Summary
Denne artikel beskriver mikroinjektion og elektroporation af muse testis in vivo som en transfektion teknik til testikulære museceller at studere unikke processer spermatogenesen. Den præsenterede protokol involverer trin glaskapillar forberedelse, mikroinjektion via efferente kanalen og transfektion ved elektroporation.
Abstract
Denne video og artiklen bidrag giver en omfattende beskrivelse af mikroinjektion og elektroporation af muse testikler in vivo. Denne særlige transfektion teknik til testikulære museceller tillader undersøgelse af unikke processer i spermatogenese.
Følgende protokol fokuserer på transfektion af testikulære museceller med plasmidkonstruktioner. Specifikt har vi brugt reporter vektoren pEGFP-C1, som udtrykker forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP) samt pDsRed2-N1 vektor, der udtrykker rødt fluorescerende protein (DsRed2). Begge kodede reportergener var under kontrol af den humane cytomegalovirus immediate-early-promotoren (CMV).
For at kunne udføre genoverførsel til musetestiklerne, er reporter plasmidkonstruktioner injiceret i testiklerne af levende mus. Til dette formål er testiklerne af en bedøvet dyr eksponeret og stedet for mikroinjektion er forberedt. Vores foretrukne stedinjektion er den efferente kanalen, med den i sidste ende tilsluttede rete testis som anatomiske transportvej af spermatozoer mellem testiklerne og epididymis. På denne måde er fyldningen af sædkanalerne efter mikroinjektion glimrende styres og kontrolleres på grund af anvendelsen af farvede DNA-opløsninger. Efter at have observeret en tilstrækkelig fyldning af testis ved sin farvede tubulus struktur, er organet elektroporeres. Dette muliggør overførsel af DNA-opløsningen i de testikulære celler. Efter 3 dages inkubation testikler fjernes og undersøges under mikroskop for grøn eller rød fluorescens, der illustrerer transfektion succes.
Generelt kan denne protokol anvendes til at levere DNA- eller RNA- konstruktioner i levende mus testikel for at (over) udtrykker eller vælte gener, letter in vivo-funktion analyse. Desuden er det velegnet til at studere reporterkonstruktioner eller formodede gen regulatory elementer. Således er de vigtigste fordele ved elektroporationsteknik er hurtige resultater i kombination med lav indsats samt den moderate teknisk udstyr og færdigheder, der kræves i forhold til alternative teknikker.
Introduction
Pattedyrs spermatogenese anses for at være en sofistikeret proces selvfornyende stamceller successivt undergår mitose, meiose og differentiering med henblik på at udvikle sig til modne haploide spermatozoer. Disse morfologiske ændringer er orkestreret af forskellige celletyper og trods dybtgående forsøg, er det stadig umuligt at efterligne disse processer i cellekulturer 1,2. Derfor forskning i spermatogenesen indtil nu er afhængig af levende organismer, som in vivo modeller. I almindelighed gen-funktionsundersøgelser normalt baseret på transgene dyr. Men generere og opretholde denne type dyremodel er tidskrævende, omkostningskrævende og ganske omfattende. Dette tilskrives den krævede lange avl proces til frembringelse og opretholdelse af transgenet gennem generationer. Derudover genmanipulation af hele organismen af transgene eller knockout fremgangsmåde er tilbøjelig til at give fysiologiske svækkelser når målretning gener med væsentlige funktioner i flere områder, f.eks uden testiklerne eller systemisk.
Endvidere er visse forbigående transfektionsfremgangsmåder forbundet med nogle vigtige ulemper. For eksempel typiske ulemper ved virus-medieret genoverførsel er de mulige provokation af immunreaktioner og yderligere sikkerhedsbestemmelser, mens lipofektion 3 og mikropartikelbombardement 4 kan beskadige vævet og er begrænset til en bestemt celle dybde tilstrækkelig transfektionseffektivitet.
I modsætning hertil, elektroporation (EP) som en anden almindelig måde transient transfektion, synes at udgøre en lovende teknik til at muliggøre in vivo-transfektion og konsistent in vivo-analyse. I almindelighed EP benævnt et dynamisk fænomen, der afhænger af lokal transmembrane spænding med følgelig medierede porer i nanosekunder. Disse huller kan opretholdes i millisekunder, tilstrækkelig to give adgang til DNA, RNA eller små molekyler 5. Når den anvendte spænding er for høj, er det sædvanligvis forbigående karakter EP modvirkes på grund af varme produktion og induktion af for omfattende permeabilisering med deraf irreversibel ødelæggelse af cellen 5.
Her viser vi, at elektroporering er en effektiv og økonomisk transfektion, som er i stand til at blive udnyttet til genetisk testis transformation for at belyse testikulære gen egenskaber in vivo. Denne artikel omhandler plasmidpræparat, mikroinjektion via efferente kanal og den efterfølgende elektroporering af muse testis. Denne procedure kan være midlet til valg til at opnå hurtig, konkret og effektiv transfektion af sædkanalerne af muse testikler in vivo for at undersøge processer spermatogenesen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle udførte dyreforsøg er blevet godkendt af den lokale etiske komité (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, Mecklenburg-Vorpommern, Tyskland).
1. Plasmid Fremstilling
- Til plasmidpræparat bruge plasmid oprensningskit (se Materialer tabellen) eller lignende metoder med endotoksin fjernelse puffer, således at immunreaktioner af dyret kan undgås. Følg instruktionerne i manualen. Ansæt Hedeselskabet 2 O for at fortynde plasmidet løsning.
- Eliminer vragrester ved spinding DNA-opløsningen ved maksimal hastighed (20.000 xg). Derefter indsamle supernatanten.
- Bestem plasmid koncentration med et spektrofotometer (se materialer).
- Juster plasmid koncentration med Hedeselskabet 2 O til 1-3 ug (DNA) / ul. Bemærk: Lavere koncentrationer vil reducere transfektionseffektivitet, mens højere koncentrationer kan forårsage en for viskøs indsprøjtning løsning. Desuden ertransfektionseffektivitet afhænger af størrelsen af plasmidet og har skal testes individuelt.
- Før injektion fremstilles en opløsning blandes med for eksempel 40 pi plasmid sammen med 5 pi PBS (10x) og 5 pi Fast Green (0,5%). Fast Green er nødvendig til sporing af injektionsprocessen. Fortrinsvis anvender tyndvæggede PCR-rør eller Parafilm. Bemærk: Afhængig af størrelsen af testiklerne, vil der være behov for hver testikel et volumen på 20-50 ul.
2. Fremstilling af Mikroinjektion Pipette
- Brug borsilicat kapillærer (se Materialer tabel) til fremstilling mikroinjektionen pipetter.
- Træk glaskapillarer med et lodret kapillær aftrækker (se Materialer tabel).
- Bryd kapillære spids med en pincet med blødt banding. Spidsen er normalt 50-80 um i diameter og 1 cm lang. Prøv at undgå tips, der er alt for længe disse ikke er stiv nok til at trænge ind i vævet.
- Omsider sharpen spidsen i en 30 ° til 45 ° ved hjælp af en mikropipette beveler (se Materialer tabel).
- Ilæg mikroinjektion pipetten med injektionsopløsningen mix (se plasmidfremstilling). Påfør opløsningen ind i bagsiden af den glaskapillar med en lille sprøjte. Bemærk: Prøv at undgå luftbobler under lastning, der ellers vil blive injiceret i sædkanalerne sammen med plasmidet løsning og dermed vil reducere ledningsevne samt muligvis forårsage vævsskader.
3. Anæstesi og kirurgi
- Udfør handlingen under aseptiske betingelser ved anvendelse af sterilt materiale (dvs. sprøjte, nål, kirurgiske instrumenter, etc.). Dette vil reducere infektion af dyret og sikre gode overlevelsesrater.
- Brug hanmus til elektroporation i en alder af 6-8 uger.
- Sådan initialiseres postsurgical smertestillende behandling, giver musen med analgetika tilføjet drikkevand dagen før operation. Denne røvplerende en forebyggende analgesi i tilfælde af meget sandsynlig postsurgical hypodipsia (formindsket vandindtag). Til dette formål udsættes drikkevand med for eksempel en pædiatrisk ibuprofen suspension (20 mg / ml). Det medicinerede drikkevand skal også leveres på dag ét og to af opsving i samme koncentration. Det betyder, at en daglig dosis på 7,5 mg / kg, gældende for 5 ml / d drikkevand og kropsvægt 25g i 8 uger i alderen C57BL / 6J. Denne smertestillende regime garanterer en fundamental smertelindring og fremskyndet inddrivelse sammen med en høj velfærd 26.
- Til fremstilling af anæstesi brugsopløsning på dagen for kirurgi, bland 10% ketamin og 2% xylazin i forholdet 1: 1 (se Materialer tabel).
- At bedøve dyret, anvendes 0,25 ml / 100 mg legemsvægt bedøvende opløsning subkutant (ketamin = 0,125 g / kg; xylazin = 0,025 g / kg). Brug et injektionssted mellem bækken og lemmer for at undgå skader på organerne og skade af musene. Normalt er 10 min behovindtil musen er dybt bedøvet.
- Dæk musen øjnene med dyrlægen salve for at forhindre tørhed under bedøvelse.
- Test dyb narkose anholdelse, der er mærkbar ved en total mangel på respons. Til dette formål blot klemme tåen af dyret.
- For at starte kirurgi, fjerne abdominal hår med en elektrisk barbermaskine eller lignende og desinficere operationsområdet med sterilium eller lignende.
- Lav en ventral indsnit direkte over præputial kirtler i midten af maveregionen. På det sted, først trække huden væk og gennemføre en mindre tværgående kutan nedskæring på omkring 8-14 mm. Derefter fortsætter langs den abdominale muskuløse lag.
Bemærk: læsion bør være så lille som muligt for at reducere skade på dyret. - Træk op abdominale fedtpuder omhyggeligt for at eksponere den vedlagte testiklerne og placere den på et tidligere forberedt vandtæt papir drapere lige ved siden af incisionssted (figur 2A).
- Brug kikkert til fInd den efferente kanal som målet injektion. Ductus efferente er identificeret som den fine fartøj krydset mellem testiklerne og epididymis. Det er placeret ved siden af den fremtrædende testikel arterie. Ductus kører næsten i en vinkel på 45 ° i forhold til arterien og synligt ind caput epididymidis. Bemærk: Afhængigt af musens alder, er ductus normalt begravet i fedtvæv.
- Brug fine tænger at rydde efferente kanal af denne fedtvæv. Efter at placere udgivet ductus på en steril papirstrimmel at sikre synlighed af kanalen uden at forringe omgivelser.
4. Mikroinjektion og DNA Anvendelse
- Tilslut mikroinjektion pipette, som er fyldt med plasmidet løsning på mikromanipulator / injektor enhed.
- Placer mikroinjektion nålen parallelt med efferente kanal med spidsen pegende mod rete testis (figur 2B).
- Brug fine pincet ogstrimler kanalen over mikroinjektion pipette. Sørg for, at kapillarrøret holdes parallelt med kanalen, mens du trækker det over.
Bemærk: Denne procedure er mere praktisk end at trænge ind i fartøjet ved at flytte nålen med mikromanipulator. - Ret nålen forsigtigt mod testiklerne og stoppe lige som det trænger ind i rete testis direkte under Tunica albuginea (figur 2C).
Bemærk: I tilfælde af pustede den rete testis, vil plasmidet løsning lække ind i det interstitielle rum. Dette fører ofte til manglende transficere sædkanalerne. - Til injektion af plasmid-løsning udnytter mikroinjektor med følgende indstillinger: pi: 100 hPa ti,: 0,2 sek, og PC: 0 hPa (figur 2D).
- Overvåge hele injektion proces ved at observere testiklerne påfyldning status ved hjælp af den grønne farve. Pas på, at testiklerne kun fyldes op til 2/3 af sit volumen med plasmid opløsning (Figur 2E).
Bemærk: Hvis injektionsvolumenet overskrides, kan testiklerne væv blive skadet.
5. Elektroporation af Testikel
- At muliggøre en effektiv elektroporation, sættetid pincetfladerne elektroder i PBS (1x). Dette sikrer en tilstrækkelig ledningsevne.
- Blødt klemme testiklerne mellem de våde elektroder (figur 2F). Mål den elektriske modstand med elektroporator.
- Anvend strøm til testiklerne. Udfør otte firkantede pulser af 40 V ved 4 forskellige testis sites med en konstant varighed på 50 msek puls tid og 950 ms interval tid.
6. Sårlukning og Post-kirurgi
- Når elektroporation er færdig, skal du placere testiklerne tilbage i den oprindelige placering.
- Sy indre muskulære lag med kirurgisk sutur (se materialer).
- Luk huden ved at anvende sutur klip (se Materialer tabel). Træk huden op with pincet. Sørg for at udelukke den muskulære lag. Placer de klip, hver med en afstand på højst 5 mm.
Bemærk: Da kirurgisk sutur kan sluges af musen, er sutur klip foretrukket for at lukke huden læsion. - Lad musen at komme fra anæstesi på sterile papirservietter anbragt i et sterilt tomt musebur, som er hærdet på et 37 ° C varmt pad. Puden bør sikre opvarmning af den ene halvdel af buret skabe en varme-gradient. For dyr dette gør det muligt at søge efter den enkelte mest komfortable område på grund af temperatur variation i buret. Desuden dækker mus med et ark af sterilt papir håndklæde, så at stress kan reduceres yderligere. Bemærk: Da musen kropsoverflade er usædvanlig høj i forhold til kropsmasse, sammenlignet med større dyr, den termiske støtte er af særlig betydning for en vellykket udvinding af gnavere.
- Når det opererede dyr har fuldt vækket, overfører jegt for yderligere opsving til et fuldt udstyret ny mus bur. Du må ikke sætte dyret tilbage til sin gamle bur eller til en gruppe af mus. Sørg for, at buret er så rent og sterilt som muligt for at forebygge sårinfektion. Overvåge hele helbredelsesprocessen. For at overføre musen tilbage til dyret pleje facilitet, skal du vente, indtil det er fuldt tilbagebetalt, og ser ud til at opføre sig normalt.
Bemærk: Yderligere per- og post-kirurgiske strategier drøftes Pritchett-Corning KR m.fl. 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den eksperimentelle indstilling til udførelse mikroinjektion og elektroporation af muse testis in vivo, som det anvendes i overensstemmelse med den protokol er vist i figur 1. Selv om det er muligt at erhverve industrielt fremstillede mikropipetter, foretrak vi at generere vores egne pipetter ved at trække (figur 1A ) og beveling (Figur 1B) glaskapillarer så de monteret vores behov. Udstyret til mikroinjektion og elektroporation er illustreret i figur 1C. Af hensyn til transfektionseffektivitet, er det vigtigt at anvende en firkantbølge elektroporator.
Figur 2 viser de vigtigste trin i mus kirurgi med særlig fokus på forberedelsen af efferente kanalen. I denne sammenhæng testiklerne er udsat for (figur 2A) og efferente kanalen identificeres af kikkert observation og frigivet fra fedtvæv (Figure 2B). Efterfølgende efferente kanal punkteres med en mikroinjektion pipette og plasmidet opløsningen administreres (figur 2C-E). Endelig er indlæst testiklerne klemt mellem to elektroder og transficeret ved anvendte firkantimpulser (figur 2F).
Denne in vivo transfektion fremgangsmåde tillader anvendelse af forskellige plasmider koder for forskellige reportergener. Her anvendte vi reporter vektoren pEGFP-C1 (figur 3A), som udtrykker forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP) samt pDsRed2-N1 (figur 3C) vektor muliggør transaktivering af rødt fluorescerende protein (DsRed2). I vores tilfælde var begge reporter gener under kontrol af den humane cytomegalovirus-immediate-early-promotoren (CMV).
For at vurdere transfektion succes blev mikroinjiceret og elektroporerede testikler høstet 3 dage efter hele proceduren og observeret under Lysstofrørcens mikroskopi (figur 3). For detaljeret undersøgelse testiklerne var formaldehyd-fast, indlejret i paraffin, skåret (5 um) samt modfarvet med Til-Pro-3, hvilket resulterer i blåfarvede kerner. Til sidst blev snittene undersøgt ved fluorescensmikroskopi. Kan ses to eksempler på mulige transfektionsresultater i figur 4. Er udtryk for reportergenet EGFP angivet med grøn fluorescens, er transaktivering af DsRed2 udpeget af rød-emission.
Figur 1. Udstyr til in vivo mikroinjektion og elektroporation af muse testis. Glaskapillarer dannes ved hjælp af mikropipette aftrækker (A), mens spidserne skærpes udnytte mikropipettens beveler (
Figur 2. Illustration af in vivo testiklerne mikroinjektion og elektroporation procedure i mus, herunder forudgående kirurgiske indgreb. Adgang til testiklerne gives via åbningen af musens mave, som er blevet bedøvet før. Snittet er lavet lige over præputial kirtler. Efter at have afsløret testiklerne, det er frigivet fra abdominal fedt pa ds (A). Under binokulære iagttagelse, beregnes den efferente kanal identificeret og fedt-befriet. Mikroinjektionen pipette er placeret ved siden af ductus mens den skarpe ende af nålen peger mod efferente kanal (B). Kapillarrøret indsættes i ductus og bevæges mod testiklerne til at blive anbragt direkte i rete testis (C). Proceduren af DNA anvendelse og fyldning af sædkanalerne overvåges ved hjælp af Fast Green (D). Kun 2/3 af testiklerne bliver fyldt for at forhindre skade på væv (E). For den endelige elektroporation trin testiklerne klemt mellem pincet-type elektroder til at anvende elektriske firkantede pulser (F). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Hele mount testis 3 dage efter in vivo elektroporation under fluorescensmikroskopi transficeret testis C57BL / 6 mus viser ekspression af et forstærket grønt fluorescerende protein -. EGFP (A) og rødt fluorescerende protein - DsRed2 (C) både kodet på pEGFP- C1 og pDsRed2-N1-plasmidet hhv. Ekspressionen af begge reportergener var under kontrol af ubikvitært aktive CMV-promotoren element. Den effektive transfektion af målrettede sædkanalerne påvises ved fluorescens-intensiteter. Paneler (B) og (D) illustrerer autofluorescens af transfekteret kontrol testis. Skala bar = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Dele af muse testikler 3 dage efter ensidig in vivo elektroporation med pEGFP-C1-plasmidet. Transfektion resultatet af fast mus testis sektioner (5 um) er vist 3 dage efter ensidig elektroporation med pEGFP-C1-plasmidet. Succesfuld transficeret testikel tubulær cellsare angivet med grøn fluorescens. TO-PRO-3 modfarvet kerner er påviselige ved blå emission (A og B). De runde strukturer er typisk for organiseringen af celler i sædkanalerne. Skala bar = 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forskning inden for reproduktiv biologi, især på området for mandlig fertilitet og spermatogenesen uundgåeligt afhængig levende organismer. For at undersøge testikelfunktionen, er blevet etableret nogen passende cellekultur / in vitro-system, der kan afspejle alle de vigtige morfologiske ændringer fra en diploid spermatogonium til en haploide moden sædcelle 1,2. Således generation af genmodificerede dyr er ofte en nødvendig og som sådan et værdifuldt værktøj i mandlige reproduktive biologi. Til dette formål, en lang række transgene knock-out og knock-i mus er blevet oprettet som leverede indsigt i mandlig fertilitet. Ikke desto mindre er frembringelsen af transgene mus gøres normalt ved at injicere genkonstruktioner i pronucleus af befrugtede æg. Men denne teknik er tidskrævende og formodes at ske ved specialiserede laboratorier. Proceduren til at generere knock-out eller knock-dyrer endnu mere sofistikeret.
En anden måde at studere genfunktion af levende modelorganismer er ved transient transfektion. Den fælles transduktion med virale vektorer, kan dog forårsage immunogene eller andre uspecifikke reaktioner og kræver særlige sikkerhedsregler. Lipofektion 3 og mikropartikelbombardement 4 tilgange desværre fastholdes til en specifik celle dybde og selv kan udløse skadelige virkninger på væv.
, Ved hjælp af direkte anvendte elektriske firkantede impulser på målvævet, såkaldt elektroporering, desto mindre er det faktisk muligt at transficere levende væv, f.eks heri mus testis. Desuden giver denne metode kræver kun lave omkostninger, lav udstyr og korrekt kvalificeret laboratorium personlige.
En yderligere bemærkelsesværdig fordel forbundet med in vivo transfektionsfremgangsmåder i forhold til vedvarende gen-ændret dyr tilstandls er muligheden for co-transfektion. Mens transgene eller knock-mus normalt bære kun én genkonstruktion, in vivo-transfektion muliggør omfattende, samtidige analyser af forskellige genkonstruktioner i samme celle. Dette kan gøres ved anvendelse af forskellige reportergener, f.eks GFP versus YFP eller Gaussia- mod Renilla-luciferase, således at en sammenlignende undersøgelse af vildtype og mutant geneffekter er mulig.
Endvidere, ved anvendelse af celletypespecifikke promotorer, ekspressionen af genkonstruktioner kan udsøgt rettes mod specifikke celler i testiklerne. For eksempel, kan dette give en testikel genekspression lige i Sertoliceller eller spermatocytter.
Protokollen præsenteres i denne artikel dækker to vigtige metoder inden for mandlige reproduktive biologi. Den første er mikroinjektion i sædkanalerne med udarbejdelsen af injektionen kapillarrøret. Denne technique har været almindeligt impliceret i kim / stamcelletransplantation enten fra transgene dyr til modtageren 7 eller i forbindelse med xenografting 8. Den anden metode er elektroporering transfektion stand til at inducere forbigående porer i plasmamembranen samt en rettet massestrømning af ladede molekyler som plasmider sikre indgang i visse celler eller snarere væv. Denne specifikke retning af makromolekyler ved elektroporering ofte værdsat i ensidigt neurale celletransfektion ofte i livmoderen 9,10 eller i udviklingen af nethinde 11.
Den foregående detaljerede metodeprotokollen indeholder som det første afgørende skridt anæstesi af hanmus, redegørelsen af testiklerne via abdominal læsion, forberedelse af efferente kanalen samt mikroinjektion i ductus. Da disse aktioner er ganske krævende, er det stærkt anbefales at første praksis på døde dyr, før du udfører orift på levende mus. Desuden er vejledninger, der gives på, hvordan man kan injicere og fylde sædkanalerne med plasmid-DNA og hvordan man fører den elektroporation af testiklerne korrekt.
På grund af anvendelsen af elektricitet i EP kan varmeproduktion udløse vævsskade især ved høj spænding. Denne stigning i transfektionseffektiviteten 12, 13, 15 ved forhøjet spænding er ledsaget af den negative virkning af testikel skrumpende 12-14. Den mest gunstige spændingsområde synes at være mellem 30-50 V garantere små virkninger på testikel integritet, en normal sædkvalitet 16, en normal parringsadfærd 17, opretholdelse af afkom produktion evne 16-20 samt en tilstrækkelig transfektion effektivitet.
Med hensyn til genekspression intensitet af overførte genkonstruktioner, Yomogida et al. 21 har også afsløret en markant reduceret expression lineariseret vektorer 3 dage efter EP-implementering hvorimod cirkulært plasmid-DNA naturligvis stadig opretholder udtryk efter 35 dage med det højeste i Sertoliceller. Dette antyder, at de bedste resultater opnås ved anvendelse af plasmidkonstruktioner til elektroporation som gjort her. I vores fremgangsmåde, undersøgte vi transfektionseffektivitet 3 dage efter elektroporering grund af den observation, at denne periode er tilstrækkelig til en passende sårheling, erstatning for celleintegritet samt den ønskede korrekt ekspression af reporter-proteiner eGFP og DsRed2. Således er en inkubationstid på 3 dage efter det kirurgiske indgreb og hele transfektionsprocedure synes at være nødvendige for at sikre passende restaureret cellefunktioner, herunder genekspression, således at et fluorescens-signal, som intensivt som muligt kan påvises at sikre en pålidelig transfektion resultat. Vedrørende transfektionseffektivitet har Yomogida et al. 21 viste, at the somatiske Sertoliceller er tilsyneladende mere lydhøre over for EP-transfektion end kønsceller. Vi anbefaler co-transfektion af testis med target og kontrol plasmider, som hver koder for et andet reportergen.
Den præsenterede elektroporation tilgang er anvendelig for et bredt spektrum af mulige problemer, der henviser til mandlige kønsceller og fertilitet processer. For eksempel kan det anvendes til at analysere regulatoriske elementer af spermatogenese-specifikke gener 17,22. Metoden er også velegnet til tab af funktion studier med små interfererende RNA 23 og vinde af funktion undersøgelser 24. Derudover er der lovende muligheder for at selv udføre EP til terapeutisk behandling og generering af transgene afkom som forskergrupper allerede har vist 18,20,25.
Derfor er illustreret roman metodiske fremgangsmåde muse testis in vivo elektroporation sammenholdt med efferente kanal microinjection af plasmidkonstruktioner vil forhåbentlig stige til en værdifuld teknik til succes optrevling natur spermatogenesen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Marten Michaelis, Alexander Sobczak, og Joachim M. Weitzel ansat på Institut for Forplantningsbiologi, Leibniz Institute for Farm Animal Biologi (FBN), Dummerstorf, Tyskland, erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Birgit Westernstroeer af Center for Reproductive Medicine og Andrologi ved universitetet i Muenster til undervisning testikel mikroinjektion. Desuden er vi taknemmelige for Ursula Antkewitz og Petra Reckling til teknisk bistand. Vi takker den tyske Research Foundation (DFG) til at støtte dette arbejde (WE2458 / 10-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Sigma | 1-15 PK | |
| Spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| Micropipette puller | Narishige | PC-10 | vertical capillary puller |
| Microinjection capillaries | Clark | GC100-10 | borosilicate standard wall |
| Micropipette beveler | Bachofer | Typ 462 | rotating disk beveler |
| Electroporator | Nepagene | CUY 21EDIT | square wave electroporator |
| Tweezer electrodes | Nepagene | CUY 650P5 | 5 mm Ø disk electrodes |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Cold light source | Zeiss | KL 1500LCD | |
| Microinjection pump | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | homemade | XYZ cross table | |
| Surgical instruments | FST | scissors, forceps, needle holder | |
| Fine forceps | FST | Dumont #5, #7 | efferent ducts preparation |
| Michel clip applying stapler | FST | Michel, 12029-12 | |
| Michel suture clips | FST | Michel, 12040-01 | 7.5 x 1.75 mm |
| Surgical suture | Catgut, Markneukirchen, Germany | Catgut 00 | |
| Syringe with 30 G needle | B. Braun | Omnican 40 | to load micropipette and for anesthesia |
| Plasmid isolation kit | Promega | Cat. # A2495 | plasmid Midiprep |
| Plasmid pEGFP-C1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-promoter + EGFP |
| Plasmid pDsRed2-N1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-promoter + DsRed2 |
| Fast Green dye | Sigma | F7258-25G | for dilution in ddH2O |
| 10% Ketamine | Serum Werk, Bernburg, Germany | Urotamin | mix in a rate 1:1 with xylazine |
| 2% Xylazine | Serum Werk, Bernburg, Germany | Xylazin | mix in a rate 1:1 with ketamine |
| Sterilium | Bode Chemie | Sterillium | disinfection |
| Vet ointment | S&K Pharma, GmbH | Kerato Biciron 5%, Augensalbe | opthalmic ointment to prevent eye dryness |
| To-Pro-3 iodide | Invitrogen | T3605 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | |||
| 1.37 M NaCl | Carl Roth | 3957.1 | |
| Ibuprofen, Dolormin | Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany | 01094902 | analgesic pediatric solution (NSAID) for postsurgery pain relief |
| 27 mM KCl | Carl Roth | 6781.1 | |
| 100 mM Na2HPO4·2H2O | Carl Roth | T106.2 | |
| 18 mM KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
References
- Reuter, K., Schlatt, S., Ehmcke, J., Wistuba, J. Fact or fiction: In vitro spermatogenesis. Spermatogenesis. 2, 245-252 (2012).
- Hunter, D., Anand-Ivell, R., Danner, S., Ivell, R.
- Zizzi, A., et al. fluorescent protein as indicator of nonviral transient transfection efficiency in endometrial and testicular biopsies. Microsc. Res. Tech. 73, 229-233 (2010).
- Williams, R. S., et al. Introduction of foreign genes into tissues of living mice by DNA-coated microprojectiles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2726-2730 (1991).
- Bockmann, R. A., de Groot, B. L., Kakorin, S., Neumann, E., Grubmuller, H., Kinetics, statistics, and energetics of lipid membrane electroporation studied by molecular dynamics simulations. Biophys. J. 95, 1837-1850 (2008).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Brinster, R. L., Avarbock, M. R. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11303-11307 (1994).
- Schlatt, S., Von, S. V., Schepers, A. G. Male germ cell transplantation: an experimental approach with a clinical perspective. Br. Med. Bull. 56, 824-836 (2000).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), (2007).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), (2011).
- Blackshaw, S. In vivo electroporation of developing mouse retina. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Yomogida, K., Yagura, Y., Nishimune, Y. Electroporated transgene-rescued spermatogenesis in infertile mutant mice with a sertoli cell defect. Biol. Reprod. 67, 712-717 (2002).
- Ryoki, S., Park, H., Ohmori, Y., Shoji-Tanaka, A., Muramatsu, T. An integrase facilitates long-lasting foreign gene expression in vivo in mouse spermatogenic cells. J. Biosci. Bioeng. 91, 363-367 (2001).
- Umemoto, Y., et al. Gene transfer to mouse testes by electroporation and its influence on spermatogenesis. J. Androl. 26, 264-271 (2005).
- Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 45-49 (1997).
- Hibbitt, O., et al. In vivo gene transfer by electroporation allows expression of a fluorescent transgene in hamster testis and epididymal sperm and has no adverse effects upon testicular integrity or sperm quality. Biol. Reprod. 74, 95-101 (2006).
- Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a. J. Exp. Zool. 286, 212-218 (2000).
- Dhup, S., Majumdar, S. S. Transgenesis via permanent integration of genes in repopulating spermatogonial cells in vivo. Nat. Methods. 5, 601-603 (2008).
- Huang, Z., et al. In vivo transfection of testicular germ cells and transgenesis by using the mitochondrially localized jellyfish fluorescent protein gene. FEBS Lett. 487, 248-251 (2000).
- Majumdar, S. S., et al. A method for rapid generation of transgenic animals to evaluate testis genes during sexual maturation. J. Reprod. Immunol. 83, 36-39 (2009).
- Yomogida, K., Yagura, Y., Tadokoro, Y., Nishimune, Y. Dramatic expansion of germinal stem cells by ectopically expressed human glial cell line-derived neurotrophic factor in mouse Sertoli cells. Biol. Reprod. 69, 1303-1307 (2003).
- Ike, A., et al. Transient expression analysis of the mouse ornithine decarboxylase antizyme haploid-specific promoter using in vivo electroporation. FEBS Lett. 559, 159-164 (2004).
- Gonzalez-Gonzalez, E., Lopez-Casas, P. P., Del, M. J. Gene silencing by RNAi in mouse Sertoli cells. Reprod. Biol. Endocrinol. 6, 29 (2008).
- Tang, H., Kung, A., Goldberg, E. Regulation of murine lactate dehydrogenase C (Ldhc) gene expression. Biol. Reprod. 78, 455-461 (2008).
- Yomgogida, K. Mammalian testis: a target of in vivo electroporation. Dev. Growth Differ. 50, 513-515 (2008).
- Hayes, K. E., et al. An Evaluation of Analgesic Regimens for Abdominal Surgery in Mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 6, 18-23 (2000).
