Summary
I denna artikel beskrivs mikroinjektion och elektroporering av mus testiklar in vivo som en transfektion teknik för testikel musceller att studera unika processer av spermatogenesen. Den presenterade protokollet involverar stegen att preparatet glaskapillär, mikroinjektion via efferenta kanalen, och transfektering genom elektroporation.
Abstract
Denna video och artikeln bidraget ger en heltäckande beskrivning av mikroinjektion och elektroporering av mus testiklar in vivo. Denna särskilda transfektion teknik för testikel musceller tillåter studiet av unika processer i spermatogenesen.
Följande protokoll är inriktat på transfektion av testikulära musceller med plasmidkonstruktioner. Specifikt använde vi reportern vektor pEGFP-C1, som uttrycker förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) och även pDsRed2-N1 vektor som uttrycker röd fluorescerande protein (DsRed2). Båda kodade reportergener var under kontroll av den humana cytomegalovirus omedelbara-tidiga promotorn (CMV).
För att utföra genöverföring till mus testiklar, är reporter plasmidkonstruktioner injiceras i testiklarna hos levande möss. För detta ändamål är testiklarna på en nedsövd djur exponerad och platsen för mikroinjektion är beredd. Vår bästa ställe förinjektion är den efferenta kanal med slutligen kopplas rete testis som den anatomiska transportväg av spermier mellan testiklarna och bitestiklarna. På detta sätt är fyllningen av sädeskanalerna efter mikroinjektion utmärkt förvaltas och kontrolleras på grund av användningen av färgade DNA-lösningar. Efter att ha observerat en tillräcklig fyllning av testiklarna av dess färgade tubuli struktur, är orgeln electroporated. Detta möjliggör överföring av DNA-lösningen in i de testikulära celler. Efter 3 dagars inkubation, är testiklarna bort och undersöks i mikroskop för grön eller röd fluorescens, illustrerar transfektion framgång.
I allmänhet kan detta protokoll användas för att leverera DNA- eller RNA- konstruktioner i levande mus testiklar för att (över) uttryckliga eller riva gener, underlättar in vivo geners funktion analys. Dessutom är den lämplig för att studera reporterkonstruktioner eller förmodade gen regulatory element. Således de främsta fördelarna med elektrotekniken är snabb prestanda i kombination med låg ansträngning samt den moderata teknisk utrustning och kompetens som krävs i förhållande till alternativa tekniker.
Introduction
Däggdjur spermatogenes anses vara en sofistikerad process för självförnyande stamceller successivt genomgår mitos, meios och differentiering för att utvecklas till mogna haploid spermier. Dessa morfologiska förändringar iscensatt av olika celltyper och trots djupa försök, är det fortfarande omöjligt att efterlikna dessa processer i cellkultur 1,2. Därför forskning om spermatogenesen hittills bygger på levande organismer som in vivo-modeller. I allmänhet är genen funktionsstudier vanligtvis baserat på transgena djur. Emellertid alstra och upprätthålla denna typ av djurmodell är tidskrävande och kostnadsintensiv och helt genomarbetade. Detta tillskrivs det krävs långa avel att skapa och upprätthålla transgenen över generationerna. Dessutom är genmanipulation av hela organismen av den transgena eller knockout strategi benägna att orsaka fysiologiska nedsättningar när de riktar genes med viktiga funktioner i flera regioner, t.ex. utanför testiklarna eller systemiskt.
Vidare är vissa övergående transfektionsmetoder förknippade med några avgörande nackdelar. Till exempel typiska nackdelarna med virusmedierad genöverföring är det möjligt provokation av immunreaktioner och kompletterande säkerhetsföreskrifter, medan lipofektion 3 och mikropartikelbombardemang 4 kan skada vävnad och är begränsade till en viss celldjup för tillräcklig transfektionseffektivitet.
I kontrast, elektroporering (EP) som ett annat vanligt sätt att transient transfektion, tycks utgöra en lovande teknik för att möjliggöra in vivo-transfektion och konsekvent in vivo gen-analys. I allmänhet är EP hänvisas till som en dynamisk fenomen som beror på lokal transmembranspänning med följaktligen medierade porerna inom nanosekunder. Dessa luckor kan bibehållas under millisekunder, tillräcklig to ge tillgång till DNA, RNA eller små molekyler 5. När den pålagda spänningen är för hög, är vanligen övergående karaktär EP motverkas på grund av värmeproduktionen och induktion av alltför omfattande permeabilisering med åtföljande irreversibel skada på cellen 5.
Här visar vi att elektroporation är ett effektivt och ekonomiskt transfektion system som är i stånd att utnyttjas för genetisk testis omvandling i syfte att belysa testikulära genprodukter egenskaper in vivo. Denna artikel tar upp beredning plasmid, mikroinjektion via efferenta kanalen och den efterföljande elektroporering av mus testiklar. Detta förfarande kan vara medlet för valet att uppnå snabb, specifik och effektiv transfektion av sädeskanalerna av mus testiklar in vivo för att undersöka processer av spermatogenesen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla utförda djurförsök har godkänts av den lokala etiska kommittén (Lande für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, Mecklenburg-Vorpommern, Tyskland).
1. Plasmidberedning
- För plasmidberedning, använd plasmidrening kit (se Material tabell) eller liknande metoder med endotoxin borttagning buffert så att immunreaktioner av djuret kan undvikas. Följ anvisningarna i handboken. Anställ DDH 2 O att späda plasmiden lösning.
- Eliminera skräp genom att snurra på DNA-lösningen med maximal hastighet (20.000 xg). Sedan samlar supernatanten.
- Bestäm plasmid koncentration med en spektrofotometer (se material).
- Justera plasmid koncentration med DDH 2 O till 1-3 mikrogram (DNA) / ul. Obs: Lägre koncentrationer minskar transfektionseffektiviteten, medan högre halter kan orsaka en alltför viskös injektionslösning. Dessutom dentransfektionseffektiviteten beror på storleken på plasmiden och har testas individuellt.
- Före injektion, bereda en lösning mix med exempelvis 40 pl plasmid tillsammans med 5 l PBS (10x) och 5 l Snabb Grön (0,5%). Snabb Grönt behövs för att spåra insprutningsprocessen. Lämpligen använder tunnväggiga PCR-rör eller Parafilm. Obs: Beroende på storleken på testiklarna, en volym på 20-50 l kommer att behövas för varje testikel.
2 Beredning av mikroinjektion pipett
- Använd borosilikat kapillärer (se Material tabell) för framställning av mikroinjektion pipetter.
- Dra glaskapillärer med vertikalt kapillär avdragare (se Material tabell).
- Bryt kapillär spets med pincett med mjukt banding. Spetsen är vanligen 50-80 nm i diameter och ca 1 cm lång. Försök att undvika tips som är för långa eftersom dessa inte är tillräckligt styvt för att tränga in i vävnaden.
- Äntligen, sharpen spetsen i en 30 ° till 45 ° vinkel genom att använda en mikropipett beveler (se Material tabell).
- Ladda mikroinjektion pipett med injektionslösningen mix (se Plasmidberedning). Applicera lösningen in på baksidan av glaset kapillär med en liten spruta. Anm: Försök att undvika luftbubblor under lastning, annars kommer dessa att injiceras i sädeskanalerna tillsammans med plasmiden lösningen och därmed kommer att minska ledningsförmåga samt möjligen orsaka vävnadsskador.
3 Anestesi och kirurgi
- Utför åtgärden under aseptiska förhållanden med hjälp av sterilt material (dvs, spruta, nål, kirurgiska instrument, etc.). Detta kommer att minska infektion av djuret och säkerställa goda överlevnadsgrad.
- Använd hanmöss för elektroporering vid en ålder av 6-8 veckor.
- För att initiera postsurgical smärtstillande behandling, ge musen med analgetika lagt dricksvatten dagen före operation. Detta assder ett förebyggande smärtlindring vid mycket sannolik postsurgical hypodipsia (minskat intag vatten). För detta ändamål utsätta dricksvatten med exempelvis en pediatrisk ibuprofen suspension (20 mg / ml). Det medicinerade dricksvattnet bör även levereras på dag ett och två av återhämtning i samma koncentration. Detta innebär en daglig dos på 7,5 mg / kg, gäller i 5 ml / d dricksvatten och kroppsvikt 25g i 8 veckor i åldrarna C57BL / 6J. Denna smärtlindringen garanterar en grundläggande smärtlindring och snabbare återhämtning tillsammans med hög välfärd 26.
- För framställning av anestesi arbetslösning på dagen för kirurgi, blanda 10% Ketamin och 2% Xylazin i en 1: 1-förhållande (se Material tabell).
- För att söva djuret, applicera 0,25 ml / 100 mg kroppsvikt av anestetisk lösning subkutant (Ketamin = 0,125 g / kg; Xylazin = 0,025 g / kg). Använd ett injektionsställe mellan bäckenet och lem för att förhindra organskada och skada på mössen. Vanligtvis krävs 10 mintills musen är djupt sövd.
- Täck musen ögonen med veterinär salva för att förhindra torrhet under anestesi.
- Testa djupt narkosstillestånd, vilket märks genom att en total brist på respons. För detta ändamål bara nypa tån på djuret.
- För att starta operationen, ta bort buken hår med en elektrisk rakapparat eller liknande och desinficera operationsområdet med sterilium eller liknande.
- Gör en ventral incision direkt ovanför preputiala körtlar i mitten av buken. På den platsen, först dra huden bort och göra en liten tvärgående kutan snitt på ca 8-14 mm. Fortsätt sedan längs buken muskelskiktet.
Obs: lesion bör vara så liten som möjligt för att reducera skada till djuret. - Dra upp buken fettkuddarna noga för att avslöja den bifogade testiklar och placera den på en tidigare förberedd vattentät engångspappers drapera precis bredvid snittet webbplatsen (Figur 2A).
- Använd kikaren till find den efferenta kanalen som injektionsmålet. Ductus efferent identifieras som den fina fartyget korsningen mellan testiklarna och bitestiklarna. Den ligger i anslutning till den framstående testikelartären. Ductus löper nästan vid en vinkel av 45 ° till artären och synligt inträder i caput epididymidis. Obs: Beroende på musens ålder, ductus oftast begravd i fettvävnad.
- Använd fin pincett för att rensa efferenta kanalen för denna fettvävnad. Efter det, placera släppt ductus på en steril pappersremsa för att säkerställa god sikt över kanalen utan att försämra omgivningen.
4 mikroinjektion och DNA Application
- Anslut mikroinjektion pipett som är laddad med plasmiden lösning på mikromanipulator / insprutningsenheten.
- Placera mikroinjektion nålen parallell med den efferenta kanalen med spetsen pekande mot rete testis (Figur 2B).
- Använd fin pincett ochstrippa kanalen över mikroinjektion pipett. Se till att kapillär hålls parallellt med kanalen samtidigt som du drar den över.
OBS: Denna procedur är mer praktiskt än att tränga in i fartyget av nålen flyttar med mikromanipulator. - Rikta nålen försiktigt mot testiklarna och sluta precis som det penetrerar rete testis direkt under tunica albuginea (figur 2C).
Anmärkning: I fallet med överansträngning av rete testis, kommer plasmiden lösningen läcka in i det interstitiella rummet. Detta leder ofta till fel på transfektering sädeskanalerna. - För injektion av plasmiden lösningen utnyttja microinjector med följande inställningar: pi: 100 hPa, ti: 0,2 sek, och pc: 0 hPa (figur 2D).
- Övervaka hela injektionsprocessen genom att observera testiklarna fyller status med hjälp av den gröna färgen. Se till att testiklarna bara är fylld till 2/3 av sin volym med plasmid lösning (Figur 2E).
OBS: Om injektionsvolymen överskrids, kan testiklarna vävnaden skadas.
5. Elektroporation av Testikel
- För att möjliggöra en effektiv elektroporering, blöta pincett elektroder i PBS (1x). Detta säkerställer adekvat konduktans.
- Smidigt pressa testiklarna mellan de våta elektroder (Figur 2F). Mät elektriska motståndet med elektroporator.
- Applicera ström till testikeln. Utför åtta kvadrat pulser av 40 V vid 4 olika testikel webbplatser med en konstant varaktighet 50 ms pulstiden och 950 ms intervalltiden.
6. sårtillslutning och Post-kirurgi
- När elektroporering är klart lägger testiklarna tillbaka på den ursprungliga platsen.
- Sy det inre muskellagret med kirurgiska sutur (se material).
- Stäng huden genom användning suturklämmor (se Material tabell). Dra huden upp with pincett. Se till att utesluta muskelskiktet. Placera klippen, var och på ett avstånd av högst 5 mm.
OBS: Eftersom kirurgiska sutur kan sväljas av musen är suturklämmor gynnade för att stänga hudförändringar. - Låt musen för att återhämta sig från anestesi på sterila pappershanddukar som placeras i en steril tom mus bur, som är härdat på ett 37 ° C varmt pad. Dynan bör säkerställa uppvärmningen av en halv av buren skapa en värme-gradient. För djuret detta gör det möjligt att söka efter det individuella, bekvämaste område på grund av den temperatur variation i buren. Dessutom täcker musen med ett ark av steril pappershandduk så att stress kan minskas ytterligare. Anmärkning: Eftersom musens kroppsytan är ovanligt höga i förhållande till kroppsmassan, jämfört med större djur, är av särskild betydelse för framgångsrik återhämtning av gnagare den termiska stöd.
- När drivs djuret har helt vaknat, överför migt för vidare återvinning till ett fullt utrustat ny mus bur. Lägg inte djuret tillbaka till sin gamla bur eller till en grupp möss. Se till att buren är så ren och steril som möjligt för att förhindra sårinfektion. Övervaka hela återhämtningsprocessen. För att överföra musen tillbaka till djuret vård anläggning, vänta tills den har återhämtat sig helt och verkar bete sig normalt.
Obs: Ytterligare person och efter kirurgiska strategier diskuteras av Pritchett-Corning KR m.fl. 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den experimentella inställning för att utföra mikroinjektion och elektroporering av mus testiklar in vivo eftersom den används i enlighet med protokollet illustreras i figur 1. Även om det är möjligt att få industriellt tillverkade mikropipetter, vi föredrog att skapa våra egna pipetter genom att dra (Figur 1A ) och avfasning (Figur 1B) glaskapillärer så att de försett våra behov. Utrustning för mikroinjektion och elektroporering illustreras i figur 1C. Av skäl transfektionseffektivitet, är det av betydelse att utnyttja en fyrkantvåg elektroporator.
Figur 2 visar de viktigaste stegen i musen kirurgi med särskilt fokus på att förbereda den efferenta kanalen. I detta sammanhang testiklarna utsätts (Figur 2A) och efferenta kanalen identifieras med kikare observation och frigörs från fettvävnad (Figure 2B). Därefter efferenta kanalpunkteras med en mikroinjektion pipett och plasmiden lösning administreras (figurerna 2C-E). Slutligen laddade testiklarna pressas mellan två elektroder och transfekterades med tillämpade fyrkantsvågskoder pulser (Figur 2F).
Detta in vivo-transfektion tillvägagångssätt tillåter användning av olika plasmider som kodar för olika reportergener. Här har vi använt den reportervektor pEGFP-C1 (figur 3A), som uttrycker förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) och även den pDsRed2-N1 (figur 3C) vektor som möjliggör transaktivering av rött fluorescerande protein (DsRed2). I vårt fall, båda reportergener under kontroll av den humana cytomegalovirus omedelbara-tidiga promotorn (CMV).
För att utvärdera transfektion framgång har man mikroinjicerade och elektroporerade testiklar skördas 3 dagar efter det att hela proceduren och observerades under fluoresscensmikroskop (Figur 3). För detaljerad utredning, testiklar var formaldehyd-fasta, inbäddade i paraffin, skivade (5 pm) och motfärgades med To-Pro-3, vilket resulterar i blåfärgade kärnor. Så småningom var sektionerna undersöktes genom fluorescensmikroskopi. Två exempel på möjliga transfektion resultat kan ses i figur 4. Har Uttrycket av rapportörgenen EGFP indikeras med grön fluorescens, är trans av DsRed2 utsetts av röd utsläpp.
Figur 1 Utrustning för in vivo mikroinjektion och elektroporering av mus testiklar. Glas kapillärer bildas med hjälp mikropipett avdragare (A), medan spetsarna skärps utnyttja mikropipett beveler (
Figur 2 Illustration av in vivo testikel mikroinjektion och elektroporering förfarandet mus inklusive tidigare kirurgiska ingrepp. Tillgång till testikeln beviljas via öppning av musens buk som har sövd tidigare. Snittet görs precis ovanför förhuden körtlar. Efter avslöja testiklarna, det är utsläppt från bukfett pa ds (A). Under kikare observation, är den efferenta kanalen identifieras och fett-befriade. Den mikroinjektion pipett är placerad bredvid ductus medan den vassa änden av nålen pekar mot den efferenta kanalen (B). Den glaskapillär införes i ductus och förflyttas mot testikeln att placeras direkt inom rete testis (C). Förfarandet av DNA ansökan och fyllning av sädeskanalerna övervakas med hjälp av Snabb Grön (D). Endast 2/3 av testiklarna blir fylld i syfte att förhindra skada av vävnaden (E). För slutelektrosteget testiklarna pressas mellan pincett-elektroder att tillämpa elektriska fyrkantspulser (F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 Whole mount testis 3 dagar efter in vivo-elektroporering Enligt fluorescensmikroskopi, transfekterad testikeln hos C57BL / 6 mus show expression av förstärkt grönfluorescerande protein -. EGFP (A) och rött fluorescerande protein - DsRed2 (C) både kodad på pEGFP- C1 och pDsRed2-N1 plasmid, respektive. Expressionen av båda reportergener var under kontroll av den ubiquitously aktiv CMV-promotor elementet. Den effektiva transfektion av de riktade sädeskanalerna demonstreras av fluorescensintensiteter. Paneler (B) och (D) illustrerar automatisk fluorescens otransfekterad kontroll testiklar. Skala bar = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 Delar av mus testis 3 dagar efter unilateral in vivo elektroporering med pEGFP-C1-plasmiden. Transfektion resultatet av fasta mus testiklar sektioner (5 nm) visas 3 dagar efter unilateral elektroporering med pEGFP-C1-plasmiden. Framgångsrikt transfekterade tubulär testikel cellsare indikeras med grön fluorescens. TO-PRO-3 motfärgade kärnor är detekterbar med blå utsläpp (A och B). De runda strukturer är typiska för att organisera celler inom sädeskanalerna. Skala bar = 20 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forskning inom området för reproduktionsbiologi, särskilt inom området av manlig fertilitet och spermatogenes oundvikligen beroende av levande organismer. För att undersöka testikelfunktionen har ingen lämplig cellodling / in vitro-system etablerats kunna reflektera alla viktiga morfologiska förändringar från en diploid spermatogonium till en haploid mogen spermie 1,2. Således är ofta en nödvändig och som sådan ett värdefullt verktyg i manliga reproduktionsbiologi generering av genetiskt modifierade djur. Därför ett stort antal transgena, knock-out och knock-i möss har skapats, som levererade insikter i manlig fertilitet. Ändå är generering av transgena möss som vanligtvis görs genom att injicera genkonstruktioner in i pronukleus av befruktade ägg. Dock är denna teknik tidskrävande och är tänkt att göras av specialiserade laboratorier. Förfarandet för att generera knock-out eller knock-in djurär ännu mer sofistikerade.
Ett annat sätt att studera geners funktion av levande modellorganismer är genom transient transfektion. Emellertid kan den gemensamma transduktion med virala vektorer orsaka immunogena eller andra ospecifika reaktioner och kräver speciella säkerhetsföreskrifter. Lipofektion 3 och mikropartikelbombardemang fyra metoder tyvärr spända till en specifik cell djup och med kan utlösa negativa effekter på vävnaden.
Men genom hjälp av direkt tillämpade elektriska fyrkantiga pulser på målvävnaden, så kallad elektroporering, det är faktiskt möjligt att transfektera levande vävnad, till exempel, här musen testikel. Dessutom har denna metod kräver endast låga kostnader, låg utrustning och rätt utbildad lab personliga.
Ytterligare en anmärkningsvärd fördel i samband med in vivo transfektionsmetoder i jämförelse med ihärdigt gen-förändrad djurlägels är möjligheten att sam-transfektion. Även transgena eller knock möss bär oftast bara en gen konstruktion, in vivo transfektion möjliggör omfattande samtidiga analyser av olika genkonstruktioner inom samma cell. Detta kan göras med hjälp av olika reportergener, t.ex. kontra YFP eller Gaussia- kontra Renilla-luciferas, så att en jämförande undersökning av vildtyp och mutant gen effekter är GFP möjligt.
Vidare, genom tillämpning av celltypen specifika promotorer, uttryck av genkonstruktioner kan utsökt riktas mot specifika celler i testis. Till exempel kan göra att en testikel genuttryck precis i Sertolicellerna eller spermatocyter.
Protokollet presenteras i denna artikel omfattar två viktiga metoder inom området för manliga reproduktionsbiologi. Den första är mikroinjektion i sädeskanalerna med beredningen av injektions kapillär. Detta technique har ofta inblandad i groddar / stamcellstransplantation antingen från transgena djur till mottagaren 7 eller i samband med Xenografting 8. Den andra metoden är den elektroporering transfektion med förmåga att inducera övergående porer i plasmamembranet såväl som en riktad bulkflöde av laddade molekyler som plasmider, säkerställa inträde i vissa celler eller snarare vävnader. Denna specifika inriktning av makromolekyler genom elektroporering ofta uppskattat i ensidigt neural celltransfektion ofta i livmodern 9,10 eller i utvecklingen av näthinnan 11.
Den föregående detaljerade metoden Protokollet innehåller som de första avgörande stegen anestesi av hanmöss, utläggningen av testiklarna via buken skada, beredningen av den efferenta kanalen samt mikroinjektion i ductus. Eftersom dessa åtgärder är ganska krävande, det är starkt att första praktiken på döda djur innan du utför operations på levande möss. Dessutom finns det instruktioner som om hur man injicerar och fyll sädeskanalerna med plasmid-DNA och hur man genomför den elektroporering av testiklarna på lämpligt sätt.
På grund av tillämpningen av elektricitet under EP, kanske värmeproduktion utlösa vävnadsskador särskilt vid hög spänning. Denna ökning av transfektionseffektivitet 12, 13, 15 med förhöjd spänning åtföljs av de negativa effekterna av testikel krymper 12-14. Den mest gynnsamma spänningsområdet verkar vara mellan 30-50 V, garanterar små effekter på testikel integritet, en normal spermiekvaliteten 16, en normal parningsbeteende 17, upprätthållande avkommor produktionsförmåga 16-20 samt en tillräcklig transfektion effektivitet.
Beträffande genuttryck intensitet överförda genkonstrukt, Yomogida et al. 21 har också visat en markant minskad expression av linjäriserade vektorer 3 dagar efter EP genomförandet medan cirkulär plasmid-DNA uppenbarligen fortfarande upprätt uttryck efter 35 dagar med det högsta i Sertolicellerna. Detta tyder på att de bästa resultaten uppnås vid användning plasmidkonstruktioner för elektroporering som gjort här. I vår strategi, undersökte vi transfektionseffektivitet 3 dagar efter elektroporering grund av observationen att denna tidsperiod är tillräcklig för sårläkning inträtt, reparation av cell integritet samt den önskade rätta uttrycket av reporterproteiner EGFP och DsRed2. Således verkar en inkubationstid på tre dagar efter det kirurgiska ingrepp och hela transfektionsförfarandet vara nödvändig för att garantera lämpligt restaurerade cellfunktioner inklusive genuttryck så att en fluorescenssignal så intensivt som möjligt kan upptäckas säkerställa en tillförlitlig transfektion resultat. Beträffande transfektionseffektivitet har Yomogida et al. 21 visade att the somatiska Sertolicellerna är tydligen mer lyhörda för EP-transfektion än könsceller. Vi rekommenderar samtransfektion av testikel med mål och kontroll plasmider, var och en kodar för en annan reportergen.
Den presenterade elektroporering tillvägagångssätt kan tillämpas på ett brett spektrum av möjliga problem som hänvisar till manliga könscells och fertilitetsprocesser. Till exempel kan den användas för analys av regulatoriska element spermatogenes specifika gener 17,22. Metoden lämpar sig även för bortfall av funktion studier med små störande RNA 23 och få-av-funktionen studerar 24. Dessutom finns lovande möjligheter att ens åstadkomma EP för terapeutisk behandling och generering av transgena avkomma som forskargrupper redan visat 18,20,25.
Därför den illustrerade romanen metodiska tillvägagångssätt av mus testiklar in vivo elektroporering tillsammans med efferent kanal microinjection av plasmidkonstruktioner kommer förhoppningsvis att stiga till en värdefull teknik för att framgångsrikt unraveling arten av spermatogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Mårten Michaelis, Alexander Sobczak, och Joachim M. Weitzel anställd vid Institutet för reproduktionsbiologi, Leibniz Institute for Farm Animal Biology (FBN), Dummerstorf, Tyskland, förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Birgit Westernstroeer för Centrum för reproduktiv medicin och andrologi vid universitetet i Münster för undervisning testikelmikroinjektion. Dessutom är vi tacksamma för Ursula Antkewitz och Petra Reckling för tekniskt stöd. Vi tackar den tyska Research Foundation (DFG) för att stödja detta arbete (WE2458 / 10-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Sigma | 1-15 PK | |
| Spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| Micropipette puller | Narishige | PC-10 | vertical capillary puller |
| Microinjection capillaries | Clark | GC100-10 | borosilicate standard wall |
| Micropipette beveler | Bachofer | Typ 462 | rotating disk beveler |
| Electroporator | Nepagene | CUY 21EDIT | square wave electroporator |
| Tweezer electrodes | Nepagene | CUY 650P5 | 5 mm Ø disk electrodes |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Cold light source | Zeiss | KL 1500LCD | |
| Microinjection pump | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | homemade | XYZ cross table | |
| Surgical instruments | FST | scissors, forceps, needle holder | |
| Fine forceps | FST | Dumont #5, #7 | efferent ducts preparation |
| Michel clip applying stapler | FST | Michel, 12029-12 | |
| Michel suture clips | FST | Michel, 12040-01 | 7.5 x 1.75 mm |
| Surgical suture | Catgut, Markneukirchen, Germany | Catgut 00 | |
| Syringe with 30 G needle | B. Braun | Omnican 40 | to load micropipette and for anesthesia |
| Plasmid isolation kit | Promega | Cat. # A2495 | plasmid Midiprep |
| Plasmid pEGFP-C1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-promoter + EGFP |
| Plasmid pDsRed2-N1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-promoter + DsRed2 |
| Fast Green dye | Sigma | F7258-25G | for dilution in ddH2O |
| 10% Ketamine | Serum Werk, Bernburg, Germany | Urotamin | mix in a rate 1:1 with xylazine |
| 2% Xylazine | Serum Werk, Bernburg, Germany | Xylazin | mix in a rate 1:1 with ketamine |
| Sterilium | Bode Chemie | Sterillium | disinfection |
| Vet ointment | S&K Pharma, GmbH | Kerato Biciron 5%, Augensalbe | opthalmic ointment to prevent eye dryness |
| To-Pro-3 iodide | Invitrogen | T3605 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | |||
| 1.37 M NaCl | Carl Roth | 3957.1 | |
| Ibuprofen, Dolormin | Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany | 01094902 | analgesic pediatric solution (NSAID) for postsurgery pain relief |
| 27 mM KCl | Carl Roth | 6781.1 | |
| 100 mM Na2HPO4·2H2O | Carl Roth | T106.2 | |
| 18 mM KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
References
- Reuter, K., Schlatt, S., Ehmcke, J., Wistuba, J. Fact or fiction: In vitro spermatogenesis. Spermatogenesis. 2, 245-252 (2012).
- Hunter, D., Anand-Ivell, R., Danner, S., Ivell, R.
- Zizzi, A., et al. fluorescent protein as indicator of nonviral transient transfection efficiency in endometrial and testicular biopsies. Microsc. Res. Tech. 73, 229-233 (2010).
- Williams, R. S., et al. Introduction of foreign genes into tissues of living mice by DNA-coated microprojectiles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2726-2730 (1991).
- Bockmann, R. A., de Groot, B. L., Kakorin, S., Neumann, E., Grubmuller, H., Kinetics, statistics, and energetics of lipid membrane electroporation studied by molecular dynamics simulations. Biophys. J. 95, 1837-1850 (2008).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Brinster, R. L., Avarbock, M. R. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11303-11307 (1994).
- Schlatt, S., Von, S. V., Schepers, A. G. Male germ cell transplantation: an experimental approach with a clinical perspective. Br. Med. Bull. 56, 824-836 (2000).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), (2007).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), (2011).
- Blackshaw, S. In vivo electroporation of developing mouse retina. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Yomogida, K., Yagura, Y., Nishimune, Y. Electroporated transgene-rescued spermatogenesis in infertile mutant mice with a sertoli cell defect. Biol. Reprod. 67, 712-717 (2002).
- Ryoki, S., Park, H., Ohmori, Y., Shoji-Tanaka, A., Muramatsu, T. An integrase facilitates long-lasting foreign gene expression in vivo in mouse spermatogenic cells. J. Biosci. Bioeng. 91, 363-367 (2001).
- Umemoto, Y., et al. Gene transfer to mouse testes by electroporation and its influence on spermatogenesis. J. Androl. 26, 264-271 (2005).
- Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 45-49 (1997).
- Hibbitt, O., et al. In vivo gene transfer by electroporation allows expression of a fluorescent transgene in hamster testis and epididymal sperm and has no adverse effects upon testicular integrity or sperm quality. Biol. Reprod. 74, 95-101 (2006).
- Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a. J. Exp. Zool. 286, 212-218 (2000).
- Dhup, S., Majumdar, S. S. Transgenesis via permanent integration of genes in repopulating spermatogonial cells in vivo. Nat. Methods. 5, 601-603 (2008).
- Huang, Z., et al. In vivo transfection of testicular germ cells and transgenesis by using the mitochondrially localized jellyfish fluorescent protein gene. FEBS Lett. 487, 248-251 (2000).
- Majumdar, S. S., et al. A method for rapid generation of transgenic animals to evaluate testis genes during sexual maturation. J. Reprod. Immunol. 83, 36-39 (2009).
- Yomogida, K., Yagura, Y., Tadokoro, Y., Nishimune, Y. Dramatic expansion of germinal stem cells by ectopically expressed human glial cell line-derived neurotrophic factor in mouse Sertoli cells. Biol. Reprod. 69, 1303-1307 (2003).
- Ike, A., et al. Transient expression analysis of the mouse ornithine decarboxylase antizyme haploid-specific promoter using in vivo electroporation. FEBS Lett. 559, 159-164 (2004).
- Gonzalez-Gonzalez, E., Lopez-Casas, P. P., Del, M. J. Gene silencing by RNAi in mouse Sertoli cells. Reprod. Biol. Endocrinol. 6, 29 (2008).
- Tang, H., Kung, A., Goldberg, E. Regulation of murine lactate dehydrogenase C (Ldhc) gene expression. Biol. Reprod. 78, 455-461 (2008).
- Yomgogida, K. Mammalian testis: a target of in vivo electroporation. Dev. Growth Differ. 50, 513-515 (2008).
- Hayes, K. E., et al. An Evaluation of Analgesic Regimens for Abdominal Surgery in Mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 6, 18-23 (2000).
