Summary
この記事では、精子形成のユニークなプロセスを研究するために精巣マウス細胞のトランスフェクション技術としてインビボでマウス精巣のマイクロインジェクションやエレクトロポレーションについて説明します。提示されたプロトコルは、ガラスキャピラリーの準備、輸出管を経由してマイクロインジェクション、エレクトロポレーションによるトランスフェクションの工程を含む。
Abstract
このビデオでは、物品の寄与はマイクロインジェクションおよびin vivoでのマウス精巣のエレクトロポレーションの包括的な説明を提供します。精巣マウス細胞のこの特定のトランスフェクション技術は、精子形成におけるユニークなプロセスの研究を可能にします。
以下のプロトコルは、プラスミド構築物で精巣マウス細胞のトランスフェクションに焦点を当てています。具体的には、強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）および赤色蛍光タンパク質（DsRed2の）を発現するpDsRed2-N1ベクターを発現するレポーターベクターのpEGFP-C1を用いた。両方の符号化されたレポーター遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター（CMV）の制御下にあった。
マウスの精巣への遺伝子導入を行うために、レポータープラスミド構築物は、生きているマウスの精巣に注入される。そのために、麻酔した動物の精巣を露出し、マイクロインジェクションの部位を調製する。当社の優先場所注射は、精巣および精巣上体の間に精子の解剖輸送ルートとして、最終的に接続された精巣網で、輸出管である。このように、マイクロインジェクション後の精細管の充填が良好に起因染色DNA溶液の使用を管理および制御される。その色の細管構造によって精巣の十分な充填を観察した後、臓器をエレクトロポレーションされています。これは、精巣細胞へのDNA溶液を転送することができます。インキュベーションの3日後、精巣を除去し、そしてトランスフェクションの成功を示す、緑色または赤色蛍光について顕微鏡下で調べた。
一般的に、このプロトコルは、DNAまたはRNA-を配信するために使用することができるが、するために生きているマウスの精巣に構築（オーバー）を発現またはin vivo遺伝子機能解析に容易に遺伝子をノックダウン。さらに、レポーター構築物又は推定上の遺伝子レグラを研究するのに適しているトーリー要素。このように、エレクトロポレーション技術の主な利点は、低労力と組み合わせて、高速なパフォーマンスだけでなく、代替技術と比較して必要な適度な技術設備とスキルです。
Introduction
哺乳動物の精子形成を連続して成熟した半数体精子へと発展させるために、有糸分裂、減数分裂および分化を受けている自己再生幹細胞の洗練されたプロセスであると考えられる。これらの形態学的変化は、異なる細胞型によって編成され、深遠な試みにもかかわらず、それは細胞培養1,2に、これらのプロセスを模倣することは不可能である。そのため、今までの精子形成の研究は、in vivoモデルとして生物に依存しています。一般に、遺伝子機能の研究は、通常、トランスジェニック動物に基づいている。しかしながら、動物モデルのこの種を生成し、維持することは時間がかかり、コストがかかり、非常に精巧である。これは、世代にわたって導入遺伝子を生成し、維持するために必要な長い育種プロセスに起因する。グラムをターゲットにするとさらに、トランスジェニックまたはノックアウトアプローチによる生物全体の遺伝子操作は、生理的障害を引き起こす傾向がある複数の地域に不可欠な機能を備えたエン例えば 、精巣の外側または全身。
さらに、いくつかの一過性のトランスフェクション法は、いくつかの重大な欠点に関連している。リポフェクション3および微粒子ボンバードメント4が組織に損傷を与える可能性があり、十分なトランスフェクション効率のための特定のセルの深さに制限されているのに対し、例えば、ウイルス媒介遺伝子導入の典型的な欠点は、免疫反応および追加の安全規制の可能挑発である。
これとは対照的に、一過性トランスフェクションの別の一般的な方法として、エレクトロポレーション（EP）は、 生体内でトランスフェクションおよび一貫性のあるin vivoでの遺伝子解析に有効にするための有望な技術を構成しているようだ。一般的に、EPはナノ秒以内に結果的に媒介される細孔を有するローカル膜貫通電圧に依存する動的な現象と呼ばれている。これらのギャップは、ミリ秒間維持することができ、十分なトンO DNA、RNA、または小分子5へのアクセス権を付与します。印加電圧が高すぎると、EPの通常は一時文字は、熱産生およびセル5の結果として不可逆的な損傷があまりにも包括的透過性の誘導に打ち消される。
ここでは、エレクトロポレーションは、in vivoでの精巣の遺伝子特性を解明するために、遺伝的精巣形質転換のために利用されることができる効果的かつ経済的なトランスフェクション系であることを示している。この記事では、輸出管およびマウス精巣のその後のエレクトロポレーションを介したプラスミド調製、マイクロインジェクションに対応しています。この手順は、精子形成の過程を調べるために、in vivoでのマウス精巣の精細管の、速く特異的かつ効率的なトランスフェクションを達成するための最適な手段となり得る。
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Protocol
すべて行った動物実験はローカル倫理委員会（LandesamtエリーゼLandwirtschaft、LebensmittelsicherheitウントFischerei、メクレンブルク=フォアポンメルン州、ドイツ）によって承認されている。
1プラスミドの準備
- 動物の免疫反応を回避することができるように、プラスミド調製のために、エンドトキシン除去緩衝液を用いてプラスミド精製キット（材料テーブルを参照）、または類似の方法を使用する。マニュアルの指示に従ってください。プラスミド溶液を希釈するためのddH 2 Oを使用する。
- 最高速度（20,000×g）でDNA溶液を紡糸して破片を除去します。その後、上清を回収。
- 分光光度計（資料を参照）、プラスミド濃度を決定する。
- 1-3μgの（DNA）/μlにのddH 2 Oを有するプラスミド濃度を調整します。注：より高い濃度があまりにも粘性の注射液が発生する可能性がありながら、より低い濃度では、トランスフェクション効率が低下します。加えて、トランスフェクション効率は、プラスミドの大きさに依存し、個別にテストされなければならない。
- 注射の前に、例えばで5μlのPBS（10倍）と5μlのファストグリーン（0.5％）と一緒に40μlのプラスミドソリューションミックスを準備します。ファストグリーンは、注入プロセスを追跡するために必要とされる。好ましくは、薄壁のPCRチューブあるいはパラフィルムを使用しています。注：精巣のサイズに応じて、20〜50μlの容量は、各精巣のために必要とされる。
マイクロインジェクションピペットの作製
- マイクロインジェクションピペットを調製するためのホウケイ酸毛細血管を（材料の表を参照）を使用します。
- 垂直キャピラリープラーとガラスキャピラリーを引いて（材料の表を参照）。
- そっとバンディングによって鉗子でキャピラリー先端ブレーク。チップは通常、50〜80ミクロン、直径が約1センチです。これらは、組織を貫通するのに十分な剛性ではないので、長すぎるのヒントを避けるようにしてください。
- 最後、舎で（材料の表を参照）マイクロピペットbevelerを使って、30°〜45°の角度で先端部をrpen。
- 注射液ミックス（プラスミドの準備を参照）、マイクロインジェクションピペットをロードします。小さなシリンジでガラスキャピラリーの背面に解決策を適用します。注：導電率を低下させるだけでなく、場合によっては組織の損傷の原因となりますので、それ以外の場合、これらはプラスミド溶液と一緒に精細管に注入され、ロード中に気泡を避けるようにしてくださいと。
3麻酔と手術
- 無菌材料（ すなわち、注射器、注射針、手術器具など）を使用して、無菌状態で操作を実行します。これは、動物の感染を低減し、良好な生存率を確保する。
- 6-8週齢でエレクトロポレーションのための雄マウスを使用してください。
- 術後鎮痛治療を初期化するには、鎮痛薬で、マウスを提供する手術前に日に飲料水を追加しました。このお尻可能性が高い手術後hypodipsia（減少取水）の場合、先制鎮痛をURES。この目的のために、例えば、小児イブプロフェン懸濁液（20 mg / ml）を用いて飲料水を露出させる。薬用飲料水も初日と同一の濃度の回復の2に供給してください。これは、C57BL / 6J歳8週間25グラムの5ミリリットル/ dの飲料水や体重の有効な7.5 mg / kgを一日量を意味する。この鎮痛レジメンは、根本的な痛みの軽減と高福祉26と一緒に加速し、回復を保証します。
- 1の比率（材料表を参照）。手術当日麻酔作業溶液を調製するために、1で10％ケタミンおよび2％キシラジンを混ぜる。
- 動物を麻酔するためには、0.25ミリリットル/麻酔液を皮下（;キシラジン= 0.025グラム/ kgのケタミン=キロ0.125グラム/）100mgの体重を適用します。マウスの臓器障害や怪我を防ぐために、骨盤および四肢の間に注射部位を使用してください。通常、10分が必要とされているマウスまで深く麻酔をかけている。
- 麻酔中の乾燥を防ぐために、獣医軟膏をマウスの眼をカバー。
- 応答の完全な欠如による顕著です深い麻酔停止を、テストします。そのためには、単に動物のつま先を挟ま。
- 手術を開始するには、電気シェーバーまたは同様に腹部の毛を除去し、steriliumまたは類似した動作領域を消毒。
- 直接腹部領域の中心にある包皮腺上記腹側切開を加えます。その場所で、第離れて皮を引き、約8〜14ミリメートルの小さな横方向の皮膚のカットを実施しています。その後、腹部の筋肉の層に沿って継続する。
注：病変は、動物に害を低減するためにできるだけ小さくすべきである。 - 添付の精巣を露出し、ちょうど切開部位（ 図2A）の横に先立って準備された防水使い捨ての紙のドレープの上に配置するために慎重に腹部の脂肪パッドを引き上げます。
- a〜fの双眼鏡を使用してください注入の対象となる輸出管をケガニ動脈管の遠心性は、精巣および精巣上体の間に細かい血管の接合部として識別されます。それは、著名な精巣動脈に隣接して配置される。動脈管は、動脈に45°の角度でほぼ動作し、目に見えて頭の精巣上体に入る。注：マウスの年齢に応じて、動脈管は通常、脂肪組織に埋め込まれている。
- この脂肪組織の輸出管をクリアするために細かい鉗子を使用してください。その後、周囲を損なうことなく、ダクトの明確な視認性を確保するために、無菌の紙片にリリース動脈管を配置します。
4。マイクロインジェクションとDNAの応用
- マイクロマニピュレーター/インジェクタユニットへのプラスミド溶液がロードされているマイクロインジェクションピペットを、接続してください。
- 精巣網（ 図2B）の方を向いて先端を輸出管へのマイクロインジェクションの針を平行に配置します。
- 細かいピンセットを使用して、マイクロインジェクションピペットを介してダクトを取り除く。それを上に引っ張りながらキャピラリーダクトと平行に保たれていることを確認します。
注：この手順では、マイクロマニピュレーターで針を移動させることにより、容器を貫通するよりも便利です。 - 精巣に向かって慎重に針を向けると、それが白膜（ 図2C）の直下に精巣網を貫通するのと同様に停止します。
注：精巣網を行き過ぎることの場合には、プラスミド溶液は、間質空間へ漏れる。これは、一般的に精細管をトランスフェクションの失敗につながる。 - PI：100ヘクトパスカル、TI：0.2秒、およびpc：0ヘクトパスカル（ 図2D）プラスミド溶液の注射のために以下の設定でマイクロインジェクターを利用する。
- 緑色の助けを借りて、ステータスを充填精巣を観察することにより、全体の注入プロセスを監視します。精巣にのみ、PLでその体積の3分の2まで充填されていることに注意してくださいasmid溶液（ 図2E）。
注：注入量を超えた場合、精巣組織が悪影響を受ける可能性がある。
精巣の5。エレクトロポレーション
- 効果的なエレクトロポレーションを有効にするには、PBS（1×）でピンセット電極を浸す。これには、十分な導電性を保証します。
- スムーズに湿った電極（ 図2F）との間の精巣を絞る。エレクトロとの電気抵抗を測定します。
- 精巣に現在適用されます。 50ミリ秒パルス時間と950ミリ秒間隔時間の一定期間を持つ4つの異なる精巣サイトで40 Vの8矩形パルスを実行します。
6。創傷閉鎖とポスト手術
- エレクトロポレーションが終了すると、元の場所に精巣を配置します。
- 外科用縫合糸（資料を参照）、内側筋層を縫う。
- 縫合クリップ（材料表を参照）を採用することにより、皮膚を閉じます。肌アップウィットを引いて時間ピンセット。筋層を除外することを確認します。 5mm以下の距離で各クリップを配置します。
注：外科用縫合糸がマウスで飲み込むことができるため、縫合糸クリップは、皮膚病変を閉じるため好まれる。 - マウスは、37℃暖かいパッド上に鍛えている無菌の空のマウスのケージに入れ、滅菌したペーパータオル上麻酔から回復できるようにします。パッドは、熱勾配を作成するケージの半分の温暖化を確実にする必要があります。動物の場合、これが原因ケージ内の温度さまざまな個人、最も快適なエリアを検索することができます。応力をさらに低減することができるように、また、滅菌ペーパータオルのシートでマウスをカバーする。注：マウスの体表面は、体重に関連してまれに高いので、より大きな動物と比較した場合、熱支持体は、げっ歯類の正常な回復のために特に重要である。
- 操作した動物が完全に目覚めたとき、私を転送完全装備新しいマウスケージへのさらなる回復のためのT。古いケージにまたはマウスのグループに戻し、動物を入れないでください。ケージは創傷感染を防ぐために、できるだけ清潔で無菌であることを確認してください。全体回復プロセスを監視します。それは完全に回復し、正常に動作するように表示されるまで、バック動物飼育施設にマウスを転送するには、待ってください。
注：追加per-と手術後の戦略がプリチェットコーニングKR ら 6によって議論されている。
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Representative Results
それはプロトコルに従って使用されるように、インビボでマウス精巣のマイクロインジェクションおよびエレクトロポレーションを行うための実験設定を図1に示されている。それが工業的に製造されたマイクロピペットを取得することができるにもかかわらず、われわれは、引っ張って私たち自身のピペットを生成することが好ましい（ 図1A ）と、彼らは私たちのニーズに合ったように（ 図1B）ガラスキャピラリーを面取り。マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーションのための装置は、図1Cに示されている。トランスフェクション効率の理由から、方形波エレクトロポレーターを利用することが重要である。
図2に、輸出管の準備に特別な重点を置いて、マウスの手術の重要なステップが表示されます。 Figur（精巣を露出させ、このコンテキスト（ 図2A）および輸出管に双眼観察によって識別され、脂肪組織から遊離電子2B）。続いて、輸出管が（ 図2C-E）マイクロインジェクションピペットを穿刺し、プラスミド溶液を投与する。最後に、ロードされた精巣は、2つの電極間で圧搾し、印加方形波パルス（ 図2F）によってトランスフェクトされる。
このインビボトランスフェクションアプローチは、さまざまなレポーター遺伝子をコードする別のプラスミドの使用を可能にする。ここでは、強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）および赤色蛍光タンパク質（DsRed2の）のトランス活性化を可能にすることもpDsRed2-N1（ 図3C）ベクターを発現するレポーターベクターのpEGFP-C1（ 図3A）、使用される。この例では、両方のレポーター遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター（CMV）の制御下にあった。
トランスフェクションの成功を評価するために、マイクロインジェクションおよびエレクトロポ精巣3日全体の手順の後に回収し、性蛍光下で観察cence顕微鏡法（ 図3）。詳細な調査のために、精巣は、スライスした（5μm）を同様に青色の核で、その結果、ツープロ3で対比パラフィンに埋め込まれた、ホルムアルデヒド - 固定した。最終的に、切片を蛍光顕微鏡によって調べた。可能なトランスフェクションの結果の2つの例を図4に見ることができる。レポーター遺伝子EGFPの発現は緑色蛍光で示される、DsRed2ののトランスは、赤色発光によって指定される。
図1 の生体内微量注入し、マウス精巣のエレクトロのための機器。ガラスキャピラリー先端がbevelerマイクロピペットを利用し先鋭化している間マイクロピペットプラー（A）を用いて形成されている（
in vivoでの図2。イラストは、従来の外科的介入を含め、マウスでのマイクロインジェクションやエレクトロポレーションの進行精巣。精巣へのアクセスは、以前に麻酔をかけてきたマウスの腹部の開口を介して付与されます。カットがちょうど包皮腺の上に作られている。精巣を明らかにした後、それは腹部脂肪パから解放される dsは（A）。両眼観察の下で、輸出管が識別され、脂肪を除去した。針の鋭い端が輸出管（B）の方を向いている間にマイクロインジェクションピペットは、動脈管の横に位置している。ガラスキャピラリは、動脈管に挿入され、精巣網（C）内に直接配置されるように精巣に向かって移動する。精細管のDNAアプリケーションおよび充填の手順は、ファストグリーン（D）の助けを借りて監視される。精巣のみの3分の2は、組織の（E）の害を防ぐためにつけられます。最終的なエレクトロポレーションのステップのために、精巣、電気正方形のパルス（F）を適用するためにピンセット型の電極の間に圧迫されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3ホールマウント精巣は3日のin vivoエレクトロポレーション後 、蛍光顕微鏡下では、強化された緑色蛍光タンパク質のC57BL / 6マウスの発現を示すのトランスフェクト精巣- 。のeGFP（A）および赤色蛍光タンパク質- DsRed2の（C）の両方pEGFP-上で符号化それぞれC1およびpDsRed2-N1プラスミド、。両方のレポーター遺伝子の発現は遍在的にアクティブなCMV-プロモーター要素の制御下にあった。標的精細管の効果的なトランスフェクションは、蛍光強度によって示される。パネル（B）および（D）は、非トランスフェクト対照精巣の自己蛍光を示している。スケールバー= 1mmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3日間のpEGFP-C1プラスミド。固定マウス精巣の切片（5μm）のトランスフェクションの結果が3日のpEGFP-C1プラスミドと一方的なエレクトロポレーションの後に示されているとの一方的なin vivoでのエレクトロポレーション後のマウス精巣の4セクション 。成功しました緑色蛍光によって示さ精巣管状cellsareをトランスフェクトした。 TO-PRO-3対比核は青色発光（A及びB）によって検出可能である。丸い構造は精細管内の細胞の組織化のための典型的なものである。スケールバー=20μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
生殖生物学の分野での研究が、特に男性の生殖能力と精子形成の分野で、必然的に生物に依存しています。精巣機能を調べるために、充分な細胞培養/ in vitro系は半数体精子成熟1,2の二倍体精原細胞からのすべての重要な形態学的変化を反映することが可能な確立されていない。このように、遺伝子改変動物の発生がしばしば必要と男性生殖生物学のような貴重なツールとしてである。この目的を達成するために、トランスジェニック、かなりの数、ノックアウトおよびノックインマウスは、雄の生殖能力への洞察を提供されて作成されている。それにもかかわらず、トランスジェニックマウスの作製は、通常、受精卵の前核に遺伝子構築物を注入することによって行われる。しかしながら、この技術は、時間がかかり、専門の研究室によって行われることになっている。ノックアウトを生成したり、ノックイン動物する手順より一層洗練されています。
生きているモデル生物の遺伝子機能を研究する別の方法は、一過性トランスフェクションによるものである。しかし、ウイルスベクターと共通の形質導入は、免疫原性、または他の非特異的反応を引き起こし、特別な安全規制を必要とする場合があります。リポフェクション3および微粒子ボンバー4のアプローチは、残念ながら、特定の細胞の深さに抑制され、さらには組織に悪影響を誘発する可能性があります。
それにもかかわらず、標的組織に直接的に印加される電気正方形のパルス、いわゆるエレクトロポレーションを用いて、それはたとえば 、生体組織、ここにマウス精巣をトランスフェクトすることが実際に可能である。さらに、この方法は、低コスト、低設備と適切に熟練した研究室の個人が必要となります。
持続的に遺伝子組み換え動物モードと比較してin vivoでのトランスフェクション法に関連するさらなる注目すべき利点はlsが同時トランスフェクションの可能性である。トランスジェニックまたはノックアウトマウスには、通常唯一の遺伝子構築物を運ぶ一方で、in vivoでのトランスフェクションは、同じセル内の異なる遺伝子構築物の総合的な同時分析を可能にします。野生型および変異遺伝子効果の比較検討が可能なように、これは、ウミシイタケルシフェラーゼに対するYFPまたはGaussia-対GFP、 例えば 、さまざまなレポーター遺伝子を使用することによって行うことができる。
また、細胞型特異的プロモーターの適用によって、遺伝子構築物の発現は、精巧に精巣内の特定の細胞に向けることができる。例えば、これは、単にセルトリ細胞または精母細胞に精巣遺伝子発現を可能にすることができる。
この記事で紹介したプロトコルは、男性の生殖生物学の分野における2つの重要なメソッドをカバーしています。最初のものは、注射キャピラリーの調製物を精細管にマイクロインジェクションである。このテクニカルNIQUEは、一般的に、受信者7にトランスジェニック動物から、または8の異種移植の状況のいずれかで幹細胞移植/生殖に関与している。第二の方法は、特定の細胞またはむしろ組織への入り口を確保し、原形質膜の一過性の孔だけでなく、プラスミドのような荷電した分子の指向性バルクの流れを誘導することができるエレクトロポレーショントランスフェクションである。エレクトロポレーションによる巨大分子のこの特定の方向は、頻繁に多くの場合、 子宮内 9,10 で行われ、一方的に神経細胞のトランスフェクションまたは網膜11の開発に認識されている。
先行する詳細な方法プロトコルは、最初の重要なステップとして、雄マウスの麻酔、腹部病変を介した精巣の博覧会、輸出管の調製並びに動脈管へのマイクロインジェクションが含まれる。これらのアクションは非常に要求が厳しいように、強くoを実行する前に、死んだ動物の最初の練習にお勧めします生きたマウスでの基本。また、命令は適切に精巣のエレクトロポレーションを行うためにどのように注入し、プラスミドDNA及びと精細管を埋める方法が設けられている。
なぜならEPの間の電気の印加により、熱産生は、特に、高電圧での組織損傷を誘発するかもしれない。高められた電圧によってトランスフェクション効率は12、13、15の増加は12-14の縮小精巣の影響を伴う。最も有利な電圧範囲は、精巣の完全性、正常な精子の質16、正常な交尾行動17、子孫産生能16-20と同様に十分なトランスフェクション効率の維持の際に小さな効果を保証し、30〜50 Vの間であると思われる。
導入遺伝子構築物についての遺伝子発現強度は、蓬田らは 21も著しく減少はexprを明らかにした3日間環状プラスミド-DNAのに対し、EP実施後、線状化ベクターのessionは明らかにまだセルトリ細胞で最も高い1と35日後に式を維持します。これは、ここで行ったようにエレクトロポレーションのためのプラスミド構築物を使用する場合に最良の結果が得られることを示唆している。本手法では、原因この期間が十分創傷治癒、細胞の完全性の修復、ならびにレポータータンパク質のeGFPおよびDsRed2の所望の適切な発現に十分であるという観察に3日エレクトロポレーション後、トランスフェクション効率を調べた。従って、外科的介入、全トランスフェクション手順に従って、3日のインキュベーション時間は、可能な限り集中として蛍光シグナルが信頼できるトランスフェクションの結果を確実に検出できるように、遺伝子発現を含む適切に復元された細胞機能を保証するために必要であると思われる。トランスフェクション効率に関しては、蓬田ら 21は番目のことが明らかになったE体細胞セルトリ細胞は明らかに生殖細胞よりもEP-トランスフェクションに対してより応答性である。私たちは、ターゲットと対照プラスミドでの精巣の同時トランスフェクション、異なるレポーター遺伝子の各符号化することをお勧めします。
提示エレクトロポレーション法は、男性の生殖細胞と生殖能力のプロセスを参照する可能性のある問題の広いスペクトルにも適用可能である。例えば、それは、精子特異的遺伝子17,22の調節エレメントを分析するために利用することができる。この方法はまた、低分子干渉RNA 23の機能喪失研究のために適しており、機能獲得型24を検討する 。さらに、研究グループが既に18,20,25を示しているようであっても、治療的処置およびトランスジェニック子孫の生成のためのEPを達成するための有望な可能性がある。
このため、輸出管のmicroiと併せて生体内電気穿孔におけるマウス精巣の新規方法論的なアプローチを示したプラスミド構築のnjectionがうまくいけば成功し、精子形成の性質を解明するための貴重な技術まで上昇する。
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Disclosures
マーテンミカエリス、アレクサンダーSobczak、そしてヨアヒムM. Weitzelは生殖生物学の研究所で採用、家畜バイオロジーライプニッツ研究所（FBN）は、Dummerstorf、ドイツは、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。
Acknowledgments
私たちは、精巣マイクロインジェクションを教えるためのミュンスター大学で生殖医療アンドロロジーのセンターのビルギットWesternstroeerに感謝します。加えて、私たちは技術支援のためのウルスラAntkewitzとペトラRecklingに感謝しています。私たちは、この作品（WE2458 / 10-1）を支持するためのドイツ研究財団（DFG）をお願いいたします 。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Sigma | 1-15 PK | |
| Spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| Micropipette puller | Narishige | PC-10 | vertical capillary puller |
| Microinjection capillaries | Clark | GC100-10 | borosilicate standard wall |
| Micropipette beveler | Bachofer | Typ 462 | rotating disk beveler |
| Electroporator | Nepagene | CUY 21EDIT | square wave electroporator |
| Tweezer electrodes | Nepagene | CUY 650P5 | 5 mm Ø disk electrodes |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Cold light source | Zeiss | KL 1500LCD | |
| Microinjection pump | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | homemade | XYZ cross table | |
| Surgical instruments | FST | scissors, forceps, needle holder | |
| Fine forceps | FST | Dumont #5, #7 | efferent ducts preparation |
| Michel clip applying stapler | FST | Michel, 12029-12 | |
| Michel suture clips | FST | Michel, 12040-01 | 7.5 x 1.75 mm |
| Surgical suture | Catgut, Markneukirchen, Germany | Catgut 00 | |
| Syringe with 30 G needle | B. Braun | Omnican 40 | to load micropipette and for anesthesia |
| Plasmid isolation kit | Promega | Cat. # A2495 | plasmid Midiprep |
| Plasmid pEGFP-C1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-promoter + EGFP |
| Plasmid pDsRed2-N1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-promoter + DsRed2 |
| Fast Green dye | Sigma | F7258-25G | for dilution in ddH2O |
| 10% Ketamine | Serum Werk, Bernburg, Germany | Urotamin | mix in a rate 1:1 with xylazine |
| 2% Xylazine | Serum Werk, Bernburg, Germany | Xylazin | mix in a rate 1:1 with ketamine |
| Sterilium | Bode Chemie | Sterillium | disinfection |
| Vet ointment | S&K Pharma, GmbH | Kerato Biciron 5%, Augensalbe | opthalmic ointment to prevent eye dryness |
| To-Pro-3 iodide | Invitrogen | T3605 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | |||
| 1.37 M NaCl | Carl Roth | 3957.1 | |
| Ibuprofen, Dolormin | Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany | 01094902 | analgesic pediatric solution (NSAID) for postsurgery pain relief |
| 27 mM KCl | Carl Roth | 6781.1 | |
| 100 mM Na2HPO4·2H2O | Carl Roth | T106.2 | |
| 18 mM KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
References
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