, en klinisk prövning utfallsmått, som fokuserar på submaximal motion prestanda och livskvalitet 15,16. Sammantaget gör detta fältet verksamhet som är öppen testa en fördelaktig sekundär eller extra effektmått att använda i prekliniska studier. Däremot har öppet övervakningssystem fältverksamhet också betydande utmaningar som är förknippade med den. Testet är beteende och kan vara ganska varierande eftersom det påverkas av en mängd yttrefaktorer. Till exempel kan detta beteende påverkas av undersökande enhet (dvs kognition), ångest, sjukdom, dygnsrytm, miljöfaktorer, genetisk bakgrund, förutom motoreffekt 10. Som ett resultat är det nödvändigt att genomföra denna åtgärd på ett standardiserat sätt med en kontrollerad miljö. Protokollet presenteras här beskriver vårt öppna fältverksamhet SOP i detalj. Det ger steg-för-steg-anvisningar och ytterligare diskussion om viktiga faktorer för att styra miljöförhållanden och bidra till att minska variationen, typiska resultat, dataanalys och utvärdering styrkor och svagheter mer i detalj.
Protocol
OBS: Öppet fält aktivitet övervakning system använder ett öppet fält plexiglas kammare med fotocelltrålare och receptorer jämnt fördelade längs omkretsen av kammaren (figur 1). Dessa fotocelltrålare och receptorer skapa en xy rutnät av osynliga infraröda strålar. När ett djur placeras i kammaren, rör den sig om, vilket orsakar balk pauser. Vertikala sensorer är också närvarande för att bedöma vertikala aktivitetsnivåer (dvs. uppfödningsbeteende) samt. Analysatorn registrerar de uppgifter trålen paus och snabbt analyseras. Den programvara beräknar sedan flera aktivitetsåtgärder under den förinställda tidsperioden. Dessa åtgärder innefattar: horisontell aktivitet (enheter), vertikala verksamhets (enheter), sammanlagda sträcka (cm), rörelse (sek), och resten (sek) 5.
OBS: I allmänhet i provningsrummet skall vara temperatur-och fuktighetskontrollerad, med jämn belysning. Testa kammare bör vara jämt disbidragit om rummet och bör inte placeras i direkt ljus, mörka hörn, eller skuggade områden. Alla instrument acklimatisering och testning bör utföras vid samma tidpunkt varje dag (t ex på morgonen) och av samma personer. Dessa personer ska förblindas till djurbehandlingsgruppen, och genotyp om möjligt.
Följande protokoll har utförts under ledning och godkännande av Barnens National Medical Center IACUC.
1. Instrument Acklimatisering
- Placera mössen i testrummet i deras hem burar under cirka 10 minuter att vänja. Lämna rummet under acklimatiseringsperiod.
- Återgå till testrummet och slå på aktivitetskamrarna. Även om uppgifterna inte samlas in vid den här tiden, kommer detta ytterligare likna testmiljö.
- Ta försiktigt bort varje mus från sitt hem bur och omedelbart placera dem i testkamrarna. Om verksamhetenkammaren innehåller en center avdelare som delar kammaren i kvadranter (Figur 1), placera en mus i varje tomt kvadranten.
- När alla djur lastas i testkamrarna, placera locket på toppen av varje testkammare. Lämna rummet under denna acklimatisering tid.
- Efter 60 min, gå tillbaka till rummet. Ta bort locket från varje testkammare och försiktigt tillbaka varje mus till sin respektive buren.
- Rengör varje kammare med desinfektionsmedel och pappershanddukar. Säker ingen smuts partiklar är kvar i kammaren.
OBS: Om flera sessioner körs varje dag, rengör varje testkammare mellan varje session. - Upprepa steg 1-6 under 4 dagar i följd.
OBS: Utför acklimatisering en vecka före samlingen ursprungliga uppgifterna. Om djur testas flera gånger under en undersökning, endast utföra acklimatisering före den första omgången av tester för att undvika tillvänjning. Dessutom slumpmässigt tilldela djuren till en nybox varje session. Spåra rutan uppdrag under hela studien.
2 Datainsamling
- Placera möss i provningsrummet i deras hem burar för 10-30 minuter att vänja. Lämna rummet under denna tid.
- Efter 10-30 minuter, tillbaka till provningsrummet. Aktivera aktivitetskamrarna och öppna den medföljande programvara på datorn som är ansluten till kamrarna. Om kammaren innehåller en kvadrant avdelare, sätt partitionen vid denna tid.
OBS: Om testkammaren innehåller en kvadrant avdelare, kan två djur placeras i testkammaren under datainsamlingen. Ett djur kan placeras i fram vänstra kvadranten och en i bakre högra kvadranten (Figur 1).
OBS: Placera inte djur i alla fyra kvadranter under datainsamlingen eller i samma rad eller kolumn. Placering av djur i dessa riktlinjer kommer att störa xy rutnät av infraröda strålar och djuret rörelsen blirfelaktigt uppmätt. - Konfigurera datorprogram för att utföra ett prebeam check. Denna konfiguration tillåter en att köra en pre-beam kontroll efter experimentuppställning och före införandet av djur i testkamrarna (se nedan).
ANMÄRKNING: När prebeam kryss körs utvärderar datorprogram funktionen av xy infraröda strålar. Till exempel kan den bestämma om fotocellsändare och receptorer är blockerade och kan inte på lämpligt sätt detektera rörelse inuti kammaren. - Ange de primära datainsamling parametrar i programvara för att samla sex 10 min block av data (dvs samla in data för totalt 60 min), och ange sedan lämpliga datum, filnamn och mus ID-nummer.
- När alla parametrar är inställda, kör prebeam check. Om en kammare inte klarar prebeam kontrollera det är mest sannolikt på grund av dålig anpassning av mitt kvadranten avdelare eller testkammare. Om detta händer, justera mitt kvadranten divider och provkammaren tills sensorerna inte längre är blockerad och systemet anger att testkammaren är klar. Om detta inte löser problemet, hänvisningsinstrumenthandboken.
- När alla testkammare är redo, försiktigt bort musen från sitt hem bur och omedelbart placera honom eller henne i testkammaren. Notera ID för musen och se till att den matchar den som ingått dator.
- När alla djur på ett lämpligt sätt laddas in i testkamrarna, placera locket på toppen av varje kammare. Välj sedan lämpligt kommando i datorprogram för att starta datainsamlingen. Vid denna tid, kommer analysatorn och programvara starta inspelningen aktivitetsnivåer enligt datainsamlingsparametrarna.
- Lämna i provningsrummet under återstoden av testperioden.
- Efter avslutad testperioden (dvs 60 minuter senare), omedelbart återvända till provningsrummet. Spara data, och sedan återvända varje djur till deras respektive hembur.
- Rengör alla enheter med ett desinfektionsmedel och pappershanddukar.
OBS: Om flera sessioner körs varje dag, rengör varje testkammare mellan varje session. - Exportera data till ett kalkylblad och sedan avsluta programmet.
- Kontrollera data för att se till att de registrerades. Om uppgifterna inte har registrerats, eller djuren sov hela helheten av datainsamlings tidsperiod, utför en extra dag för datainsamling.
OBS: Ett djur anses vara "sovande", om det inte rör sig i hela 60 min test varaktighet. - Upprepa steg från 2,1 till 2,12 för 4 dagar i följd.
OBS: Om djur testas vid flera tidpunkter under hela den tid en studie, inte utför öppna fältaktivitetsmätningar mer än en gång i månaden för att undvika tillvänjning. Dessutom slumpmässigt tilldela djuren till en ny låda varje session. Spåra rutan uppdrag under hela studien.
3. Data Analysis
- Beräkna medel horisontell aktivitet (enheter), vertikala verksamhets (enheter), reste total sträcka (cm), rörelse (sek), och resten (sek) per mus och grupp. Den programvara beräknar och redovisar den totala horisontella aktiviteten (enheter), vertikal aktivitet (enheter), sammanlagda sträcka (cm), rörelse (sek), och resten (sek) under datainsamlingsperioden (dvs 60 minuter) för varje mus. Beräkna medelvärdet för var och en av de tidigare nämnda parametrarna från de 4 dagarna av datainsamling.
- Innan du utför några statistiska analyser, bedöma normalitet data med hjälp av Shapiro-Wilk test och kontrollera extremvärden med hjälp av Grubbs test. Ta bort några betydande outliers (p <0,05).
- För normalfördelade uppgifter, jämföra medel mellan grupper som använder antingen en oberoende sample t-test eller en envägs ANOVA och post hoc test med p-värden justerat för multipla jämförelser beroendeing på det totala antalet behandlingsgrupperna.
- För icke-normalfördelade data jämföra medianvärden mellan grupper med antingen Wilcoxon rank sum test, eller ett Kruskal-Wallis test och rangsummetest med resulterande p-värden justerat för multipla jämförelser beroende på det totala antalet behandlingsgrupper.
Representative Results
Vid analys av öppna fältaktivitetsdata, fokuserar vi på några utvalda mätningar som ger en bedömning av aktivitetsnivåer som i allmänhet speglar lok funktion. Dessa parametrar är: horisontell aktivitet, vertikal aktivitet, rörelse tid, vilotid, och sammanlagda sträcka. I allmänhet kommer djur med nedsatt muskelfunktion vara mindre aktiva och har lägre ambulatorisk aktivitet. Detta är i allmänhet förknippas med minskad horisontell aktivitet, vertikal aktivitet sammanlagda sträcka och rörelse tid och ökad vilotid 5,6,12,17. Tvärtom djur med felfri muskelfunktion eller de som behandlats med läkemedel som minskar progressionen av försämrade muskelpatologi är mer benägna att visa högre aktivitetsnivå 6,7,14,17.
För att visa ett exempel på typiska resultat som erhållits med hjälp av detta protokoll i djurmodeller av neuromuskulära sjukdomar, förutsatt att vi data från en longitudinell studie we som tidigare genomförts i Dy2J medfödd muskeldystrofi (CMD) djurmodell 6. I korthet innehåller Dy2J modell en trunkerad form av LAMA2 genen som resulterar i bakbensförlamning, demyelinisering och dystrofiska skelettmuskelförändringar. Effekterna av denna muskel patologi om aktivitetsnivåer observeras i dessa möss. Till exempel Dy2J mössen i studien tenderade att uppvisa lägre horisontella aktivitetsnivå, och mindre tillryggalagd sträcka, jämfört med deras ålder och könsmatchade BL / 6 vild typ kontroller under hela studien (figur 2); men dessa skillnader var inte alltid betydande. Bristen på betydelse är troligen på grund av det lilla urvalet, och hög koncernintern variation i BL6 uppgifterna. Variation är typiskt för öppet fält aktivitetsdata; Men dessa uppgifter i synnerhet bristen tillräcklig effekt avgöra om dessa grupper är statistiskt skiljer sig från varandra. Typiskt en n = 10-12 ska användas för att upptäcka statistically signifikanta skillnader 5,17. När till exempel en större urvalsstorlek används, vilket gjordes i SJL studien (se andra BL6 bar i figurerna 3B, 3D och 3E) kan observeras signifikanta skillnader mellan grupperna. De Dy2J djuren visade också en total förlust av vertikala aktivitetsnivåer, vilket speglade deras bakbenen förlamning, och i sin tur, en oförmåga att bak (Figur 2B) 6. Slutligen är det viktigt att uppmärksamma könsskillnader i de aktivitetsnivåer. Exempelvis honorna tenderade att vara mer aktiva än män, visar högre nivåer av övergripande verksamhet, vertikal aktivitet och sammanlagda sträcka (figur 2); men dessa skillnader var inte statistiskt signifikant.
Vi har också uppgifter från flera tidigare studier som genomförts i andra djurmodeller av neuromuskulära sjukdomar, samt att lyfta fram ett antal ytterligare faktorer som påverkar handlingenivity nivåer (Figur 3). Exempelvis aktivitet varierar med genetisk bakgrund 10. BL10 vildtyp möss uppvisar större horisontell aktivitet, vertikal aktivitet och sammanlagda sträcka jämfört med ålders och kön matchade BL6 vildtypsmöss (Figur 3). Detta är en viktig iakttagelse att notera, som utnyttjar de felaktiga kontrollstammar i en studie kan göra data oanvändbar. För det andra, aktivitet varierar med sjukdomsmodell och fenotyp (Figur 3). Till exempel SJL musen, djurmodell för lem gördel muskeldystrofi-2B (LGMD-2B), visar den lägsta nivån av övergripande verksamhet och sammanlagda sträcka, följt av Dy2J musen och mdx musen, djurmodell för Duchenne muskeldystrofi (figurerna 3A, 3C). Men Dy2J möss, på grund av deras bakbenen förlamning, visar den lägsta nivån av vertikal aktivitet (Figur 3B). Det är också viktigt att notera att den högre nivån avaktivitet i mdx fenotypen är troligen tillskrivas den ökade aktivitetsnivån i BL10 bakgrundsstammen. Slutligen belyser denna siffra betydelsen av djur ålder / sjukdomspatologi vid testtillfället. Till exempel, på 30 veckors ålder, inga skillnader kan detekteras i aktivitetsnivå mellan MDX möss och deras ålders och kön matchade BL10 vildtyp kontroller (Figur 3). Men vid 6 veckors ålder, runt skärmen nekrotisk fas i mdx musmodell mdx-möss uppvisar en signifikant minskning i vertikal aktivitet, och horisontell aktivitet. En minskning har också observerats i sammanlagda sträcka, men denna skillnad är inte signifikant (Figur 3) 4.
Figur 1. Öppna fältaktivitetsapparaterna. Två öppna fältet apparater med centrum quadrant avdelare, och toppar. Om avtagbar center kvadrant avdelare är närvarande, bör djuren endast placeras i den främre vänstra (1, 3) och bakre högra kammare (2, 4) i varje ruta under testning för att få giltiga avläsningar.
Figur 2. Öppna fältaktivitetsdata. Typiska öppet fält aktivitetsdata för Dy2J (grå linje, n = 3) och ålders- och köns matchas BL6 styrstam (svart linje, n = 3) möss vid 14, 19, 23, 25, och 30 veckors ålder (A - F) A) Horisontell aktivitet (godtyckliga enheter) hanar, B) Horisontell aktivitet (godtyckliga enheter) honor, C) Vertikal aktivitet (godtyckliga enheter) hanar, D) Vertikal aktivitet (godtyckliga enheter) honor. E) Sträcka traveledda (cm) hanar, reste E) Sträcka (cm) honor. Data samlades in under fyra dagar i följd och uppgick i genomsnitt per mus och grupp. Samma möss testades vid varje tidpunkt. Data representerar medelvärde ± SEM. Uppgifter tidigare publicerats 6. Dy2J och BL6 möss jämfördes med en oberoende prov T-test vid varje tidpunkt. Ett p-värde <0,05 ansågs signifikant. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.
Figur 3 Öppet fält aktivitetsuppgifter flera stammar Typiska beteendeaktivitetsdata från manliga BL10 (6 veckor gamla, n = 8, 25-30 veckor gamla, n = 10)., Mdx (6 veckors ålder, n = 9; 25-30 veckors ålder, n = 15), BL6 (kontrollgrupp för Dy2J möss, n = 3; kontrollgrupp för SJL-möss, n = 13), Dy2J (n = 3) och SJL (n = 13) möss vid vabedrivande åldrar. A) Horisontell aktivitet (godtyckliga enheter) data från BL10 och MDX möss vid 6 och 25-30 veckors ålder, B) Horisontell aktivitet (godtyckliga enheter) data från BL6, Dy2J och SJL möss vid 25-30 veckors ålder, C) Vertikal aktivitet (godtyckliga enheter) data från BL10 och MDX möss vid 6 och 25-30 veckors ålder, D) Vertikal aktivitet (godtyckliga enheter) data från BL6, Dy2J och SJL möss vid 25-30 veckors ålder , E) Total reslängd (cm) data från BL10 och MDX möss vid 6 och 25-30 veckors ålder, och F) Total reslängd (cm) data från BL6, Dy2J och SJL möss vid 25-30 veckors ålder . Dy2J, djurmodell för CMD med laminin α2 genmutation på BL6 bakgrunden; SJL, djurmodell för lem gördel muskeldystrofi-2B (LGMD-2B); mdx, djurmodell för DMD på BL10 bakgrunden. Det finns ingen dysferlin tillräcklig SJL kontroll. Data är medelvärden ± SEM. B, C och D innehåller data som tidigare publiskjul 6,17. Data normalt inte distribueras; Därför har uppgifter jämfördes med hjälp av ett Wilcoxon rank summor test. Ett p-värde på p <0,05 ansågs signifikant. Följande jämförelser gjordes för varje parameter: a) BL10 och mdx möss vid 6 veckors ålder, p <0,05; b) BL10 och mdx möss vid 25-30 veckors ålder, inte signifikant; c) Dy2J och BL6 matchade kontroll stam möss vid 25-30 veckors ålder, p <0,05; d) SJL och BL6 matchade kontrollstam vid 25-30 veckors ålder, p <0,001; e) BL10 möss vid 25-30 veckors ålder och BL6 (kontrollgrupp för Dy2J möss) möss vid 25 veckors ålder, p <0,01; f) BL10 vid 25-30 veckors ålder och BL6 (kontrollgrupp för SJL möss) vid 25 till 30 veckors ålder, p <0,001.
Discussion
Det öppna fältet aktivitetsmätning är en in vivo-analys som kan vara till nytta för att bedöma sjukdomsutveckling och läkemedlets effektivitet i djurmodeller av neuromuskulär sjukdom 6,7,11-14. Som visas i figur 2, ger det en bedömning av aktivitetsnivåer som i allmänhet speglar lok funktion. Detta är en annan åtgärd än muskelstyrka, vilket gör den till en idealisk sekundärt eller hjälp effektmått att utföra i en preklinisk läkemedelsstudie. Dessutom är det en kliniskt relevant 15, icke-invasiv åtgärd som kan genomföras flera gånger under hela en studie. Dock är beteende och lok aktivitet påverkas också av andra faktorer också (dvs försökshantering, miljöförhållanden, och kognition) skapar variation i öppet fältaktivitetsdata. Målet med denna uppsats är att ge en väl testad och standardiserat protokoll som minskar variation och låter resultaten att vara compared över flera labb, i hopp om att förbättra översättningen inom vårt område.
En stor nackdel med detta mått är att det är mycket varierande och påverkas av många yttre faktorer. Men vi tog hänsyn till detta vid utvecklingen av protokollet. Vi utvärderade ett antal olika testprotokoll varierar i längd från 1 till 5 dagar av datainsamling. Till slut bestämde vi att utföra instrument acklimatisering före datainsamling att bekanta djuren med testkammaren miljön och utför fyra dagar av datainsamling avsevärt minskat mängden variation i utfallsdata 5. Detta protokoll var ursprungligen avsedd att bedöma beteendemässiga och lokomotiv aktivitet i mdx musmodell; Men var detta protokoll nyligen validerats i djurmodell Dy2J samt 6. Det föreslås att protokollet standardiseras inom din arbetskraft för varje djurmodell innan du använder den i en preklinisk studie.
Öppet fält aktivitet varierar med genetisk bakgrund 17, kön 18-20, 18 år, och dygnsrytm 21. Detta kräver djur i samma ålder, kön och genetisk bakgrund som skall bedömas på samma gång. Under planeringsstadiet, bör noggrann eftertanke sättas i avgöra vid vilken ålder eller åldrar öppet fält verksamhetsnivåer kommer att bedömas. Varje djurmodell har sin egen distinkta sjukdomsutveckling och lok och beteende fenotyp, som varierar i svårighetsgrad och efter ålder 6,15 (figur 2 och 3). Därför är det viktigt att bestämma kliniskt och patologiskt relevanta tidpunkter för att bedöma öppna fältaktivitetsåtgärder. Det totala antalet djur som behövs i varje behandlingsgrupp för att detektera statistiskt signifikanta skillnader varierar med djurmodell, ålder och kön samt. Följaktligen bör relevanta urvalsstorlek beräkningar också utföras under planeringsstadiet för att determine det totala antalet djur som behövs i varje behandlingsgrupp för att detektera statistiskt signifikanta skillnader. Dessa beräkningar ska också ta hänsyn till ytterligare resultatmått som använts i studien (t.ex. mätningar eller histologiska analyser greppstyrka). Baserat på våra kraftberäkningar använder vi vanligtvis 10-12 djur per behandlingsgrupp. Dessutom bör särskild uppmärksamhet ägnas åt vad kontrollstammen används i studien. Det finns en tendens till att felaktiga kontrollstammar som används i prekliniska studier. Till exempel är BL6 möss används ofta som ett kontrollstam för MDX möss; emellertid är den mdxmus på en BL10 bakgrund. Såsom framgår av fig 3, BL10 möss är mycket mer aktiva än BL6 möss, som gör det omöjligt att jämföra MDX och BL6-data. Vid genomförande av prekliniska studier med mdx möss bör BL10 möss användas som kontrollstammen. Dessutom, om en studie genomförs med Dy2J möss, BL6 möss bör användas som kontrol-stammen.
Små förändringar i miljön kan också avsevärt påverka aktivitetsnivåer. Dessa inkluderar belysning, temperatur, luftfuktighet, lukt, buller och mänsklig aktivitet 4,15. Därför är det mycket viktigt att testerna genomföras i en temperatur-och fuktighetskontrollerade rum med icke-direkt belysning vid samma tidpunkt varje dag 5. Testkamrarna bör vara jämnt fördelade i hela rummet och inte placeras i direkt belysning eller i skuggade eller mörka hörn 5. Djur bör slumpmässigt till deras testkammare varje dag för att minska effekterna av varierande miljöförhållanden i hela rummet, och de bör tillåtas att anpassa sig till i provningsrummet under 10-30 min före datainsamling. Se till att spåra lådan tilldelningen av varje djur under hela studien för att se till att varje påverkan av box / miljö är jämnt fördelad mellan de olika behandlingsgrupperna. Individerna inläsning av animals i testkamrarna och hanterar djuren under hela den tid som undersökningen skall förblindas till behandlingsgruppen och djurstammen när det är möjligt. I många fall påverkas genotyper markant skiljer sig från tillhörande kontroller och bländande är inte möjligt. Däremot bör enskilda alltid förblindas mellan behandlade och obehandlade grupper. Dessutom bör alla personer lämna rummet under datainsamlingen för att minska buller och distraktioner i rummet, och alla kammare bör rengöras noggrant efter varje session datainsamling. Dessa åtgärder kommer att minska variationen i data. Det är viktigt att observera att djur är också mycket mottagliga för anpassning 15. Därför föreslås det att djuren avlägsnas från testkammaren direkt efter 60 min av datainsamling varje dag och att öppna fältaktivitetsnivåer utvärderas inte mer än en gång i månaden.
Den sammanlagda sträcka och total dragningstidsmätningar brukar vara de mest känsliga öppna fältaktivitetsmätningar 5. I Dy2J modellen tenderar vertikala aktivitetsmätning för att vara den mest känsliga öppet fält aktivitetsåtgärd (Figur 3); Men, kan det vara svårt att fånga exakta vertikala aktivitetsmätningar i mindre djur. Till exempel är det möjligt att en mindre djur kommer att uppvisa uppfödningsbeteende och sensorn kommer inte att fånga upp det på grund av höjden av den vertikala sensorn. Som ett resultat, rekommenderar vi testdjur tidigast fem veckor. Det är också möjligt att ett djur kommer att sova under hela datainsamlingssession. Om så är fallet, är det lämpligt att lägga till en extra dag för datainsamling. Slutligen kan dålig inriktning av kvadranten delaren eller blockering av sensorer i rutan resultera i felaktiga uppgifter också. Därför är det mycket viktigt att göra en sensor PreCheck, före testning, och granska all data efter det attvarje datainsamling session.
Försiktighet bör också tas vid analys öppna fältaktivitetsdata. Öppet fält aktivitets uppgifter har en tendens att vara icke-normalfördelade och har extremvärden 4. Innan du utför några statistiska analyser, våra biostatistiker rekommenderar kontroll av uppgifter om normalitet och extremvärden. Om data inte är normalfördelade, bör man överväga att använda en icke-parametrisk prov när jämförelseorgan. Dessutom bör alla data som analyseras av en person blind för vad behandlingsgrupperna är.
Totalt sett har det öppna fältet aktivitetsåtgärd stora fördelar: a) det är en omfattande bedömning av både rörelse och beteendeaktivitet, vilket är starkt, men inte alltid korrelerar med lok funktion; b) det är en enkel åtgärd för att utföra; c) det krävs ingen djurhantering under provning; d) det är en icke-invasiv åtgärd som kan utföras mer än en gång under hela en study; e) Ingen särskild utbildning behövs för att utföra testet; f) flera djur kan testas på en gång; och g) det är en kliniskt relevant resultatmått 5,16. Men när man testar läkemedel, tänk på att andra faktorer kan påverka ett djurs beteende och i sin tur öppna fältaktivitetsmätningar. Droger kan ha CNS och eller andra kropps breda effekter och beteende kan också påverkas av en stressig miljö. Som ett resultat kan det vara svårt att särskilja om förändringar av lok eller beteendeaktivitetsnivåer är relaterade till förändringar i muskelfunktion, muskelstyrka, eller är en följd av biverkningar av läkemedlet. Därför bör ytterligare funktionella, histologiska och eller molekylära analyser genomföras också. Denna standardiserade protokoll har också med framgång användas i andra muskelsjukdomar 4,17; emellertid, som framgår av Figur 3, pilotstudier bör genomföras från början för att bedöma känsligheten för åtgärden i djuretmodell.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Denna publikation finansieras genom Cure CMD, Franska Muskulös Distrophy Association (AFM), en translationell forskningsanslag från muskeldystrofi Association, National Institutes of Health (1K26RR032082, 1P50AR060836-01, 1U54HD071601, 2R24HD050846-06), försvarsdepartementet ( W81XWH-11-1-0330, W81XWH-11-1-0782, W81XWH-10-1-0659, W81XWH-11-1-0809, W81XWH-09-1-0599) och en pilotbidrag från Parent Project Muscular Distrophy ( PPMD).
Detta dokument är en av flera i en serie standardrutiner för rutinmässigt använda metoder inom den kongenitala fält muskelsjukdom. Det återspeglar de insatser diskuteras och fastställas med över 20 experter på området för medfödd muskelsjukdom vid det senaste Medfödd Muscle Disease Consortium Workshop, som hölls i April 2013 i Washington, DC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| VersaMax Open Field Activity Monitoring system with acrylic test chambers, and X, Y, Z axis sensors | AccuScan Instruments, Inc. Columbus Ohio, USA | Retired | |
| Fusion Open Field Activity Monitoring system with acrylic test chambers, and X, Y, Z axis sensors | Omnitech Electronics, Inc. Columbus Ohio, USA | Suggested system currently on the market | |
| Computer | Dell, Inc. | ||
| Materials | |||
| Virkon-S Broad spectrum disinfectant (potassium peroxymonosulfate/ sodium chloride) | Pharmacal Research Laboratories, Inc. | ||
| Mice | |||
| B6.WK-Lama2dy-2J/J (Dy2J) | Jackson Lab | 000524 | |
| C57BL/6J (BL6) | Jackson Lab | 000664 | |
| SJL/J (SJL) | Jackson Lab | 000686 | |
| C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J (mdx) | Jackson Lab | 001801 | |
| C57BL/10ScSnJ (BL10) | Jackson Lab | 000476 | |
References
- Worp, H. B., Howells, D. W., Sena, E. S., Porritt, M. J., Rewell, S., O'Collins, V., Macleod, M. R. Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies?. PLoS Med. 7 (3), 1000245-10 (2010).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Spurney, C., et al. Preclinical drug trials in the mdx mouse: Assessment of reliable and sensitive outcome measures. Muscle Nerve. 39, 591-602 (2009).
- Nagaraju, K., Carlson, G., De Luca, A. Behavioral and locomotor measurements using open field animal activity monitoring system. TREAT-NMD SOP Number M2.1.002. 2, (2010).
- Yu, Q., et al. Omigapil treatment decreases fibrosis and improves respiratory rate in dy(2J) mouse model of congenital muscular dystrophy. PLoS One. 8 (6), e65468 (2013).
- Sali, A., et al. Glucocorticoid-treated mice are an inappropriate positive control for long-term preclinical studies in the mdx mouse. PLoS One. 7 (4), e34204 (2012).
- Belzung, C., Griebel, G. Measuring normal and pathological anxiety-like behaviour in mice: a review. Behav Brain Res. 125, 141-149 (2001).
- Prut, L., Belzung, C. The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors: a review. Eur J Pharmacol. 463, 3-33 (2003).
- Walsh, R. N., Cummings, R. A. The open-field test: A critical Review. Psychological Bulletin. 83, 482-504 (1976).
- Raben, N., Nagaraju, K., Lee, E., Plotz, P. Modulation of disease severity in mice with targeted disruption of the acid alpha-glucosidase gene. Neuromuscul Disord. 10, 283-291 (2000).
- Nagaraju, K., et al. Conditional up-regulation of MHC call I in skeletal muscle leads to self-sustaining autoimmune myositis and myositis-specific autoimmune myositis and myositis-specific autoantibodies. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (16), 9209-9214 (2000).
- Erb, M., et al. Omigapil ameliorates the pathology of muscle dystrophy caused by laminin-alpha2 deficiency. J Pharmacol Exp Ther. 331 (3), 787-795 (2009).
- Malerba, A., et al. Chronic systemic therapy with low-dose morpholino oligomers ameliorates the pathology and normalizes locomotor behavior inmdxmice. Mol Ther 1. 9 (2), 345-354 (2011).
- Grounds, M. D., Radley, H. G., Lynch, G. S., Nagaraju, K., De Luca, A. Towards developing standard operating procedures for pre-clinical testing in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Neurobiol Dis. 31 (1), 1-19 (2008).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscul Disord. 22 (1), 34-42 (2012).
- Rayavarapu, S., Van de meulen, J. H., Gordish-Dressman, H., Hoffman, E. P., Nagaraju, K., Knoblack, S. M. Characterization of Dysferlin Deficient SJL/J Mice to Assess Preclinical Drug Efficacy: Fasudil Exacerbates Muscle Disease Phenotype. PLoSOne. 5 (9), e12981 (2010).
- Valle, F. P. Effects of strain, sex, and illumination on open-field behavior of rats. Am J Psychol. 83, 103-111 (1970).
- Ramos, A., et al. Evaluation of Lewis and SHR rat strains as a genetic model for the study of anxiety and pain. Behav Brain Res. 129, 113-123 (2002).
- Bowman, R. E., Maclusky, N. J., Diaz, S. E., Zrull, M. C., Luine, V. N. Aged rats: sex differences and responses to chronic stress. Brain Res. 1126, 156-166 (2006).
- Sakai, K., Crochet, S. Differentiation of presumed serotonergic dorsal raphe neurons in relation to behavior and wake-sleep states. Neuroscience. 104, 1141-1155 (2001).
