Summary
Åpent felt aktivitetsnivå brukes til å vurdere lokomotiv og atferdsaktivitetsnivå. Denne protokollen gir et godt designet, standardisert protokoll som skal brukes i prekliniske studier for nevromuskulære lidelser.
Abstract
Det åpne feltet aktivitet overvåkingssystem grundig vurderer bevegelses og atferdsaktivitetsnivå av mus. Det er et nyttig verktøy for å vurdere lokomotiv svekkelse i dyremodeller av nevromuskulær sykdom og effekt av medisiner som kan forbedre bevegelse og / eller muskelfunksjon. Det åpne feltet aktivitetsmåling gir et annet mål enn muskelstyrke, som ofte vurderes av gripestyrke målinger. Det kan også vise hvordan legemidler kan påvirke andre kroppens systemer, så vel når det brukes med ekstra utfallsmål. I tillegg tiltak som total distanse speile 6 min gangtest, en klinisk studie effektmål. Imidlertid er åpent felt aktivitet overvåking også forbundet med betydelige utfordringer: Open feltaktivitetsmålinger varierer i henhold til dyr belastning, alder, kjønn, og døgnrytmen. I tillegg kan romtemperatur, fuktighet, lys, støy og til og med lukt påvirke utfallet vurderings. Samlet denne manuscript gir en godt testet og standardisert åpent felt aktivitet SOP for prekliniske studier i dyremodeller av nevromuskulære sykdommer. Vi gir en diskusjon av viktige hensyn, typiske resultater, dataanalyse og detalj de styrker og svakheter ved åpent felt testing. I tillegg gir vi anbefalinger for optimal studiedesign ved bruk av åpent felt aktivitet i en preklinisk studie.
Introduction
Dyremodeller har vært nyttig for å lære om sykdomsmekanismer, men deres nytte i å forutsi virkningen av behandling i kliniske studier har ofte blitt utfordret 1-3. Mange "lovende" prekliniske studier er publisert hvert år; Men svært få av de foreslåtte tiltakene viser positive resultater når flyttet til klinisk utprøving. Disse avvikene er ofte tilskrives publikasjonsskjevhet, overoptimistisk konklusjoner, og dårlig utformet og gjennomført pre-kliniske studier som fører til uforklarlige resultater 1-3.
Med dagens fremskritt innen legemiddelutvikling for nevromuskulære lidelser, er det et økende behov for godt designede prekliniske studier. Spesielt er det et behov for strenge metoder som kan gjennomføres i et standardisert og blindet måte, med validerte, reproduserbare og oversett effektmål. Som medlem av den Medfødt muskelsykdom Consortium, medønsket om å gjennomføre strengere prekliniske studier, deler vi her vår Standard Operating Procedure (SOP) for Open Feltet aktivitet. Denne SOP ble tidligere validert 4 og publisert som en del av TREAT-NMD er SOP for Duchenne muskeldystrofi (DMD) dyremodeller fem. Vi har brukt denne metoden til å fenotype og teste den terapeutiske effekt av en rekke medikamenter i en rekke dyremodeller av neuromuskulære sykdommer, inkludert Lama2 dy-2J / J (Dy2J) mus, en dyremodell for medfødt muskeldystrofi (CMD) 6,7 . I sin tur, denne artikkelen tilpasset fra vår tidligere utgitt TREAT-NMD SOP 5.
Det åpne feltet aktivitet overvåkingssystem grundig vurderer bevegelses og atferds aktivitet hos mus, noe som kan være forbundet med lokomotiv funksjon. Testen er også mye brukt for å vurdere angst ut og utforskende atferd 8-10. Spesielt det åpne feltet er et nyttig verktøy for assessing lokomotiv verdifall i dyremodeller av nevromuskulær sykdom 11,12 og effekten av terapeutiske legemidler som kan forbedre bevegelse og / eller motorisk funksjon 6,7,13,14. Det åpne feltet aktivitetsvurdering gir et annet mål enn muskelstyrke, som ofte måles med grep styrke, og det viser hvordan legemidler kan påvirke andre kroppens systemer (dvs. sentralnervesystemet) samt fem. I tillegg, det åpne feltet aktivitetstiltak, total distanse, speiler 6 min gangtest, en klinisk studie effektmål, som fokuserer på submaksimal trening ytelse og livskvalitet 15,16. Totalt dette gjør det åpne feltet aktivitet teste en gunstig sekundær eller hjelpe effektmål å bruke i prekliniske studier. Imidlertid har det åpne feltet aktivitet overvåking system også betydelige utfordringer knyttet til den. Testen er atferdsmessige og kan være ganske variabel som det er påvirket av et mangfold av eksternfaktorer. For eksempel kan dette problemet bli påvirket av utforskende kjøring (dvs. kognisjon), angst, sykdom, døgnrytme, miljøfaktorer, genetisk bakgrunn, i tillegg til motoreffekt 10. Som et resultat er det viktig å gjennomføre dette tiltaket på en standardisert måte med et kontrollert miljø. Protokollen presenteres her beskriver vårt åpne feltaktivitet SOP i detalj. Det gir trinnvise prosedyrer og nærmere omtale av viktige hensyn å kontrollere miljøforhold og bidra til å redusere variabiliteten, typiske resultater, dataanalyse, og vurderingen styrker og svakheter i mer detalj.
Protocol
MERK: Åpent felt aktivitet overvåking systemet bruker et åpent felt Pleksiglass kammer med fotocelle emittere og reseptorer jevnt fordelt langs omkretsen av kammeret (figur 1). Disse fotocelle emittere og reseptorer opprette en xy rutenett av usynlige infrarøde stråler. Når et dyr er plassert i kammeret, beveger seg om, forårsaker bjelke pauser. Vertikale sensorer er også til stede for å vurdere vertikale aktivitetsnivået (dvs. oppdrett atferd) også. Analysatoren registrerer informasjonen strålen pause og raskt analyserer den. Datamaskinen programvare beregner deretter flere aktivitetstiltak over forhåndsinnstilte tidsperioden. Disse tiltakene omfatter: horisontal aktivitet (enheter), vertikale aktivitet (enheter), total distanse (cm), bevegelse (sek), og resten (sek) 5.
MERK: Generelt testing rommet skal være temperatur og fuktighet-kontrollert, med jevn belysning. Testlokalene bør være jevnt disbidratt om rommet og bør ikke plasseres i direkte lys, mørke kroker, eller skygget områder. Alle instrument akklimatisering og testing skal utføres på samme tid hver dag (for eksempel om morgenen) og av de samme personene. Disse personene bør bli blindet til dyret behandlingsgruppen, og genotype når det er mulig.
Følgende protokoll er utført under veiledning og godkjenning av Barnas National Medical Center IACUC.
1. Instrument Akklimatisering
- Plasser mus i testrommet i hjem bur i ca 10 min å akklimatisere. Forlate rommet under akklimatiseringsperiode.
- Tilbake til testing rommet og slå på aktivitets kamre. Selv om data ikke blir samlet inn på dette tidspunktet, vil dette ytterligere etterligne testing miljø.
- Fjern forsiktig hver mus fra sine hjem bur og umiddelbart plassere dem i testkamrene. Hvis aktivitetenkammeret inneholder et senter skillevegg som deler kammeret inn i kvadranter (figur 1), plassere en mus i hver kvadrant er tom.
- Når alle dyrene lastes inn i testkamre, legg lokket på toppen av hvert testkammeret. La rommet i løpet av denne tiden akklimatisering.
- Etter 60 min, gå tilbake til rommet. Fjern lokket fra hver testkammer og returnere forsiktig hver mus til hans eller hennes respektive hjem buret.
- Rengjør hvert kammer med desinfiserende og papirhåndklær. Påse at ingen skitt partikler er igjen i kammeret.
MERK: Hvis flere økter blir kjørt hver dag, grundig rengjort hver testkammer i mellom hver økt. - Gjenta trinn 1-6 for 4 påfølgende dager.
MERK: Utfør akklimatisering en uke før første datainnsamling. Hvis dyr er testet flere ganger i løpet av en studie, bare utføre akklimatisering før første runde med testing for å unngå tilvenning. I tillegg, tilfeldig tildele dyrene i et nyttboksen hver økt. Spor seksten oppdrag gjennom hele studien.
2. Datainnsamling
- Plasser mus i testrommet i hjem bur for 10-30 min å akklimatisere. La rommet i løpet av denne tiden.
- Etter 10-30 min, gå tilbake til testrommet. Slå på aktiviteten kamrene og åpne den tilhørende dataprogram på datamaskinen er koblet til kamrene. Hvis kammeret inneholder en kvadrant skillevegg, setter du partisjonen på dette tidspunktet.
MERK: Hvis testkammeret inneholder en kvadrant skillevegg, kan to dyr bli plassert i testkammeret under datainnsamling. Et dyr kan plasseres i den fremre venstre kvadrant og en i det bakre høyre kvadrant (figur 1).
MERK: Ikke plasser dyr i alle fire kvadranter under datainnsamlingen eller i samme rad eller kolonne. Å plassere dyrene i disse retninger interfererer med xy rutenett av infrarøde stråler og dyret bevegelsen vil væreunøyaktig målt. - Konfigurere datamaskinen programvare for å utføre en prebeam sjekk. Denne konfigurasjonen vil gi en til å drive en pre-bjelke sjekk følge det eksperimentelle oppsettet, og forut for innsetting av dyrene i testkamrene (se nedenfor).
MERK: Når prebeam sjekken er kjørt, vurderer dataprogram funksjon av xy infrarøde stråler. For eksempel kan den fastslå om fotocellen senderne og reseptorer er blokkert, og ute av stand til på riktig måte detektere bevegelse i kammeret. - Sett de primære datainnsamling parametere i dataprogram for å samle seks 10 min blokker av data (dvs. samle inn data for totalt 60 min), og deretter angi de riktige dato, filnavn, og mus ID-numre.
- Når alle parametere er satt, kjøre prebeam sjekk. Hvis et kammer ikke består prebeam sjekke det er mest sannsynlig på grunn av dårlig justering av kvadraturens skillelinjen eller testkammer. Hvis dette skjer, juster kvadraturens diviDer-og prøvekammeret til sensorene ikke lenger er sperret og systemet fastslår at testkammeret er klar. Hvis dette ikke løser problemet, refererer den manuelle instrument.
- Når alle testkamrene er klare, forsiktig fjerne musen fra hans eller hennes hjem bur og umiddelbart plassere ham eller henne inn i testkammeret. Legg merke til ID av musen og sørge for at det samsvarer med en inngått datamaskin.
- Når alle dyrene er hensiktsmessig lagt i testkamrene, plassere lokket på toppen av hvert kammer. Deretter velger du riktig kommando i dataprogram for å starte datainnsamlingen. På denne tiden, vil analysatoren og dataprogrammer starte innspillingen aktivitetsnivå i henhold til datainnsamling parametere.
- La testing rommet for resten av testperioden.
- Ved fullføring av testperioden (dvs. 60 min senere), umiddelbart tilbake til testrommet. Lagre dataene, og deretter gå tilbake hvert dyr til deres respektive hjem buret.
- Rengjør alle enheter med en desinfiserende og papirhåndklær.
MERK: Hvis flere økter blir kjørt hver dag, grundig rengjort hver testkammer i mellom hver økt. - Eksportere data til et regneark og deretter avslutte programmet.
- Kontroller data for å sikre at de ble tatt opp. Hvis dataene ikke ble registrert, eller dyrene sov gjennom helheten av datainnsamling tidsperiode, utføre en ekstra dag for datainnsamling.
MERK: Et dyr anses å være "sovende" hvis det ikke beveger seg gjennom hele 60 min testing varighet. - Gjenta trinn 02.01 til 02.12 for fire påfølgende dager.
MERK: Hvis dyr er testet ved flere tidspunkter gjennom hele varigheten av en studie, ikke utfører åpen feltaktivitetsmålinger mer enn en gang i måneden for å unngå tilvenning. I tillegg tilfeldig tildele dyrene til en ny boks hver økt. Spor seksten oppdrag gjennom hele studien.
3. Data Analysis
- Beregn gjennomsnittlig horisontal aktivitet (enheter), vertikale aktivitet (enheter), total distanse (cm), bevegelse (sek), og resten (sek) per mus og gruppe. Dataprogram beregner og rapporterer den totale horisontal aktivitet (enheter), vertikal aktivitet (enheter), total distanse (cm), bevegelse (sek), og resten (sek) over datainnsamlingsperioden (dvs. 60 min) for hver mus. Beregn middelverdien for hver av de nevnte parametere fra de 4 dagene av datainnsamling.
- Før du utfører noen statistiske analyser, vurdere normalitet av data ved hjelp av Shapiro-Wilk test, og sjekk for uteliggere ved hjelp av Grubb test. Fjern eventuelle vesentlige uteliggere (p <0,05).
- For normalfordelte data, sammenligne midler mellom grupper ved hjelp av enten en uavhengig sample t-test eller en enveis ANOVA og post-hoc test med p-verdier justert for multiple sammenligninger avhengigeing på det totale antallet behandlingsgruppene.
- For data som ikke er normalfordelt, sammenligne medianverdier mellom grupper som bruker enten Wilcoxon rank sum test, eller en Kruskal-Wallis test og rang sum test med resulterende p-verdier justert for multiple sammenligninger avhengig av det totale antallet behandlingsgruppene.
Representative Results
Når du analyserer åpne feltet aktivitetsdata, har vi fokus på noen få utvalgte målinger som gir en vurdering av aktivitetsnivået som vanligvis reflekterer lokomotiv funksjon. Disse parametrene inkluderer: horisontal aktivitet, vertikal aktivitet, bevegelse, hvile, og total distanse. Generelt vil dyrene med redusert muskelfunksjon være mindre aktiv og har lavere ambulatorisk aktivitet. Dette er vanligvis assosiert med redusert horisontal aktivitet, vertikal aktivitet, total distanse og bevegelse tid, og økt hviletid 5,6,12,17. Tvert imot, dyr med usvekket muskelfunksjon eller som behandles med terapi som reduserer progresjon av forverret muskel patologi er mer sannsynlig å vise et høyere aktivitetsnivå 6,7,14,17.
For å vise et eksempel på typiske resultater oppnådd ved bruk av denne protokollen i dyremodeller av nevromuskulær sykdom, vi gitt data fra en longitudinell studie we tidligere gjennomført i Dy2J medfødt muskeldystrofi (CMD) dyremodell seks. Kort sagt, inneholder Dy2J modellen en avkortet form av LAMA2 genet som resulterer i bakben lammelse, demyelinisering, og dystrofe skjelettmuskel endringer. Virkningen av denne muskelen patologi på aktivitetsnivå er observert i disse musene. For eksempel, de Dy2J musene i studien hadde en tendens til å stille lavere horisontale aktivitetsnivå, og mindre distanse, i forhold til deres alder og kjønns matchet BL / 6 villtype kontroller gjennom hele studien (figur 2); imidlertid var ikke alltid disse forskjeller signifikante. Mangelen av betydning er mest sannsynlig på grunn av den lille prøvestørrelse og høyt intragruppe variasjon i BL6 data. Variasjon er typisk for åpent felt aktivitet data; Imidlertid, til disse data i særdeleshet mangel tilstrekkelig kraft bestemme om disse gruppene er signifikant forskjellig fra hverandre. Vanligvis en n = 10-12 bør brukes til å oppdage statistically signifikante forskjeller 5,17. For eksempel, når et større prøvestørrelse som brukes, slik det ble gjort i SJL studie (se den andre BL6 bar i figurene 3B, 3D og 3E) signifikante forskjeller mellom gruppene kan observeres. De Dy2J dyrene viste også et fullstendig tap av vertikale aktivitetsnivå, noe som gjenspeilet deres bakben lammelse, og i sin tur, en manglende evne til å oppdra (figur 2B) 6. Til slutt er det viktig å være oppmerksom på kjønnsforskjeller i aktivitetsnivået. For eksempel, hadde en tendens hunnene å være mer aktive enn menn, viser høyere nivåer av horisontale aktivitet, vertikal aktivitet, og total distanse (figur 2); men disse forskjellene var ikke statistisk signifikant.
Vi har også gitt data fra flere tidligere studier utført i andre dyremodeller av nevromuskulære sykdommer, samt å markere flere andre faktorer som påvirker handlingivity nivåer (figur 3). For eksempel aktivitetsnivået varierer etter genetisk bakgrunn 10. BL10 villtype mus viser større horisontal aktivitet, vertikal aktivitet, og total distanse i forhold til alder og kjønn matchet BL6 villtype mus (figur 3). Dette er en viktig observasjon å merke seg, som anvendelse av de uriktige kontrollstammer i en undersøkelse kan gjengi data ubrukelig. Sekund, aktivitetsnivå varierer etter sykdomsmodell og fenotype (figur 3). For eksempel SJL-mus, en dyremodell for lem beltet muskeldystrofi-2B (LGMD-2B), viser det laveste nivået av vannaktivitet og total distanse, etterfulgt av Dy2J mus og MDX-mus, en dyremodell for Duchenne muskeldystrofi (Tall 3A, 3C). Imidlertid Dy2J mus, på grunn av deres bakben lammelse, viser det laveste nivået av vertikal-aktivitet (figur 3B). Det er også viktig å merke seg at jo høyere nivå avaktivitet i MDX fenotypen er mest sannsynlig tilskrives den økte aktiviteten av BL10 bakgrunn belastning. Til slutt fremhever dette tallet betydningen av dyre alder / sykdom patologi på tidspunktet for testing. For eksempel, ved 30 ukers alder, ingen forskjeller kan oppdages i aktivitetsnivå mellom mdx mus og deres alder-og kjønn matchet BL10 villtype kontroller (figur 3). Imidlertid, ved 6 uker gamle, rundt toppen nekrotisk fase i MDX musemodellen, MDX mus viser en betydelig reduksjon i vertikal-aktivitet, og horisontal aktivitet. En nedgang er også observert i total distanse, men denne forskjellen er ikke signifikant (figur 3) 4.
Figur 1. Åpne feltet aktivitetsapparater. To åpne feltet apparater med sentrum Quadrant skillevegger, og topper. Dersom uttak kvadraturens skillevegger er tilstede, bør dyrene kun kan plasseres i den fremre venstre (1, 3) og rygg høyre kamrene (2, 4) i hver boks under testing for å oppnå gyldige avlesninger.
Figur 2. Åpne feltaktivitetsdata. Typiske åpent felt aktivitetsdata for Dy2J (grå linje, n = 3) og alders- og kjønn matchet BL6 kontroll belastning (svart linje, n = 3) mus ved 14, 19, 23, 25, og 30 ukers alder (A - F) a) Horisontal aktivitet (vilkårlige enheter) hanner, B) Horisontal aktivitet (vilkårlige enheter) hunner, C) Vertikal aktivitet (vilkårlige enheter) hanner, D) Vertikal aktivitet (vilkårlige enheter) kvinner. E) Total distanse traveLED (cm) menn, E) Total distanse (cm) kvinner. Data ble samlet inn over fire dager, og i gjennomsnitt per mus og gruppe. De samme mus ble testet ved hvert tidspunkt. Dataene representerer gjennomsnitt ± SEM. Data tidligere utgitt seks. Dy2J og BL6 mus ble sammenlignet med en uavhengig sample T-test på hver gang-punkt. En p-verdi <0,05 ble ansett som signifikant. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.
Figur 3. Åpne feltaktivitet data flere stammer Typiske atferdsaktivitetsdata fra mannlige BL10 (6 ukers alder, n = 8, 25-30 ukers alder, n = 10)., Mdx (6 ukers alder, n = 9; 25-30 uker gamle, n = 15), BL6 (kontrollgruppe for Dy2J mus, n = 3; kontrollgruppe for SJL-mus, n = 13), Dy2J (n = 3), og SJL (n = 13) mus på vaført aldre. A) Horisontal aktivitet (vilkårlige enheter) data fra BL10 og mdx mus på 6 og 25-30 ukers alder, B) Horisontal aktivitet (vilkårlige enheter) data fra BL6, Dy2J, og SJL mus ved 25-30 uker alder, C) Vertikal aktivitet (vilkårlige enheter) data fra BL10 og MDX mus på 6 og 25-30 ukers alder, D) Vertikal aktivitet (vilkårlige enheter) data fra BL6, Dy2J, og SJL mus ved 25-30 ukers alder , E) Total distanse (cm) data fra BL10 og mdx mus ved 6 og 25-30 ukers alder, og F) Total distanse (cm) data fra BL6, Dy2J, og SJL mus ved 25-30 ukers alder . Dy2J, dyremodell for CMD med laminin α2 genmutasjon på BL6 bakgrunn; SJL, dyremodell for lem belte muskeldystrofi-2B (LGMD-2B); MDX, dyremodell for DMD på BL10 bakgrunn. Det er ingen dysferlin forsynte SJL kontroll. Data er midler ± SEM. B, C og D inneholder data tidligere publiskur 6,17. Data ble ikke normalfordelt; derfor data ble sammenliknet med en Wilcoxon rang summer test. En p-verdi på p <0,05 ble betraktet som signifikant. Følgende sammenligninger ble gjort for hver parameter: a) BL10 og mdx mus ved seks ukers alder, p <0,05; b) BL10 og mdx mus ved 25-30 ukers alder, ikke signifikant; c) Dy2J og BL6 matchet kontrollgruppe belastningsskader mus ved 25-30 ukers alder, p <0,05; d) SJL og BL6 matchet kontrollgruppe belastning på 25-30 ukers alder, p <0,001; e) BL10 mus ved 25 til 30 ukers alder, og BL6 (kontrollgruppe for Dy2J mus) mus ved 25 ukers alder, p <0,01; f) BL10 på 25-30 ukers alder og BL6 (kontrollgruppe for SJL mus) på 25-30 ukers alder, p <0,001.
Discussion
Det åpne feltet aktivitetsmåling er en in vivo-forsøk som kan være gunstig for å vurdere sykdomsutvikling og legemidlets effekt i dyremodeller av nevromuskulær sykdom 6,7,11-14. Som vist i figur 2, gir det en vurdering av aktivitet som vanligvis reflekterer lokomotiv funksjon. Dette er et annet mål enn muskelstyrke, noe som gjør det til et ideelt sekundær eller hjelpe effektmål å utføre i en preklinisk narkotika studie. I tillegg er det en klinisk relevant 15, ikke-invasiv måling, noe som kan utføres flere ganger i løpet av varigheten av et studium. Imidlertid er atferds og lokomotiv aktivitet også påvirket av andre faktorer i tillegg (dvs. eksperimentator håndtering, miljøforhold, og kognisjon) skaper variasjon i åpent feltaktivitetsdata. Målet med denne artikkelen er å gi en godt testet og standardisert protokoll som reduserer variasjon og gir resultater å være compared tvers av flere laboratorier, i håp om å forbedre oversettelsen innen vårt felt.
En hovedulempe med dette tiltaket er at det er svært variabel, og påvirkes av en rekke eksterne faktorer. Men vi tok hensyn til dette når du utvikler protokollen. Vi vurderte en rekke testprotokoller som varierer i varighet 1-5 dager med datainnsamling. Til slutt fant vi ut at å utføre instrument akklimatisering før datainnsamling til å bli kjent dyrene med testkammeret miljø og utøvende 4 dager med datainnsamling betydelig redusert mengden av variasjon i utfallsdata fem. Denne protokollen ble opprinnelig utviklet for å vurdere atferdsmessige og lokomotiv aktivitet i mdx mus modell; Imidlertid ble denne protokollen nylig validert i Dy2J dyremodell samt seks. Det er foreslått at protokollen standardiseres i din lab for hvert dyr modell før du bruker den i en preklinisk studie.
Åpent felt aktivitet varierer med genetisk bakgrunn 17, kjønn 18-20, 18 år, og døgnrytmen 21. Dette krever dyr av samme alder, kjønn og genetisk bakgrunn som skal vurderes på samme tid. Under planlegging, bør forsiktig tanke settes i å avgjøre i hvilken alder eller aldre åpent felt aktivitetsnivået vil bli vurdert. Hvert dyr modell har sin egen distinkte sykdomsprogresjon og lokomotiv og atferds fenotype, som varierer i alvorlighetsgrad og etter alder 6,15 (figur 2 og figur 3). Derfor er det viktig å bestemme klinisk og patologisk relevante tidspunkter for å vurdere åpent felt aktivitet tiltak. Det totale antall dyr som trengs i hver behandlingsgruppe for å detektere statistisk signifikante forskjeller varierer fra dyremodell, alder og kjønn i tillegg. Derfor bør relevante beregninger utvalgsstørrelsen også utføres under planlegging å determine det totale antall dyr som trengs i hver behandlingsgruppe for å detektere statistisk signifikante forskjeller. Disse beregningene bør også ta hensyn til ekstra utfallsmål brukt i studien (f.eks grep styrke målinger eller histologiske analyser). Basert på våre beregninger makt, vi bruker vanligvis 10-12 dyr per behandlingsgruppe. I tillegg bør det tas spesielt hensyn til hva kontroll belastning er brukt i studien. Det er en tendens til uriktig kontrollstammer som skal brukes i prekliniske studier. For eksempel er BL6 mus ofte brukt som en kontroll påkjenning for mdx mus; derimot, er det MDX-mus på en BL10 bakgrunn. Som vist i figur 3, BL10 mus er mye mer aktive enn BL6 mus, noe som gjør det umulig å sammenligne MDX og BL6 data. Ved utføring av prekliniske studier med MDX mus, bør BL10 mus brukes som kontroll belastning. Videre, hvis en studie blir utført med Dy2J mus, BL6 musene bør brukes som kontrol belastning.
Små endringer i miljøet kan også ha betydelig innvirkning aktivitetsnivå. Disse inkluderer belysning, temperatur, fuktighet, lukt, støy og menneskelig aktivitet 4,15. Derfor er det meget viktig at testing kan utføres i et temperatur-og fuktighetskontrollert rom med ikke-direkte belysning på samme tid hver dag fem. Testkamre bør være jevnt fordelt i hele rommet og ikke under direkte belysning eller i skyggen eller mørke hjørner fem. Dyr bør være tilfeldig plassert i sine testkamre hver dag for å redusere virkningene av varierende miljøforhold i hele rommet, og de bør få lov til å akklimatisere seg til testrommet i 10-30 min før datainnsamlingen. Sørg for å spore boksen tildeling av hvert dyr under hele studien for å sikre at enhver påvirkning av boks / miljø er likt fordelt mellom de ulike behandlingsgruppene. Individene lasting av animals i testkamre og håndtering av dyr i hele varigheten av studien bør bli blindet til behandlingsgruppen, og belastningen dyr når det er mulig. I mange tilfeller er berørt genotyper er vesentlig forskjellig fra tilknyttede kontroller og blinding er ikke mulig. Men enkeltpersoner bør alltid bli blindet mellom behandlede og ubehandlede grupper. Videre bør alle personer forlate rommet under datainnsamlingen for å redusere støy og forstyrrelser i rommet, og alle kamrene må rengjøres grundig etter hver økt datainnsamling. Disse tiltak vil i betydelig grad redusere variasjoner i dataene. Det er viktig å merke seg at dyrene er også svært utsatt for 15 tilpasning. Derfor er det foreslått at dyr tas ut av prøvekammeret direkte etter 60 min for datainnsamling hver dag, og det åpne feltet aktivitet vurderes ikke mer enn en gang i måneden.
Den totale distansen og total flytteringstidsmålinger har en tendens til å være de mest sensitive åpent felt aktivitetsmålinger fem. I Dy2J modellen, tenderer den vertikale aktivitetsmåling for å være den mest følsomme åpne feltet aktivitet mål (figur 3); Imidlertid, kan det være vanskelig å fange opp nøyaktige vertikale aktivitetsmålinger i mindre dyr. For eksempel er det mulig at en mindre dyr vil oppvise stell oppførsel og sensoren vil ikke innta den på grunn av høyden av den vertikale sensor. Som et resultat, anbefaler vi at du tester dyr tidligst fem uker gamle. Det er også mulig at et dyr vil sove gjennom hele varigheten av en datasamling økt. Hvis dette er tilfelle, er det hensiktsmessig å legge til en ekstra dag med datainnsamling. Endelig kan dårlig innretting av kvadranten divider eller blokkering av sensorer inne i boksen resultere i unøyaktige data i tillegg. Derfor er det meget viktig å utføre en sensor precheck, før testing, og gjennom alle data etter avsluttethver datainnsamling økt.
Forsiktighet bør også utvises ved å analysere åpne feltet aktivitetsdata. Åpent felt aktivitet data har en tendens til å være ikke-normalfordelt og har uteliggere fire. Før du utfører noen statistiske analyser, våre biostatisticians anbefaler sjekke dataene for normalitet og uteliggere. Hvis data er ikke-normalfordelt, bør man vurdere å benytte en parametrisk test når man sammenligner midler. I tillegg bør alle dataene bli analysert av en individuell blindet til det som behandlingsgruppene er.
Samlet har det åpne feltet aktivitet tiltaket store fordeler: a) det er en helhetlig vurdering av både bevegelses og atferds aktivitet, noe som er sterkt, men ikke alltid korrelert med lokomotiv funksjon; b) det er en enkel mål å utføre; c) det krever ingen dyr håndtering under testing; d) det er en ikke-invasiv måling som kan utføres mer enn én gang i løpet av varigheten av et study; e) ingen spesiell opplæring er nødvendig for å utføre testen; f) flere dyr kan testes på en gang; og g) det er en klinisk relevant effektmål 5,16. Men når jeg tester therapeutics, husk at andre faktorer kan påvirke et dyrs atferd, og i sin tur åpne feltet aktivitetsmålinger. Legemidler kan ha CNS og eller andre kropps brede effekter, og situasjonen kan også påvirkes av en stressende miljø. Som et resultat, kan det være vanskelig å skille dersom endringer i lokomotiver eller adferds aktivitet er relatert til forandringer i muskelfunksjon, muskelstyrke, eller er en følge av bivirkninger av legemidlet. Derfor bør ytterligere funksjonelle, histologiske og eller molekylære assay bli utført i tillegg. Dette standardisert protokoll har også blitt brukt i andre muskelsykdommer 4,17; Imidlertid, som vist i figur 3, pilotstudier skal utføres først å vurdere følsomheten av måle i dyretmodell.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Denne publikasjonen er finansiert gjennom Cure CMD, fransk Muscular Distrophy Association (AFM), en translasjonsforskning stipend fra muskeldystrofi Association, National Institutes of Health (1K26RR032082, 1P50AR060836-01, 1U54HD071601, 2R24HD050846-06), Department of Defense ( W81XWH-11-1-0330, W81XWH-11-1-0782, W81XWH-10-1-0659, W81XWH-11-1-0809, W81XWH-09-1-0599) og en pilot stipend fra Parent Prosjekt Muscular Distrophy ( PPMD).
Dette papir er en av flere i en rekke SOP for rutinemessig brukt metoder i medfødt muskelsykdommer feltet. Det gjenspeiler innsatsen diskutert og etablert av over 20 eksperter på området medfødt muskelsykdom på de siste Medfødt muskelsykdom Consortium Workshop, som arrangeres i april 2013 i Washington, DC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| VersaMax Open Field Activity Monitoring system with acrylic test chambers, and X, Y, Z axis sensors | AccuScan Instruments, Inc. Columbus Ohio, USA | Retired | |
| Fusion Open Field Activity Monitoring system with acrylic test chambers, and X, Y, Z axis sensors | Omnitech Electronics, Inc. Columbus Ohio, USA | Suggested system currently on the market | |
| Computer | Dell, Inc. | ||
| Materials | |||
| Virkon-S Broad spectrum disinfectant (potassium peroxymonosulfate/ sodium chloride) | Pharmacal Research Laboratories, Inc. | ||
| Mice | |||
| B6.WK-Lama2dy-2J/J (Dy2J) | Jackson Lab | 000524 | |
| C57BL/6J (BL6) | Jackson Lab | 000664 | |
| SJL/J (SJL) | Jackson Lab | 000686 | |
| C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J (mdx) | Jackson Lab | 001801 | |
| C57BL/10ScSnJ (BL10) | Jackson Lab | 000476 | |
References
- Worp, H. B., Howells, D. W., Sena, E. S., Porritt, M. J., Rewell, S., O'Collins, V., Macleod, M. R. Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies?. PLoS Med. 7 (3), 1000245-10 (2010).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Spurney, C., et al. Preclinical drug trials in the mdx mouse: Assessment of reliable and sensitive outcome measures. Muscle Nerve. 39, 591-602 (2009).
- Nagaraju, K., Carlson, G., De Luca, A. Behavioral and locomotor measurements using open field animal activity monitoring system. TREAT-NMD SOP Number M2.1.002. 2, (2010).
- Yu, Q., et al. Omigapil treatment decreases fibrosis and improves respiratory rate in dy(2J) mouse model of congenital muscular dystrophy. PLoS One. 8 (6), e65468 (2013).
- Sali, A., et al. Glucocorticoid-treated mice are an inappropriate positive control for long-term preclinical studies in the mdx mouse. PLoS One. 7 (4), e34204 (2012).
- Belzung, C., Griebel, G. Measuring normal and pathological anxiety-like behaviour in mice: a review. Behav Brain Res. 125, 141-149 (2001).
- Prut, L., Belzung, C. The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors: a review. Eur J Pharmacol. 463, 3-33 (2003).
- Walsh, R. N., Cummings, R. A. The open-field test: A critical Review. Psychological Bulletin. 83, 482-504 (1976).
- Raben, N., Nagaraju, K., Lee, E., Plotz, P. Modulation of disease severity in mice with targeted disruption of the acid alpha-glucosidase gene. Neuromuscul Disord. 10, 283-291 (2000).
- Nagaraju, K., et al. Conditional up-regulation of MHC call I in skeletal muscle leads to self-sustaining autoimmune myositis and myositis-specific autoimmune myositis and myositis-specific autoantibodies. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (16), 9209-9214 (2000).
- Erb, M., et al. Omigapil ameliorates the pathology of muscle dystrophy caused by laminin-alpha2 deficiency. J Pharmacol Exp Ther. 331 (3), 787-795 (2009).
- Malerba, A., et al. Chronic systemic therapy with low-dose morpholino oligomers ameliorates the pathology and normalizes locomotor behavior inmdxmice. Mol Ther 1. 9 (2), 345-354 (2011).
- Grounds, M. D., Radley, H. G., Lynch, G. S., Nagaraju, K., De Luca, A. Towards developing standard operating procedures for pre-clinical testing in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Neurobiol Dis. 31 (1), 1-19 (2008).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscul Disord. 22 (1), 34-42 (2012).
- Rayavarapu, S., Van de meulen, J. H., Gordish-Dressman, H., Hoffman, E. P., Nagaraju, K., Knoblack, S. M. Characterization of Dysferlin Deficient SJL/J Mice to Assess Preclinical Drug Efficacy: Fasudil Exacerbates Muscle Disease Phenotype. PLoSOne. 5 (9), e12981 (2010).
- Valle, F. P. Effects of strain, sex, and illumination on open-field behavior of rats. Am J Psychol. 83, 103-111 (1970).
- Ramos, A., et al. Evaluation of Lewis and SHR rat strains as a genetic model for the study of anxiety and pain. Behav Brain Res. 129, 113-123 (2002).
- Bowman, R. E., Maclusky, N. J., Diaz, S. E., Zrull, M. C., Luine, V. N. Aged rats: sex differences and responses to chronic stress. Brain Res. 1126, 156-166 (2006).
- Sakai, K., Crochet, S. Differentiation of presumed serotonergic dorsal raphe neurons in relation to behavior and wake-sleep states. Neuroscience. 104, 1141-1155 (2001).
