Summary
Dit artikel beschrijft micro-injectie en elektroporatie van muis testis in vivo als een transfectie techniek voor testiculaire muizencellen unieke processen spermatogenese bestuderen. Het gepresenteerde protocol omvat stappen van glazen capillaire preparaat, micro-injectie via de efferente kanaal en transfectie door elektroporatie.
Abstract
Deze video en het artikel bijdrage geeft een uitgebreide beschrijving van de micro-injectie en elektroporatie van de muis testis in vivo. Deze bijzondere techniek voor transfectie testiculaire muizencellen maakt de studie van unieke processen in spermatogenese.
Het volgende protocol is gericht op transfectie van testiculaire muizencellen met plasmide constructen. Specifiek, gebruikten we de reporter vector pEGFP-C1, bevat immers versterkt groen fluorescent proteïne (eGFP) en de vector pDsRed2-N1 expressie rood fluorescerend eiwit (DsRed2). Beide gecodeerde reporter genen onder de controle van de humane cytomegalovirus onmiddellijke vroege promoter (CMV).
Voor het uitvoeren van gen-overdracht in de muis testes, wordt de verslaggever plasmideconstructen geïnjecteerd in testes van levende muizen. Daartoe wordt de testis van een verdoofd dier blootgesteld en de plaats van micro-injectie wordt bereid. Onze favoriete plek vaninjectie is de afvoerende buis, met het uiteindelijk verbonden testis als de anatomische transportroute van de spermatozoa tussen de testis en de bijbal. Op deze wijze wordt het vullen van de testes na micro-injectie uitstekend geleide en gecontroleerd door het gebruik van gekleurde DNA oplossingen. Na het observeren van een voldoende vulling van de testis door zijn gekleurde tubulus structuur, wordt het orgel geëlectroporeerd. Dit maakt de overdracht van de DNA-oplossing in de zaadcellen. Na 3 dagen incubatie, wordt de testis verwijderd en onderzocht onder de microscoop voor groene of rode fluorescentie, illustreren transfectie succes.
In het algemeen, kan dit protocol worden gebruikt voor het leveren van DNA-of RNA-constructen in levende muis testis om (over) te uiten of knock down genen, het vergemakkelijken van in vivo gen-functie analyse. Bovendien is het geschikt voor het bestuderen reporter constructen of vermoedelijke gen regulatory elementen. Aldus, de belangrijkste voordelen van de electroporatietechniek zijn snelle prestaties in combinatie met ultralichte en de gematigde technische uitrusting en vaardigheden vergelijking met alternatieve technieken.
Introduction
Zoogdieren spermatogenese wordt beschouwd als een geavanceerd proces van zelf-vernieuwing stamcellen achtereenvolgens ondergaat mitose, meiose en differentiatie om zich te ontwikkelen tot volgroeide haploïde spermatozoa zijn. Deze morfologische veranderingen beraamd door verschillende celtypen en ondanks diepe pogingen, is het nog steeds onmogelijk om deze processen bootsen in celkweek 1,2. Vandaar onderzoek spermatogenese tot nu berust op levende organismen in vivo modellen. In het algemeen worden genfunctie studies gewoonlijk gebaseerd op transgene dieren. Het genereren en behouden dergelijke diermodel is tijdrovend, kostbare en zeer uitgebreid. Dit wordt toegeschreven aan de vereiste lange veredelingsproces voor het genereren en onderhouden van het transgen via generaties. Bovendien, de genetische manipulatie van het gehele organisme door de transgene of knockout benadering gevoelig voor fysiologische stoornissen veroorzaken bij het targeten genes met essentiële functies in meerdere regio's, bijvoorbeeld, buiten de testis of systemisch.
Verder worden sommige transiënte transfectie methoden geassocieerd met een aantal belangrijke nadelen. Bijvoorbeeld, typische nadelen van virus gemedieerde gentransfer mogelijke provocatie van immuunreacties en aanvullende veiligheidsvoorschriften, terwijl lipofectie 3 en microdeeltjes bombardement 4 het weefsel kunnen beschadigen en zijn beperkt tot een bepaalde cel diepte voldoende transfectie efficiency.
Daarentegen, elektroporatie (EP) als een andere gebruikelijke manier transiënte transfectie, lijkt een veelbelovende techniek vormt voor het mogelijk in vivo transfectie en consistent in vivo gen analyse. In het algemeen wordt EP aangeduid als een dynamisch verschijnsel dat afhankelijk van de lokale transmembraan spanning met enerzijds gemedieerde poriën in nanoseconden. Deze hiaten kunnen worden gehandhaafd voor milliseconden, voldoende to toegang tot DNA, RNA of kleine moleculen 5 toe te kennen. Wanneer de aangelegde spanning te hoog is, wordt het gewoonlijk van voorbijgaande aard van EP tegengegaan door warmte en inductie van te veelomvattend permeabilisatie met daaruit onomkeerbare beschadiging van de cel 5.
Hier laten we zien dat elektroporatie is een effectieve en economische transfectie systeem dat kan worden gebruikt voor genetische transformatie testis om testicular gen kenmerken ontrafelen in vivo. Dit artikel behandelt plasmidepreparaat, micro-injectie via de efferente leiding en de daaropvolgende elektroporatie van muis testis. Deze procedure kan het middel van keuze snel, specifieke en efficiënte transfectie van testes van muis testis in vivo bereiken om processen te onderzoeken spermatogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle uitgevoerde dierproeven zijn goedgekeurd door de lokale ethische commissie (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, Mecklenburg-Vorpommern, Duitsland).
1 Bereiding Plasmide
- Voor plasmidepreparaat Gebruik plasmide zuivering kit (zie Materialen tabel) of op dergelijke wijze met endotoxineverwijdering buffer waardoor immuunreacties van het dier kan worden vermeden. Volg de instructies van de handleiding. Employ DDH 2 O om het plasmide oplossing te verdunnen.
- Elimineer puin door het draaien van de DNA-oplossing op maximale snelheid (20.000 xg). Verzamel de bovenstaande vloeistof.
- Bepaal plasmide concentratie met een spectrofotometer (zie materialen).
- Pas plasmide concentratie met DDH 2 O tot 1-3 mg (DNA) / pl. Opmerking: Lagere concentraties zal transfectie-efficiëntie te verminderen, terwijl hogere concentraties van een te dik injectie oplossing zou kunnen veroorzaken. Trouwens, detransfectie efficiency afhankelijk van de grootte van het plasmide en is afzonderlijk te testen.
- Vóór injectie, een oplossing mengen met bijvoorbeeld 40 pi plasmide met 5 gl PBS (10x) en 5 gl snel groen (0,5%). Fast Green is vereist voor de het injectieproces. Gebruik bij voorkeur dunne wand PCR-buizen of Parafilm. Opmerking: Afhankelijk van de grootte van de testis, een volume van 20-50 gl nodig zijn voor elke testis.
2 Voorbereiding van Microinjection Pipette
- Gebruik borosilicaat haarvaten (zie Materialen tabel) voor het bereiden van de micro-injectie pipetten.
- Trek glazen capillairen met een verticale capillaire trekker (zie Materialen tabel).
- Breek de capillaire tip met een tang door zachtjes banding. De tip is gewoonlijk 50-80 urn diameter en ongeveer 1 cm lang. Probeer om tips die te lang want deze zijn niet stevig genoeg om het weefsel te penetreren zijn te vermijden.
- Eindelijk, sharpen de punt in een 30 ° tot 45 ° met een micropipet beveler (zie Materialen tabel).
- Laad de micro-injectie pipet met de injectie-oplossing mix (zie plasmidebereiding). Breng de oplossing in de achterkant van het glazen capillair met een kleine spuit. Opmerking: Probeer om luchtbellen te voorkomen aub, anders zullen deze worden geïnjecteerd in de testes, samen met het plasmide oplossing en dus zal de geleidbaarheid te verminderen en mogelijk ook leiden tot beschadiging van het weefsel.
3 Anesthesie en chirurgie
- Voer de bewerking onder aseptische omstandigheden door steriele materiaal (bijvoorbeeld, spuit, naald, chirurgische instrumenten, etc.). Dit zal een infectie van het dier te beperken en te zorgen voor goede overlevingskansen.
- Gebruik mannelijke muizen voor elektroporatie op een leeftijd van 6-8 weken.
- Om postoperatieve analgetische behandeling initialiseren, over een muis met pijnstillers toegevoegd drinkwater op de dag vóór de operatie. Deze ezelgelen een preventieve analgesie in geval van een zeer waarschijnlijke postsurgical hypodipsia (verminderde inname van water). Daartoe bloot drinkwater met bijvoorbeeld een pediatrische ibuprofen suspensie (20 mg / ml). Het gemedicineerde drinkwater moet worden geleverd op dag een en twee van herstel in dezelfde concentratie. Dit betekent een dagelijkse dosis van 7,5 mg / kg, geldig voor 5 ml / d drinkwater en lichaamsgewicht van 25 g gedurende 8 weken C57BL / 6J oud. Dit pijnstillingsprotocol garandeert een fundamentele pijn en versneld herstel, samen met een hoge welvaart 26.
- Voor het bereiden van de anesthesie werkoplossing op de dag van de operatie, meng 10% Ketamin en 2% Xylazin in een 1: 1 verhouding (zie Materialen tabel).
- Om het dier verdoven, 0,25 ml / 100 mg lichaamsgewicht anestheticum subcutaan toepassing (Ketamin = 0,125 g / kg; Xylazin = 0,025 g / kg). Gebruik een injectieplaats tussen het bekken en de ledematen om orgaanschade en letsel van de muizen te voorkomen. Gewoonlijk worden 10 min nodigtotdat de muis diep verdoofd.
- Bedek de muis ogen met dierenarts zalf tot droog tijdens anesthesie te voorkomen.
- Test diepe verdoving arrestatie, die merkbaar door een totaal gebrek aan reactie. Hiertoe net knijpen de neus van het dier.
- Om de operatie te starten, verwijder abdominale haar met een elektrisch scheerapparaat of iets dergelijks en desinfecteer het operatiegebied met sterilium of iets dergelijks.
- Wordt ventrale incisie direct boven de preputiale klieren in het midden van de buik. Op die plaats, trekt u eerst de huid weg en voeren een kleine dwarse cutane gesneden van ongeveer 8-14 mm. Dan verder langs de abdominale spierlaag.
Opmerking: De laesie moet zo klein mogelijk schade te beperken aan het dier. - Trek het buikvet pads goed naar de bijgevoegde testis bloot en plaats deze op een vooraf geprepareerde waterdichte wegwerp papieren laken net naast de incisie (Figuur 2A).
- Gebruik een verrekijker om find de efferente kanaal als de injectie doelwit. De ductus efferente is geïdentificeerd als de fijne kruising schip tussen de testis en de bijbal. Het ligt naast de prominente testiculaire ader. De ductus loopt bijna onder een hoek van 45 ° met de slagader en zichtbaar gaat de caput epididymidis. Opmerking: Afhankelijk van de leeftijd van de muis, wordt de ductus gewoonlijk begraven in vetweefsel.
- Gebruik fijn pincet om de efferente kanaal van dit vetweefsel te verwijderen. Daarna plaatst de vrijgekomen ductus op een steriele papierstrook aan de duidelijke zichtbaarheid van het kanaal te verzekeren zonder afbreuk te doen aan de omgeving.
4 Micro-injectie en DNA Application
- Sluit de micro-injectie pipet, die is geladen met het plasmide oplossing van de micromanipulator / injectoreenheid.
- Plaats de micro-injectie naald evenwijdig aan de efferente kanaal met de punt wijst naar de testis (Figuur 2B).
- Gebruik fijn pincet enstrip de leiding via micro-injectie pipet. Zorg ervoor dat de capillaire parallel wordt gehouden op het kanaal, terwijl boven te trekken.
Opmerking: Deze procedure is handiger dan het penetreren van de vaartuigen door het bewegen van de naald met de micromanipulator. - Richt de naald voorzichtig naar de testis en stop net als het dringt door de testis direct onder de tunicaalbuginea (figuur 2C).
Opmerking: Bij overreaching de testis, de plasmidenoplossing lekken in de interstitiële ruimte. Dit leidt vaak tot mislukking van transfectie van de testes. - Voor injectie van het plasmide oplossing gebruik maken van de microinjector met de volgende instellingen: pi: 100 hPa ti,: 0,2 sec, en pc: 0 hPa (figuur 2D).
- Controleer het gehele injectieproces en houdt de testis vullen toestand met behulp van de groene kleur. Zorg ervoor dat de testis alleen is gevuld tot aan 2/3 van het volume met de plasmid oplossing (figuur 2E).
Opmerking: Als de injectie volume wordt overschreden, kan de testis weefsel worden geschaad.
5 Elektroporatie van testis
- Om effectief elektroporatie staat, geniet de pincet elektroden in PBS (1x). Dit verzekert voldoende geleiding.
- Soepel knijp de testis tussen de natte elektroden (figuur 2F). Meet de elektrische weerstand met de electroporator.
- Breng stroom naar de testis. Voeren acht vierkante pulsen van 40 V op 4 verschillende testis sites met een constante duur van 50 msec puls tijd en 950 msec interval tijd.
6 wondsluiting en Post-operatie
- Bij elektroporatie is voltooid, plaatst u de testis terug in de oorspronkelijke locatie.
- Naai de binnenste spierlaag met chirurgisch hechtdraad (zie materialen).
- Sluit de huid door het gebruik van hechtdraad clips (zie Materialen tabel). Trek de huid op with pincet. Zorg ervoor dat u de spierlaag te sluiten. Plaats de clips, elk op een afstand van ten hoogste 5 mm.
Let op: Omdat chirurgisch hechtdraad kunnen worden ingeslikt door de muis, zijn hechtdraad clips voorkeur voor het sluiten van het huidletsel. - Laat de muis te herstellen van de anesthesie op steriele papieren handdoekjes in een steriele lege muis kooi, die ontlaten op een 37 ° C warm pad. Het pad moet zorgen voor de opwarming van de ene helft van de kooi maken van een warmte gradiënt. Voor het dier is dit mogelijk om te zoeken naar de afzonderlijke, meest comfortabele gebied vanwege de temperatuur variatie in de kooi. Bovendien omvatten de muis met een vel steriele papieren handdoek zodat spanning verder kan worden verminderd. Opmerking: Omdat het lichaamsoppervlak van de muis is ongewoon hoog is ten opzichte lichaamsgewicht, in vergelijking met grotere dieren, de thermische ondersteuning van bijzonder belang voor een succesvolle terugwinning van knaagdieren.
- Bij de geopereerde dier volledig is ontwaakt, overdragen it voor verder herstel naar een volledig ingerichte nieuwe muis kooi. Niet teruggezet de dieren hun oude kooi of een groep muizen. Zorg ervoor dat de kooi is zo schoon en steriel mogelijk om wondinfectie te voorkomen. Toezicht houden op de hele herstelproces. Om de muis terug naar het dier zorginstelling overdragen, wacht tot deze volledig is hersteld en lijkt normaal te gedragen.
Let op: Extra per- en post-operatieve strategieën worden besproken door Pritchett-Corning KR et al 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De experimentele instelling voor het uitvoeren van micro-injectie en elektroporatie van muis testis in vivo wordt gebruikt volgens het protocol wordt geïllustreerd in figuur 1. Hoewel het mogelijk is om industrieel vervaardigde micropipetten verwerven we liever onze eigen pipetten genereren door te trekken (figuur 1A ) en afschuining (Figuur 1B) glazen capillairen, zodat zij voorzien onze behoeften. Apparatuur voor micro-injectie en elektroporatie wordt geïllustreerd in figuur 1C. Om redenen van transfectie efficiëntie, is het van belang een blokgolf electroporator gebruiken.
Figuur 2 toont de belangrijkste stappen van de muis chirurgie met speciale aandacht voor de voorbereiding van de efferente kanaal. In dit verband is de testis wordt blootgesteld (Figuur 2A) en de efferente kanaal wordt geïdentificeerd door verrekijker observatie en vrijgelaten uit vetweefsel (Figure 2B). Vervolgens wordt de efferente kanaal aangeprikt met een micro-injectie pipet en het plasmide oplossing wordt toegediend (Figuren 2C-E). Ten slotte wordt de geladen testis ingeklemd tussen twee elektroden en getransfecteerd door toegepaste blokgolf pulsen (Figuur 2F).
Deze in vivo transfectie aanpak maakt het gebruik van verschillende plasmiden coderen voor verschillende reportergenen. Hier gebruikten we de reporter vector pEGFP-C1 (figuur 3A), die versterkt groen fluorescent proteïne (eGFP) en ook pDsRed2-N1 (figuur 3C) vector mogelijk transactivatie van rood fluorescerend eiwit (DsRed2) drukt. In ons geval, zowel reporter genen onder controle van de humane cytomegalovirus onmiddellijke vroege promoter (CMV).
Om transfectie succes ervan, werden de micro-injectie en elektroporatie testes geoogst 3 dagen na de gehele procedure en bekeken onder fluorescentie microscopie (figuur 3). Voor nader onderzoek, testes werden formaldehyde-vaste, ingebed in paraffine, gesneden (5 urn) en tegengekleurd met To-Pro-3, waardoor blauw gekleurde kernen. Uiteindelijk werden de coupes onderzocht door fluorescentie microscopie. Twee voorbeelden van mogelijke transfectie resultaten zijn te zien in figuur 4. De expressie van het reportergen EGFP wordt via groene fluorescentie, wordt de transactivatie van DsRed2 door rode emissie aangewezen.
Figuur 1 Apparatuur voor in vivo micro-injectie en elektroporatie van de muis testis. Glass haarvaten worden gevormd met behulp van micropipet trekker (A), terwijl de tips worden aangescherpt met behulp van de micropipet beveler (
Figuur 2 Illustratie van de in vivo testis micro-injectie en elektroporatie procedure in muizen en voorafgaand chirurgische ingreep. Toegang tot testis verleend via opening van de buik van de muis die eerder is verdoofd. De snede gemaakt net boven de voorhuid klieren. Na het onthullen van de testis, wordt het vrijgegeven van buikvet pa ds (A). Onder verrekijker waarneming wordt de efferente kanaal geïdentificeerd en vet-vrij. De micro-injectie pipet wordt gepositioneerd naast de ductus terwijl de punt van de naald wijst naar de afvoerende leiding (B). De glazen capillair wordt in de ductus ingebracht en wordt verplaatst naar de testis om direct in de testis (C) worden geplaatst. De werkwijze van DNA toepassing en het vullen van de testes wordt bewaakt met behulp van Fast Green (D). Slechts 2/3 van de testis wordt gevuld, om schade van het weefsel (E) te voorkomen. Voor de laatste elektroporatie stap wordt de testis ingeklemd tussen pincet-elektroden elektrische vierkante pulsen (F) van toepassing. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3 Whole mount testis 3 dagen na in vivo elektroporatie Onder fluorescentiemicroscopie getransfecteerd testis van C57BL / 6 muizen tonen expressie van versterkt groen fluorescent eiwit -. EGFP (A), rood fluorescerend eiwit - DsRed2 (C) zowel gecodeerd op pEGFP- C1 en pDsRed2-N1 plasmide, respectievelijk. De expressie van zowel reporter genen onder controle van de alomtegenwoordige actieve CMV-promotor element. De effectieve transfectie van de beoogde testes wordt aangetoond door fluorescentie-intensiteiten. Panels (B) en (D) illustreren auto-fluorescentie van getransfecteerde controle testes. Schaal bar = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4 Secties muis testis 3 dagen na unilaterale in vivo elektroporatie met plasmide pEGFP-C1. Transfectie resultaat van vaste mouse testis secties (5 urn) zijn vertegenwoordigd 3 dagen na unilaterale elektroporatie met plasmide pEGFP-C1. Succes getransfecteerde testiculaire tubulaire cellsare aangegeven met groene fluorescentie. TO-PRO-3 tegengekleurd kernen detecteerbaar blauwemissieverhouding (A en B). De ronde structuren zijn kenmerkend voor de organisatie van de cellen in de testes. Schaal bar = 20 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onderzoek op het gebied van reproductieve biologie, met name op het gebied van mannelijke vruchtbaarheid en spermatogenese onvermijdelijk gebaseerd op levende organismen. Om te functioneren van de testikels te onderzoeken, heeft geen adequate celcultuur / in vitro systeem opgezet in staat te reflecteren alle cruciale morfologische veranderingen van een diploïde spermatogonium een haploïde volwassen zaadcel 1,2. Aldus, het genereren van genetisch gemodificeerde dieren vaak noodzakelijk en als zodanig een waardevol instrument mannelijke reproductieve biologie. Hiertoe een groot aantal transgene knock-out en knock-in muizen gecreëerd die inzichten mannelijke vruchtbaarheid geleverd. Niettemin is het genereren van transgene muizen meestal door injectie genconstructen in de pronucleus van bevruchte eieren. Deze techniek is tijdrovend en moet worden uitgevoerd door gespecialiseerde laboratoria. De procedure om knock-out te genereren of knock-in dierennog meer verfijnd.
Een andere manier van het bestuderen van de functie van genen van levende organismen model is door transiënte transfectie. Echter, de gemeenschappelijke transductie met virale vectoren immunogeen of andere aspecifieke reacties kunnen veroorzaken en vereist speciale veiligheidsvoorschriften. Lipofectie 3 en microdeeltjes bombardement 4 benaderingen zijn helaas terughoudend om een specifieke cel diepte en zelfs negatieve effecten kan hebben op het weefsel veroorzaken.
Niettemin, door middel van direct aangelegde elektrische rechthoekimpulsen op het doelweefsel, zogenaamde elektroporatie, is het wel mogelijk om levend weefsel, zoals hierin muis testis transfecteren. Bovendien vereist deze werkwijze slechts lage kosten, lage landbouwmachines en goed geschoolde lab persoonlijk.
Een ander opmerkelijk voordeel geassocieerd met in vivo transfectie methoden in vergelijking met aanhoudend gen veranderd dier modusls is de mogelijkheid van co-transfectie. Terwijl transgene of knock-muizen dragen gewoonlijk slechts een genconstruct, in vivo transfectie maakt uitgebreide, simultane analyses van verschillende genconstructies binnen dezelfde cel. Dit kan door het gebruik van verschillende reportergenen, bijvoorbeeld GFP versus YFP of Gaussia- versus Renilla-luciferase, waardoor een vergelijkend onderzoek naar wildtype en mutante gen effecten mogelijk.
Verder kan door de toepassing van celtype specifieke promotors de expressie van genconstructen kunnen voortreffelijk gericht op specifieke cellen in de testis. Bijvoorbeeld, kan dit een testis genexpressie mogelijk maken net in Sertoli cellen of spermatocyten.
De in dit artikel gepresenteerde protocol heeft betrekking op twee belangrijke methoden op het gebied van mannelijke reproductieve biologie. De eerste is de micro-injectie in testes met de voorbereiding van de injectie capillair. Deze technique is gewoonlijk betrokken bij geslachtscellen / stamceltransplantatie hetzij van transgene dieren voor de ontvanger 7 of in de context van xenografting 8. De tweede methode is de elektroporatie transfectie kan induceren tijdelijke poriën in de plasmamembraan en een gerichte bulk stroom geladen moleculen zoals plasmiden, zodat toegang tot bepaalde cellen of weefsels eerder. Deze specifieke richting van macromoleculen door elektroporatie vaak gewaardeerd in eenzijdig neurale cel transfectie vaak in utero 9,10 of in ontwikkeling retina 11.
De voorgaande gedetailleerde methode protocol omvat de eerste cruciale stappen anesthesie mannelijke muizen, de uiteenzetting van testis via abdominale laesie, de bereiding van het efferente kanaal en de micro-injectie in de ductus. Aangezien deze acties zijn heel veeleisend, is het sterk aangeraden om de eerste training op dode dieren vóór het uitvoeren van operations op levende muizen. Bovendien worden de instructies over het injecteren en vul de testes met plasmide-DNA en hoe de elektroporatie van de testis naar behoren uit te voeren.
Door de toepassing van elektriciteit gedurende EP kan warmteproductie weefselbeschadiging vooral bij hoge spanning veroorzaken. Deze toename in transfectie-efficiëntie 12, 13, 15 door verhoogde spanning gaat gepaard met bijwerkingen van testiculaire krimpen 12-14. De gunstigste spanningsbereik lijkt 30-50 V, kleine effecten op testicular integriteit garanderen, een normale spermakwaliteit 16, normaal voortplantingsgedrag 17, de handhaving van nakomelingen productie capaciteit 16-20 en voldoende transfectie efficiëntie.
Wat genexpressie intensiteit van overgebrachte gen constructen, Yomogida e.a.. 21 is ook gebleken een duidelijk verminderd exprsessieschijven gelineariseerd vectoren 3 dagen na implementatie EP terwijl circulair plasmide-DNA duidelijk nog in stand expressie na 35 dagen met de hoogste in Sertoli cellen. Dit suggereert dat de beste resultaten worden verkregen bij gebruik van plasmide constructen voor elektroporatie zoals ze gedaan. In onze benadering, onderzochten we de transfectie-efficiëntie 3 dagen na elektroporatie door de waarneming dat deze periode is voor een adequate wondheling, herstel van cel integriteit en de gewenste juiste expressie van de reporter eiwitten eGFP en DsRed2. Aldus wordt een incubatietijd van 3 dagen na de chirurgische ingreep en de gehele transfectie procedure lijkt noodzakelijk adequaat hersteld celfuncties zoals genexpressie zodat een fluorescentiesignaal zo intensief mogelijk kan worden gedetecteerd zodat een betrouwbare transfectie resultaat garanderen. Wat transfectie efficiëntie, Yomogida e.a.. 21 is gebleken dat de somatische Sertoli cellen zijn blijkbaar beter inspelen op de EP-transfectie dan kiemcellen. We raden co-transfectie van testis met doel en controle plasmiden die elk coderen voor een ander reportergen.
De gepresenteerde elektroporatie benadering is toepasbaar op een breed spectrum van mogelijke problemen te verwijzen naar mannelijke kiemcellen en vruchtbaarheid processen. Zo kan het worden gebruikt voor het analyseren regelelementen van spermatogenese-specifieke genen 17,22. De methode is ook geschikt voor het verlies-van-functie studies met kleine interfererende RNA 23 en gain-of-function studies 24. Daarnaast zijn er veelbelovende mogelijkheden om tot bereiken EP therapeutische behandeling en het genereren van transgene nakomelingen onderzoeksgroepen reeds aangetoond 18,20,25.
Vandaar dat de geïllustreerde nieuwe methodologische benadering muis testis in vivo elektroporatie in combinatie met efferente kanaal microinjection plasmide constructen hopelijk temperaturen van waardevolle techniek voor succesvol ontrafelen van de aard van spermatogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Marten Michaelis, Alexander Sobczak, en Joachim M. Weitzel werkzaam bij het Instituut voor Reproductieve Biologie, Leibniz Institute for Farm Animal Biology (FBN), Dummerstorf, Duitsland, verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij danken Birgit Westernstroeer van het Centrum voor Reproductieve Geneeskunde en andrologie aan de Universiteit van Münster voor het onderwijzen van de testis micro-injectie. Trouwens, we zijn dankbaar Ursula Antkewitz en Petra Reckling voor technische ondersteuning. Wij danken de Duitse Research Foundation (DFG) voor de ondersteuning van dit werk (WE2458 / 10-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Sigma | 1-15 PK | |
| Spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| Micropipette puller | Narishige | PC-10 | vertical capillary puller |
| Microinjection capillaries | Clark | GC100-10 | borosilicate standard wall |
| Micropipette beveler | Bachofer | Typ 462 | rotating disk beveler |
| Electroporator | Nepagene | CUY 21EDIT | square wave electroporator |
| Tweezer electrodes | Nepagene | CUY 650P5 | 5 mm Ø disk electrodes |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Cold light source | Zeiss | KL 1500LCD | |
| Microinjection pump | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | homemade | XYZ cross table | |
| Surgical instruments | FST | scissors, forceps, needle holder | |
| Fine forceps | FST | Dumont #5, #7 | efferent ducts preparation |
| Michel clip applying stapler | FST | Michel, 12029-12 | |
| Michel suture clips | FST | Michel, 12040-01 | 7.5 x 1.75 mm |
| Surgical suture | Catgut, Markneukirchen, Germany | Catgut 00 | |
| Syringe with 30 G needle | B. Braun | Omnican 40 | to load micropipette and for anesthesia |
| Plasmid isolation kit | Promega | Cat. # A2495 | plasmid Midiprep |
| Plasmid pEGFP-C1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-promoter + EGFP |
| Plasmid pDsRed2-N1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-promoter + DsRed2 |
| Fast Green dye | Sigma | F7258-25G | for dilution in ddH2O |
| 10% Ketamine | Serum Werk, Bernburg, Germany | Urotamin | mix in a rate 1:1 with xylazine |
| 2% Xylazine | Serum Werk, Bernburg, Germany | Xylazin | mix in a rate 1:1 with ketamine |
| Sterilium | Bode Chemie | Sterillium | disinfection |
| Vet ointment | S&K Pharma, GmbH | Kerato Biciron 5%, Augensalbe | opthalmic ointment to prevent eye dryness |
| To-Pro-3 iodide | Invitrogen | T3605 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | |||
| 1.37 M NaCl | Carl Roth | 3957.1 | |
| Ibuprofen, Dolormin | Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany | 01094902 | analgesic pediatric solution (NSAID) for postsurgery pain relief |
| 27 mM KCl | Carl Roth | 6781.1 | |
| 100 mM Na2HPO4·2H2O | Carl Roth | T106.2 | |
| 18 mM KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
References
- Reuter, K., Schlatt, S., Ehmcke, J., Wistuba, J. Fact or fiction: In vitro spermatogenesis. Spermatogenesis. 2, 245-252 (2012).
- Hunter, D., Anand-Ivell, R., Danner, S., Ivell, R.
- Zizzi, A., et al. fluorescent protein as indicator of nonviral transient transfection efficiency in endometrial and testicular biopsies. Microsc. Res. Tech. 73, 229-233 (2010).
- Williams, R. S., et al. Introduction of foreign genes into tissues of living mice by DNA-coated microprojectiles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2726-2730 (1991).
- Bockmann, R. A., de Groot, B. L., Kakorin, S., Neumann, E., Grubmuller, H., Kinetics, statistics, and energetics of lipid membrane electroporation studied by molecular dynamics simulations. Biophys. J. 95, 1837-1850 (2008).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Brinster, R. L., Avarbock, M. R. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11303-11307 (1994).
- Schlatt, S., Von, S. V., Schepers, A. G. Male germ cell transplantation: an experimental approach with a clinical perspective. Br. Med. Bull. 56, 824-836 (2000).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), (2007).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), (2011).
- Blackshaw, S. In vivo electroporation of developing mouse retina. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Yomogida, K., Yagura, Y., Nishimune, Y. Electroporated transgene-rescued spermatogenesis in infertile mutant mice with a sertoli cell defect. Biol. Reprod. 67, 712-717 (2002).
- Ryoki, S., Park, H., Ohmori, Y., Shoji-Tanaka, A., Muramatsu, T. An integrase facilitates long-lasting foreign gene expression in vivo in mouse spermatogenic cells. J. Biosci. Bioeng. 91, 363-367 (2001).
- Umemoto, Y., et al. Gene transfer to mouse testes by electroporation and its influence on spermatogenesis. J. Androl. 26, 264-271 (2005).
- Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 45-49 (1997).
- Hibbitt, O., et al. In vivo gene transfer by electroporation allows expression of a fluorescent transgene in hamster testis and epididymal sperm and has no adverse effects upon testicular integrity or sperm quality. Biol. Reprod. 74, 95-101 (2006).
- Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a. J. Exp. Zool. 286, 212-218 (2000).
- Dhup, S., Majumdar, S. S. Transgenesis via permanent integration of genes in repopulating spermatogonial cells in vivo. Nat. Methods. 5, 601-603 (2008).
- Huang, Z., et al. In vivo transfection of testicular germ cells and transgenesis by using the mitochondrially localized jellyfish fluorescent protein gene. FEBS Lett. 487, 248-251 (2000).
- Majumdar, S. S., et al. A method for rapid generation of transgenic animals to evaluate testis genes during sexual maturation. J. Reprod. Immunol. 83, 36-39 (2009).
- Yomogida, K., Yagura, Y., Tadokoro, Y., Nishimune, Y. Dramatic expansion of germinal stem cells by ectopically expressed human glial cell line-derived neurotrophic factor in mouse Sertoli cells. Biol. Reprod. 69, 1303-1307 (2003).
- Ike, A., et al. Transient expression analysis of the mouse ornithine decarboxylase antizyme haploid-specific promoter using in vivo electroporation. FEBS Lett. 559, 159-164 (2004).
- Gonzalez-Gonzalez, E., Lopez-Casas, P. P., Del, M. J. Gene silencing by RNAi in mouse Sertoli cells. Reprod. Biol. Endocrinol. 6, 29 (2008).
- Tang, H., Kung, A., Goldberg, E. Regulation of murine lactate dehydrogenase C (Ldhc) gene expression. Biol. Reprod. 78, 455-461 (2008).
- Yomgogida, K. Mammalian testis: a target of in vivo electroporation. Dev. Growth Differ. 50, 513-515 (2008).
- Hayes, K. E., et al. An Evaluation of Analgesic Regimens for Abdominal Surgery in Mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 6, 18-23 (2000).
