Introduction
Процесс клатрин эндоцитоза (CME) зависит от своевременного прибытия многих компонентов клатрин опосредованного эндоцитоза машин для сбора грузов и манипулировать плазматическую мембрану в пузырьки 1-3. CME инициируется мембрана деформации и грузо-адаптера белков, которые приходят вместе в зарождающихся сайтов эндоцитоза 1. Эти белки набирать клатрин белка оболочки, который собирает в клетку-подобную структуру, которая образует клатриновых яму (КПК) 4. После того, как КПК полностью собран в сферическую форму, мембраны разрыва, в первую очередь через действия большого GTPase, динамина, генерирует свободные клатриновых везикулы (CCVS) 5,6. Это вызывает интернализацию быстрому распаду в клатрин покрытия, что позволяет компонентам быть повторно использован для множества циклов CME.
Открытие и характеристика белков, участвующих в CME была корни в традиционной Biochemical, генетические и методы микроскопии 4-6,8. Эти анализы выяснены роли и точки взаимодействия этих эндоцитотических компонентов. Хотя очень полезно для определения основных компонентов торговли машинами, эти анализы весьма ограничены в захвате динамического поведения компонентов CME или концентрации грузов. Это очень важный ограничение, так как CME движет хореографии сборке комплектов белковых модулей в определенных шагов, и, так как небольшие изменения в динамике отдельных эндоцитотических событий может иметь большие совокупные последствия эндоцитоза. Кроме того, недавние данные показывают, что отдельные ККТ могут отличаться как по составу, так и в поведении, предполагая, что физиологическое регулирование этого процесса весьма пространстве и во времени ограничены 9-14. Визуализация отдельных эндоцитотических события, поэтому, очень важно понять, почему существует несколько избыточные белки, участвующие в CME и как эти белки могут контролироваться бу физиологические сигналы для регулирования грузовой интернационализации.
Здесь мы опишем использование полного внутреннего отражения флуоресцентной микроскопии (TIRFM) наблюдать CME на уровне динамики отдельных ККТ в живых клетках. TIRFM опирается на разность показателей преломления между покровным стеклом и жидкую окружающую среду клеток 15,16. Когда возбуждающий свет направлен клеток на более, чем критический угол, она внутреннее отражение, создавая затухани волн, который поддерживает тонкую область освещения, проходящую приблизительно 100 нм выше покровного стекла. Это гарантирует, что только флуоресцентных молекул в этой узкой области возбуждены. Практически, это позволяет возбуждение флуоресцентных молекул на территории или вблизи плазматической мембраны, и сводит к минимуму флуоресценции из внутренних частей клетки. Это обеспечивает значительно более высокий коэффициент сигнал-шум и ось г разрешение для визуализации событий на плазмалеммы, товарищескойmpared для наиболее часто используемых режимах, таких как обычной эпифлуоресцентной или конфокальной флуоресцентной микроскопии. Мы также описать, в вступительного и практическом уровне, использование широко применяемого платформы анализа изображений для анализа и количественного простые морфологические особенности и динамику отдельных событий грузов эндоцитотических.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Выражение флуоресцентно меткой CME компонентов в культивируемых клетках
НЕК293 полезные модели клетки, которые были использованы широко изучать GPCR биологию и эндоцитоз, и поэтому используются в качестве моделей в этом протоколе. Используйте любой протокол трансфекции, обеспечивающую равномерное выражение без избыточной экспрессии и низкой цитотоксичности.
- Ручка все культуры клеток в стерильной ламинаре. Заполните 4 лунки 12-луночного планшета с 1 мл модифицированной по Дульбекко Essential медиа (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). С сливной T25 колбу НЕК293 разбавить 1:50, 1:25, 1:16, 1:10, соответственно, в каждом из 4 скважин.
- Кроме того, семена клетки многолуночном пластины нужного размера в, в соответствии с инструкциями изготовителя. Семенной 0,4 - 2 х 10 4 клеток в 12-луночного планшета. Вырастить клеток в течение ночи в стерильном 37 ° С с 5% СО 2 и 95% влажности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая, что рост гАтеш варьируются в зависимости от условий и клеточных линий, было бы предпочтительнее, чтобы отобрать несколько скважин для обеспечения идеального слияния для трансфекции на следующий день или возможность выполнения трансфекций в двух экземплярах.
- Кроме того, семена клетки многолуночном пластины нужного размера в, в соответствии с инструкциями изготовителя. Семенной 0,4 - 2 х 10 4 клеток в 12-луночного планшета. Вырастить клеток в течение ночи в стерильном 37 ° С с 5% СО 2 и 95% влажности.
- На следующее утро, выбрать Хорошо, что это ~ 70% сливной для трансфекции (см рисунок 1b). Если нет хорошо достигло этого состояния, ждать еще один день.
ПРИМЕЧАНИЕ: 70% слияния идеально подходит для НЕК293. Трансфекции клеток, которые являются более редкие приводит к гибели клеток и токсичности. Трансфекции более-сливной клеток приводит к плохой выражения. - Добавить 60 мкл буфера EC (от трансфекции комплекте), 400 нг плазмиды, кодирующие помечены GPCRs и / или компоненты клатрин техники и 2,4 мкл Enhancer в 1,5 мл микроцентрифужных трубки, как описано в инструкции производителя. Vortex в течение 2 сек, чтобы обеспечить достаточное перемешивание, и спина в микроцентрифуге в 2000 мкг в течение 2 сек для сбора жидкости в нижней части.
- Добавить6 мкл Effectene, как описано в инструкции производителя. Вихревые в течение 2 сек, и спина в 2000 мкг в течение 2 сек в микроцентрифуге для сбора жидкости в нижней части. Подождите 20 минут, чтобы позволить для формирования трансфекции сложных мицеллы.
- Аспирируйте СМИ от скважины для трансфекции. Осторожно добавляют 0,8 мл среды DMEM с 10% FBS с реагента для трансфекции смеси и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз медленно, чтобы уменьшить нарушение мицеллы. Добавить СМИ и трансфекции смеси в скважине очень медленно со стороны. Добавить оставшуюся трансфекции смесь из трубки микроцентрифужных к колодцу с помощью микропипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: При желании можно добавить дополнительные 0,5 мл DMEM с 10% FBS, чтобы трансфектированную хорошо, чтобы дать клеткам дополнительное питание, что приводит к более мягким трансфекции и нижней временной экспрессии. - Вернуться клетки в 37 ° C инкубаторе в течение 5 часов.
- Аспирируйте СМИ, содержащие трансфекции смесь. Заменить 1 мл DMEM с 10% FBS. Разрешитьклеткам расти в течение ночи.
- На следующий день, проходят клетки с непокрытыми покровные, ранее стерилизованных в автоклаве.
- Добавить 0,5 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) с 1 мМ ЭДТА в каждую лунку. Кроме того, использование 0,5 мл 0,05% трипсина-ЭДТА. Оставьте в инкубаторе в течение 1 мин.
- Поместите 3 раунд, стерильные 25 мм покровные в отдельные лунки 6-луночного планшета. Заполните каждую лунку по 2 мл СМИ. Аккуратно нажмите на покровное вниз к нижней части скважины, чтобы предотвратить клетки от растет в нижней части покровного стекла.
- Вручную агитировать хорошо стартовать клетки со дна колодца. Добавить 1 мл DMEM с 10% FBS ресуспендировать. Распределите подняли клетки от 1 лунку 12-луночного планшета с равномерно среди 3 покровные. Кроме того, пластины клеток на 3 прозрачным дном посуды.
- Разрешить клетки растут на покровные, по крайней мере 48 часов, после чего визуализации. Убедитесь, что клетки разбросаны и помещения.
2.Изображений КПК и грузовые Динамика Использование TIRFM
- Конъюгат M1 анти-FLAG антитела с Alexa красителей с использованием Alexa Fluor комплект Белок маркировка в соответствии с протоколом изготовления. В качестве альтернативы, предварительно конъюгированные антитела могут быть приобретены.
- Предварительно инкубируют клетки с антителами в разведении 1: 1000 в 1 мл подогретого Лейбовиц среде с 10% FBS, или Opti-MEM с 50 мМ HEPES, рН 7,4, и 10% FBS в течение 10 мин при 37 ° С (томография среда), для обозначения FLAG-меткой GPCRs на клеточной поверхности. Перейти следующие действия, если генетически кодируемые флуоресцентные белки, такие как GFP, используются в качестве меток (см обсуждение для деталей).
- Трансфер покровное к камере изображений живых клеток. Кроме того, для стеклянным дном посуды, аспирации антитела маркировки СМИ и добавить 700 мкл подогретого среды визуализации.
- Используйте пару щипцов и согните кончик 25 иглы в крюк.
- Держите пару щипцов в доминирующей рукой. Держите согнутую иглу в дрэ. Поверните иглу до кривых крюк вниз к стеклу. Осторожно перетащить иглы, крючок стороной вниз, в нижней части 6-луночного планшета, пока он не перехватывает на покровное. Позаботьтесь, чтобы не поцарапать поверхность покровного стекла, как это будет отделить клетки. Аккуратно поднимите покровное со дна колодца. Весы покровное к стене колодца для поддержки.
- С помощью пинцета, чтобы понять, близко к краю покровного стекла и перейти на сторону покровное клеток до камере формирования изображения, и собрать камеру. Добавить 700 мкл (или соответствующее количество) из подогретого среды визуализации. Ручка покровные тщательно без давления, чтобы предотвратить растрескивание или разрыв.
- Передача камеру к микроскопу и поддерживать температуру клеток при 37 ° С с использованием стадии нагреватель или закрытый инкубатор.
- Принесите клеток в фокусе, используя 100X или 60X TIRF масло-иммерсионный объектив (1,45 NA или выше). Image клетки в обычной эпифлуоресцентной или конкоординационные режимы освещения (т.е. не TIRFM) для идентификации клеток, экспрессирующих соответствующие конструкции. Нет в фокусе клетки почти невидимым в тонкой глубине TIRF освещения делает его трудно найти в фокальной плоскости и клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые системы используют одни и те же лазеры для TIRFM к изображению в обычном эпифлуоресцентной, перемещая угол падения выше критического угла лазера. В качестве важного предосторожности безопасности, всегда быть в курсе угла лазерного луча, и всегда направлять его от наблюдателя. - Фокус вниз к нижней поверхности клетки, экспрессирующей, пока контур плазматической мембраны вокруг клетки не исчезает, и появляется в центре ячейки. Это наиболее очевидно с плазменной мембранного белка локализованы грузов, таких как μ-опиоидных рецепторов (см рис 2А).
- Переключение в режим визуализации TIRF.
- Если, используя те же лазеры для визуализации в обычной эпифлуоресцентной, увеличить угол падениялазер до из-из-фокус флуоресценции в глубь ячейки исчезает, и нет наброски мембране вокруг клетки не видно. (Сравните фиг.2с данным 2А и 2В)
ПРИМЕЧАНИЕ: В TIRFM, двигаясь в фокальной плоскости вызывает образ идти полностью в фокусе и / или тусклым, и общий уровень флуоресценции уменьшается за счет меньшей глубине освещения. Поэтому, альтернативный метод, чтобы переключиться на TIRFM освещения является первым акцентом на центр ячейки в конфокальной / традиционная эпифлуоресцентной, затем увеличить угол падения, пока не потеряет большую часть флуоресценции, а затем сосредоточиться до плазменной мембране. - После того, как в TIRFM, обеспечения лазерного возбуждения отражает обратно через объектив и не видна над целью. Подтвердите это, проверяя, если лазерное пятно видно.
ПРИМЕЧАНИЕ: В обычных эпифлуоресцентной или конфокальной режимов, лазерный освещения видна над целью,например, на потолке. - Уточните фокус, чтобы получить четкое изображение. Основными компонентами эндоцитотического машин, таких как клатрина, будут видны в Puncta. Настройте фокус на отлично, поэтому Puncta являются круглыми, как это возможно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для мембраной локализованы груза, регулировать точной фокусировки, пока филоподии не появятся различны. - Используйте программу приобретения, чтобы сохранить все параметры изображения, такие как зеркала и углом TIRF. Сделайте это для всех необходимых длин волн.
- Если, используя те же лазеры для визуализации в обычной эпифлуоресцентной, увеличить угол падениялазер до из-из-фокус флуоресценции в глубь ячейки исчезает, и нет наброски мембране вокруг клетки не видно. (Сравните фиг.2с данным 2А и 2В)
- Сканирование вокруг покровного найти клетки, экспрессирующие все желаемые эндоцитотических маркеры: на μ-опиоидных рецепторов и адаптер β-arrestin в примере, показанном на рисунке 3А. Выберите ячейки, которые выражают, но не чрезмерно, выражающие. Смотреть обсуждение для деталей.
- После того, как клетки идентифицируют, получать изображения каждые 3 секунды в течение 10 мин. Этого достаточно, чтобы захватить время жизни КПК, так как средний срок службы КПК в НЕК293 отображенных в этих условиях является Aroунд 40 сек 10-11. Это позволяет приблизительно 12-14 кадров для наблюдения КПК. Например Просмотреть фильм 1. Повторите все шаги для изображения дополнительных ячеек.
3 Анализ эндоцитотических Dynamics по ручной проверки
Хотя руководство проверка КПК жизни значительно ограничены по количеству ККТ, которые могут быть обнаружены, она по-прежнему остается точное средство обнаружения Невзирая на глобальные изменения в изображения и обнаружения артефактов. Смотреть обсуждение для деталей.
- Откройте файл в ImageJ. Изображения сохраняются в виде единого стека файлы TIFF с перемежающихся каналов. Преобразование изображения в hyperstacks. К Image> Hyperstacks> Стек для HyperStack. Введите число каналов покупки (если изображений β-arrestin и μ-опиоидных рецепторов, введите 2), введите 1 для Z стека (TIRFM является одной плоскости), и количество кадров фильма (т.е. 10 мин фильм на 1 кадр каждые 3 секунды яс 200) в всплывающем окне.
- Формат HyperStack дает окно с двумя полосами прокрутки. Используйте верхнюю панель для перемещения по каналам и нижней части, чтобы перемещаться по времени. Прокрутка к каналу белка которого время жизни будет анализировали.
- Перемещение к кадру 10 или 15 фильма, чтобы уменьшить включение уже существующих ККТ, вся продолжительность не видны. Нарисуйте окно ROI вокруг пятна выбранного наугад.
- Подсчитайте количество кадров пятно видно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите рисунок 3B и 3C примеры трех морфологических категорий эндоцитотических событий 10,11,16-19.
4 Анализ эндоцитотических Dynamics по объективным признанием
Задача распознавания позволяет обнаружить практически все отображаемого ККТ в клетке, но могут быть подвержены ошибкам за счет ложного обнаружения ошибочных структур. Смотреть обсуждение для деталей весом преимущества и недостатки еМетод ACH. Несколько программ, в том числе заказных алгоритмов, могут быть использованы для объективной обнаружить ККТ. Этот протокол описывает объективную признание ККТ с использованием Imaris, в программное обеспечение анализа изображений (см Материалы).
- Для начала откройте файл необработанного снимка в программе анализа изображений. По умолчанию, появляется объединенная цветное изображение. Используйте окно «Настройка дисплея", чтобы отрегулировать яркость канала. Нажмите на название канала для изменения отображаемого цвета. Снимите флажок на канал, чтобы предотвратить его дисплей (См рисунок 4А).
- Создание "Spots", нажав на иконку с оранжевыми пятнами. Смотрите рисунок 4B. Выберите области интереса (ROI) вокруг клетки. Смотрите рисунок 4C. Используйте ROI исключить области, которые будут неправильно обнаружить яркие передние кромки и бляшки. Проанализируйте несколько ячеек с различными уровнями экспрессии отдельно.
- Измерить диаметр пятна в PROVIде первоначальные оценки для алгоритма. Переключение в режим «Разрез», и нажмите на полярных концах месте, чтобы измерить его диаметр. Смотрите рисунок 4E. Делайте это в течение 4 или 5 круглых пятен, которые выглядят свидетельствует о КПК в разгар его стабильности, то после формирования и до разрыва. Используйте эти измерения для расчета среднего диаметра до ближайшей десятой доли микрона.
- Обнаружение пятен. Возврат в режим "превзойти". Выберите подходящий канал для обнаружения. Введите среднее измеренное диаметр, как правило, 0,3 или 0,4 мкм. Нажмите на синюю стрелку вперед для количественного определения пятна. Смотрите рисунок 4E. Если диаметр пятна недооценивается, паразитные точки флуоресценции будут определены как пятна. Если диаметр слишком велик, настоящие пятна будут проигнорированы. Когда не уверены, оценить чуть ниже, и отфильтровать неверные обнаружений позже.
- Фильтр пятна на качество. Отрегулируйте фильтр, чтобы захватить как много мест, как это возможно без спинкиземля. Фильтр Качество выбран по умолчанию 20. Смотрите рисунок 4F.
- Используйте кривую «Качество», в качестве руководства для установки соответствующего порога. Перемещение нижнего порога фильтра с левой кнопкой мыши, чтобы этот первый провал в кривой. Это хорошая отправная точка для фильтра, как эта позиция, как правило, уточняет определение к только видимых пятен. Смотрите рисунок 4F.
- Обнаруженные пятна появляются на фильме, как сферы или центра пикселей. С помощью вкладки "Colors", настроить цвет пятна на контрастного цвета, чтобы сделать его легче увидеть их. Прокрутка фильма пересмотреть мест в каждом кадре. Цель состоит в том, чтобы обнаружить, как много мест, как это возможно для полноты их жизни.
- Ликвидировать тусклые пятна или вручную соединить их в непрерывные треков позже, так как они не обнаружены хорошо через ходе своей жизни.
- Удалить яркие таблички с «Intensity» филтер, если требуется. Нажмите на зеленую плюс, чтобы добавить новый фильтр. Смотрите рисунок 4F. Создайте Intensity фильтр для фильтрации или уменьшения пятна заданной флуоресцентных сигналов. Используйте созданный Intensity кривую, (аналогично качества Curve обсуждается в 4,5), чтобы установить порог. Используйте левую кнопку мыши, чтобы удалить крайнюю левый конец кривой, которая представляет самые яркие пятна.
Примечание: Большие бляшки структуры, как правило, среди ярких элементов в клетке, и они легко исключить с этим фильтром. - Прокрутка фильма для того, чтобы ЦКА не обнаружено, как пятна и яркие бляшки больше не обнаружено. Рис 3D показана ячейка, где обнаружение ККТ (обозначается белыми сферах) был оптимизирован с качеством фильтра и бляшки были исключены с качеством фильтр.
- Уменьшите яркие края ячейки с качеством фильтра. Яркие объекты, возможно, нужно удалить вручную, на следующем этапе. Продолжить с голубойстрелка.
- Удалить аномальные пятна на экране Edit пятен. Перейти к "Выбрать" режим. Нажмите на месте. Это станет желтой. Нажмите кнопку "Delete". Нажмите на синюю стрелку, чтобы продолжать строить алгоритм. Смотрите рисунок 4G.
- Мера треков. Установите песни в "броуновское движение". КПК должен не наблюдается никакого направленное движение, только минимальный дрейф через плазматическую мембрану. Этот алгоритм является наиболее подходящим для этого движения. Смотрите рисунок 4Н.
- Установите Максимальное расстояние до небольшой величины, такие как 0,7 мкм. Смотрите рисунок 4Н.
ПРИМЕЧАНИЕ: Установка на небольшое расстояние минимизирует подключение соседних пятен и еще позволяет продолжать отслеживание пятна клеток через КПК или клеточного движения. - Установите Макс Gap Размер до 1, что позволяет дорожку, чтобы продолжить, если есть только один кадр отсутствует подряд. Нажмите на синюю стрелку, чтобы вычислить следы. Смотрите рисунок 4Н.
ПРИМЕЧАНИЕ: Gп. размеры более 3 причин различных треков, которые будут неправильно соединены. - Переключить трек просмотра в "Dragon Tail.» Прокрутка фильма наблюдения качества обнаружения. Если соседние пятна находятся на стадии подключения, уменьшить Максимальное расстояние ниже 0,7 мкм. Если пятна нарушаются слишком легко, увеличить Макс Gap Размер. Нажмите на синюю стрелку, чтобы создать треки. Это приводит к экрану фильтр треков. Смотрите рисунок 4Н.
- Установите Максимальное расстояние до небольшой величины, такие как 0,7 мкм. Смотрите рисунок 4Н.
- Фильтр треков и экспорта данных. Используйте «интенсивность» фильтр для удаления дополнительных ярких бляшки. Используйте «смещения», фильтр для удаления эндосомы, что выйти на поле TIRF. Будьте осторожны, так как длинные Пятна будет иметь больше перемещений, а также. Нажмите на зеленую двойную стрелку, чтобы завершить работу над протоколом. Смотрите рисунок 4I.
- Используйте вкладку Edit Tracks, с значок карандаша, чтобы удалить ошибочного определения треков, которые не могут быть удалены с помощью фильтров. Проверьте DISCONTinuities или ложные соединения. Для соединения двух треков, выберите их с помощью Ctrl-Left-Click, нажмите "Connect" в окне редактирования треков. Чтобы отключить треки в отдельных пятен, выберите трек и нажмите "Отключить". Выберите несколько пятен с Ctrl + Left-Click и нажмите "Connect", чтобы создать новый трек. Метод является одинаковым для редактирования роликов, описанных в 4.5.7. Смотрите рисунок 4J.
- Для экспорта данных, перейдите на вкладку статистики. Кликните на одной иконе дискеты экспортировать выбранной статистики. Нажмите на иконку, которая выглядит как серия дискет для экспорта всех статистических данных. "Длительность записи" статистика содержит длину эндоцитотических треков. Смотрите рисунок 4K.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Использование живых клеток TIRF микроскопии мы записали эндоцитотического динамику μ-опиоидных-рецептора (МЖД), G-белком рецептор (GPCR) и его эндоцитотический адаптер белок β-arrestin. Β-arrestin конструкцию временно трансфицировали в клетки, стабильно экспрессирующие линии MOR, используя протокол, описанной на фигуре 1, и отображаемого 96 ч позже. MOR в стабильной клеточной линии является N-терминальной помечены с рН-чувствительной GFP. Этот флуоресцентный белок флуоресцирует только в нейтральной внеклеточной жидкости. Кроме того, MOR endocytoses только после активации агонистом, и остается в противном случае равномерно распределены через плазматическую мембрану. Сосредоточение внимания на клейкой мембране, что сидит на обложке стекла в результатах конфокальной режиме в клетке, которая заполняется в с тусклой флуоресценции. Это отличается от сосредоточив внимание на центре ячейки, где плазматической мембраны наблюдается только в виде кольца вокруг флуоресценции на клетку. Сравните левуюи правая панели на рисунке 2а. Переключение с обычной эпифлуоресцентной или TIRF с неправильным углом вызывает флуоресценцию из фокуса, чтобы стать очевидными в тех же клетках, как показано на фиг.2В. Когда угол TIRF правильно плазматическая мембрана не очень четкое, ясное и яркое и из флуоресценции фокус больше не разрушает образ. Сравнение фиг.2С, чтобы фиг.2А и 2В.
Изображение яркое и четкое, потому что МЖД на клейкой мембране, что во многом в поле TIRF. В отличие от этого, β-arrestin остается в цитозоле бассейна, когда еще не набраны в эндоцитотического Puncta, и, как представляется туманной и не в фокусе, потому что это не в области TIRF. После МЖД активируется агониста, β-arrestin набирается в плазматическую мембрану, и оба β-arrestin и рецептор перераспределить в ККТ (фиг.3А и Movie 1 , Β-arrestin в зеленом, МЖД в красном, наложения желтый).
Время жизни этих кластеров могут быть количественно вручную с помощью трех параметров для завершенного эндоцитоза, как показано на рисунке 3B. Пятна, обозначающие ККТ может либо полностью исчезают (смотри рис 3C), "мигать" и выключается или "отщипнуть" более крупной структуры. Последние два условия представляют события, которые пространственно слишком близко друг к другу, чтобы быть решены как отдельные события. Алгоритм обнаружения пятна в Imaris также полезен для количественного ККТ, как указано на рисунке 4. Рисунок 3D обозначает ККТ обнаружен с помощью Imaris, после фильтрации для удаления не динамические структуры зубного налета. Наложенные белые сферы обозначают обнаруженные пятна. Диммер пятна, которые не могли быть обнаружены целые их жизни также были исключены с фильтром «Качество».
">
Рисунок 1: Схема производства трансфекционного процедуры. (А) Прежде всего, семена различных разведений (1:50, 1:25, 1:16, 1:10) на 12-луночный планшет. Разрешить клетки расти в течение ночи. На следующий день, искать источника, что около 70% сливной, и равномерно распределенной, как изображено. Это хорошо, что будет трансфицировали. (Б) Добавить 60 мкл буфера EC и 400 нг ДНК в микроцентрифужных трубки. Вихревые в течение 10 сек и спин жидкости в нижней части трубы. Добавить 2,4 мкл Enhancer. Вихревые в течение 2 сек и спин жидкости в нижней части трубы. Инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин. Добавить 6 мкл Effectene. Вихревые в течение 2 сек и спин жидкости в нижней части трубы. Инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин. (C) Медленно перемешать 0,8 мл DMEM с 10% FBS с трансфекции. Добавить в клетках в ранее выбранный хорошо. Инкубируйте клетки в течение 5 ч при 37 ° С. Замените свежиеDMEM с 10% FBS.
Рисунок 2: Нахождение поле TIRFM. (А) плазматическая мембрана отображается в конфокальной. На левой панели изображен клетки конфокальной с акцентом на центр ячейки. Плазматической мембраны наблюдается только в качестве "кольца" вокруг клетки. Фокусировка до базальной мембране, прилегающей к покровным вызывает клетка должна быть заполнена с тусклой флуоресценции. Плазматическая мембрана "кольцо" не должны быть видны в более тонкой области TIRF. (B) базальная плазмалеммы с меньшим углом TIRF выпуск обычных освещение эпифлюорисцентной через образец. Это освещает всю клетку и многое из флуоресценции фокусировки от верхней части ячейки присутствует. (C) плазматическую мембрану в TIRF. Сосредоточение внимания на филоподий помогает найти этот самолет. Обратите внимание, что этогладкой одной плоскости. Шкала баров являются 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Визуализация и Количественная эндоцитотических события в TIRF. (А) Клетка выражая μ-опиоидных-рецептор (MOR) и β-arrestin до и после добавления агониста, что вызывает эндоцитоз. Агонист вызывает перераспределение обоих белков в эндоцитотическом Puncta. Шкала бар составляет 10 мкм. (B) Три типа эндоцитотических событий, видел, визуализируя динамику arrestin, в соответствии с ранее описанными морфологии. "Устойчивый", один устойчивый сигнал, что быстро исчезает. Это основной вид, указывая, что КПК разрослась и покинул поле TIRF. "Blink", сигнал, который мигает до более низкого сигнала и появляется на том же месте за счет сборки второго КПК на том же месте. "Повышение от", трубчатый выступ отрывается место, когда два ККТ находятся слишком близко друг к другу, чтобы решить, как отдельных пятен, и один эндоцитарных. Коробка 2 х 2 мкм. (C) Визуализация клатрином опосредованного эндоцитоза МЖД при разрешении одного события. Два примера, которые представляют основную часть MOR эндоцитотических событий показаны. Кадры раз в 3 сек. Коробка 2 х 2 мкм. (D) Обнаружение отдельных эндоцитотических событий с помощью Imaris. Белые шары обозначают ККТ обнаруженные в виде пятен. Обнаружение Пятно было оптимизировано с помощью фильтра «Качество». Диммер пятна, которые не могли быть обнаружены для полноты их жизни также были исключены с качеством фильтра. Большие бляшки структуры, которые показаны как незамеченными были опущены с помощью «интенсивность» фильтр.ig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Цель Признание динамики эндоцитотических События использованием Imaris. () Окно настройки дисплея, используется для настройки отображения изображения, как описано в шаге 4.1. (B) Открытие "пятна" Algorithm Builder. Застройщик отображается в окне ниже. (C) Первый шаг алгоритма Пятна строителя. Проверьте "Track пятна (с течением времени)." При необходимости Проверьте "Сегмент только интересующей области,". Экран (D) выбора ROI. Смотрите шаг 4,2 для деталей. (E) многочисленные окна, необходимые для определения диаметра измеряемого пятна. Панели представляют: переход от Превзойти в режим Slice помощью Naviдование Бар в верхней, нажав на полярных концах месте, где измеряется диаметр отображается, как правило, расположены в правой стороне, где введите измеренный диаметр. Смотрите шаги 4,3-4,4. (F) Спот фильтр Качество описано в 4.5-4.5.3. (G) Редактировать окно пятна описано в 4.5.7. (H) Мера треков и просмотр треков окна, описанные в 4.6. (I) Окно фильтра треков описано в 4,7. (J) Редактировать отслеживает окно описано в 4.7.1. экран данных (K) Сохранить описано в 4.7.2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Фильм 1 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы опишем использование TIRFM визуализировать клатрином опосредованный эндоцитоз (CME) на уровне индивидуальной ККТ в живых клетках в реальном времени. CME является быстрым и очень динамичным событием посредничестве кумулятивного эффекта многие пространстве и во времени отдельных индивидуальных событий. Большинство анализов, которые в настоящее время используются, такие как биохимических измерений интернализации с использованием поверхности биотинилирование или связывание лиганда, проточной цитометрии или фиксированные клетки анализов измерения количества интернализованных белков или электронно-микроскопического локализации белков, контролировать ансамбль изменения в локализации белков в фиксированных точках времени . Эти существующие методы оказались очень полезными в идентификации белков, которые необходимы для CME, однако не имеют пространственное и временное разрешение, которое соответствует физиологические масштабы CME или других процессов торговли людьми динамичный мембранных. Это важно, так как последние данные свидетельствуют о том, что ККТ являются гетерогенными в их составе белка и динамики 9-12, и, как CME, скорее всего, быстро регулируется в пространственно дискретным образом. Онлайн TIRFM клеток обеспечивает возможность анализировать CME на уровне пространственно разделенных одной ККТ, в режиме реального времени, в живых клетках.
Успешное применение этого мощного анализа основывается на двух ключевых факторов: хорошее здоровье клеток и тщательного анализа параметров CME. Для бывшего, надлежащего выражения меченых белков и методов микроскопии минимизации фототоксичность имеют решающее значение. Клеточные линии, стабильно экспрессирующие белки интерес идеальны, как уровни экспрессии может быть надежно оценена. Мы пометить рецепторы с либо N-терминал эпитопными Флаг или SPH тегов 21-25. Хотя это и не строго необходимо, обе системы маркировки облегчить TIRFM из CME, потому что рецепторы могут быть избирательно обнаружены на плазматической мембране в начале эксперимента. Нужные дополнительные эндоцитотических компоненты также могут быть временно трансфицировали в таких стабильных клеточных линий. TRПротокол ansfection отметить, оптимизирован для визуализации CME помощью TIRFM. Во-первых, он специально для четных и умеренных уровней экспрессии. Плохо выражение требует более высокой мощности лазера для обнаружения и увеличивает риск как для фототоксичности и фотообесцвечивания. Кроме того, поскольку этот анализ записывает исчезновение Puncta как интернализированных ККТ, низкие сигналы и фотообесцвечивание вредны также анализа. Мы полагаем, что, при таких обстоятельствах, общая продолжительность и / или частота визуализации быть снижена. Во-вторых, короткой инкубации трансфекции реагентов на клетках, интервал между трансфекции и эксперимента, и на свежем прохождения трансфицированных клеток в покровных до обработки изображений, всего обеспечить, чтобы отображаемого клетки находятся в оптимальном здоровье. В-третьих, это гарантирует, что большинство клатрином структур ККТ, а не плоские листы или клатрином клатрином бляшек. В-четвертых, этот протокол минимизирует Сверхэкспрессия трансфектированных компонентов CME, которая была шоун изменить CME динамику 20,26.
Для визуализации с низким фототоксичности, важно, чтобы оптимизировать систему формирования изображения для оптимального разрешения и максимальной чувствительности. Увеличение объектива и размера детектора камеры должны быть согласованы, чтобы минимизировать недо- или избыточной дискретизации и пустой увеличения. Высокий числовая апертура (1,45 или выше) TIRF цель должна быть использована для сбора максимального свет возможное. Мы получать изображения с камеры в сочетании устройства электронно-умножения заряда для высокой квантовой эффективностью, низким временем экспозиции, и высокая скорость считывания. Кроме того, чтобы обеспечить здоровье клеток, они загружаются в Лейбовиц средств массовой информации, который зависит от буферном CO 2, и с добавлением 10% FBS, в полностью закрытой камере, установленной на 37 ° С. Потому TIRFM обладает высокой чувствительностью и высокие цели числовая апертура, используемые может обнаружить даже минимальное рассеянный свет, очень важно создать закрытую среду обработки изображений бесплатноот внешнего света и вибраций, которые могут нарушить тонкую фокальной плоскости.
Важно отметить, что абсолютные времени жизни и динамика большинства компонентов CME варьируются в значительной степени в зависимости от типов клеток, уровни экспрессии белков, температура, дней после посева, а также другие изменения в условиях культивирования 7,10,14,17,20, 25,27. Это отражается в огромных изменений в сроки и распределений наблюдаемых между различными группами, используя эту технику, четкое ограничение этом анализе. Кроме того, вполне возможно, что ККТ на нижней поверхности клетки, отображаемого в TIRFM, ведут себя по-разному от верхней поверхности 23,25. Хотя это спорно, какие поверхности точно представляет собой "типичные" ячейку, окруженный компонентов внеклеточного матрикса в ткани, интерпретации КПК динамики, с помощью этого метода необходимо учитывать эту разность потенциалов. Истинная сила анализа, таким образом, заключается в сравнении изменения реynamics из ККТ, в тех же клетках при одинаковых условиях культивирования, после острых манипуляций, в том числе кластеризации молекул грузовых таких как GPCRs в ответ на активацию. Это сравнение позволяет нормализации изменений в той же камере, тем самым управляя для всех указанных выше параметров, которые могут вызвать изменения в УПК поведения.
Мы обычно используют ручные и автоматизированные анализы, описанные выше, для анализа продолжительность эндоцитотических событий: ручной проверки и объективное признание с помощью программного обеспечения для анализа изображений Imaris. Руководство проверка трудо- и временных затрат, так как ограничена по количеству ККТ пользователь может рассчитывать, но это, возможно, самый точный способ доступен. Обученный человеческий глаз может легко продолжить отслеживать КПК через клеточного движения, а также изменения в формы или фокус, точно, исключая бляшек и дефектных пикселей. Он может также обнаружить морфологические изменения в УПК свидетельствует о завершенной наканунеНТС, как показано в рисунке 3B и 3C. Крайне важно, однако, что анализ остается объективным в рамках этих ограничений. Это требует определения конкретных критериев, которые используются последовательно во всех наборов данных. Кроме того, мы, как правило, анализ изображений, в двойном слепом принципу, где имена изображений яичницы так что условия остаются неизвестными для человека, анализируя изображения. Автоматическое обнаружение, например, с помощью "точек" и "Длительность записи" алгоритмы в Imaris, может быть использован для обнаружения большинства эндоцитотических пятен в данном фильме, формировани количества высокой пробы. В то время как много вариантов, в том числе очень сложных заказных алгоритмов 3,14,23,26,27, генерируются, надежность этих методов для обнаружения правильные эндоцитотических события, избегая ложного обнаружения остается самое большое беспокойство. Например, в Imaris, движение клетки создавать яркие передние кромки, таблички, и изРамки фокусировки можно легко скинуть алгоритм место обнаружения, так как он имеет тенденцию к выявлению ярких структур, как состоящую полностью из пятен. Для того чтобы предотвратить эти пятна от быть соединены в дорожке, все они должны быть удалены. Холост аберрантными Пятна, которые не в крупных структур, таких как бляшек могут быть удалены с Edit Пятна вкладка, в то время как пятна, связанные может быть удален позже с помощью вкладки Редактировать Треки. Аберрантная пятна также можно удалить с помощью пользовательских фильтров. Например, на рисунке 3D показывает фильтр интенсивности используется для ограничения избежать включения бляшек в обнаружении КПК. Фильтр качества является еще одной очень полезной фильтр для удаления ошибочных пятна. "Качество" является кумулятивным измерение яркости и форму найдено, принимая интенсивность флуоресценции на месте и гауссовой фильтрацией на ¾ длины радиуса пятна 20. Кривая качества находится под выбранных фильтров. Она изображает количество пятен (у) обнаруженкогда качество является определенное значение (х). Чем ниже качество, тем больше места обнаружено. Если качество фильтра является слишком низкой, пятна будут обнаружены, где нет видимой флуоресценции, наоборот, если качество фильтра является слишком высокой, только яркие пятна будут обнаружены. Следуйте вдоль кривой в направлении больших значений (х); количество пятен обнаруживается (у), как правило, резко падать. Перемещение нижнего порога до этой точки. Это точка минимума разместить нижнего порога. Другие основными причинами ложных мест в области TIRF являются эндосомы, которые движутся к периферии клетки и выйти на поле TIRF. Надежный критерий для удаления них является подвижность пятен, то есть перемещения пятен с течением времени. ККТ двигаться очень мало, если в качестве части движения всей клетки, в то время как эндосомы демонстрируют быстрое броуновское или направленное движение. Новые алгоритмы, в то время как значительно улучшилось, все еще уточняются и оптимизированы 3,14,23,26,27. Поскольку эти встретилсяHODS становятся все более изощренными и надежный, мы можем проанализировать сотни или тысячи мест, без необходимости вручную проверять их в каждой точке. В настоящее время, однако, мы предполагаем, что эти два анализа можно использовать вместе, чтобы дополнять друг друга для точности.
Протокол мы описали может быть легко адаптирована ответить на многие вопросы, касающиеся груза эндоцитоза. Он может быть использован для выполнения простой совместной локализации грузов с компонентами CME, и используется, чтобы показать изменения на конкретных компонентов эндоцитотического машин в связи с конкретными стимулами. Анализ также может быть легко адаптирована для любого процесса эндоцитотическом, таких как кавеол 28, которые показывают дискретные концентрации грузовых и пальто компонентов, и к изучению этих фундаментальных процессов в специализированных типов клеток. В будущем, как редакция геном становится более распространенными 20,29,30, мы ожидаем, что он станет предпочтительным методом для мечения компонентов, и что динамика и поведение OF различные компоненты будут уточняться дополнительно. Учитывая, что наше понимание клеточных процессов в значительной степени обусловлен идентификации генов, модификации белка, и интерактомов, анализ мы описали здесь представляет собой один из следующих границ дознания, а именно. определение пространственно-временных динамике этих процессов и механизмов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/High Glucose with L-glutamine and sodium pyruvate | Fisher Scientific | SH3024301 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco, by Life Technologies | 21600-010 | |
| EDTA Free Acid | Amresco | 0322-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, by Life Technologies | 10437-028 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco, by Life Technologies | 21083-027 | |
| Opti-MEM | Gibco, by Life Technologies | ||
| HEPES | CellPURE by Fisher Scientific | BP2937-100 | |
| Effectene | Qiagen | 301425 | Transfection reagent |
| 25 mm coverglass | Fisher Scientific | 12-545-86 | |
| Corning cell culture treated flasks, 25 cm2 | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| Cell culture 6-well plate | Greiner Bio-One, by VWR | 82050-896 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M1 | Sigma Aldrich | F3040-5MG | |
| [D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO) | Sigma Aldrich | E7384-5MG | |
| Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit | Life Technologies | A20173 | |
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Imaris Image analysis software | BitPLane | http://www.bitplane.com/imaris/imaris, for automated analysis | |
| Nikon Eclipse Ti inverted microscope and required accessories including filter cubes and filters | Nikon | ||
| Nikon TIRF arm with required adapters for Nikon Eclipse Ti | Nikon | For adjusting angle of incidence | |
| iXon+ EMCCD camera and adapters | Andor |
References
- McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A Modular Design for the Clathrin- and Actin-Mediated Endocytosis Machinery. Cell. 123 (2), (2005).
- Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biology. 9 (3), (2011).
- Ungewickell, E., Branton, D.
- Bliek, A. M., Meyerowrtz, E. M. Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic. Nature. 351 (6325), (1991).
- Hinshaw, J. E., Schmid, S. L. Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding. Nature. 374 (6518), (1995).
- Merrifield, C. J., Perrais, D., Zenisek, D. Coupling between Clathrin-Coated-Pit Invagination, Cortactin Recruitment, and Membrane Scission Observed in Live Cells. Cell. 121 (4), 593-606 (2005).
- Grabs, D., Slepnev, V. I., et al. The SH3 domain of amphiphysin binds the proline-rich domain of dynamin at a single site that defines a new SH3 binding consensus sequence. The Journal of biological chemistry. 272 (20), 13419-13425 (1997).
- Tosoni, D., Puri, C., et al. TTP Specifically Regulates the Internalization of the Transferrin Receptor. Cell. 123 (5), 875-888 (2005).
- Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Cargo Regulates Clathrin-Coated Pit Dynamics. Cell. 127 (1), 113-124 (2006).
- Soohoo, A. L., Puthenveedu, M. A. Divergent modes for cargo-mediated control of clathrin-coated pit dynamics. Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1725-1734 (2013).
- Posor, Y., Eichhorn-Gruenig, M., et al. Spatiotemporal control of endocytosis by phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate. Nature. 10, (2013).
- Mettlen, M., Stoeber, M., Loerke, D., Antonescu, C. N., Danuser, G., Schmid, S. L. Endocytic accessory proteins are functionally distinguished by their differential effects on the maturation of clathrin-coated pits. Molecular Biology of the Cell. 20 (14), 3251-3260 (2009).
- Loerke, D., Mettlen, M., et al. Cargo and dynamin regulate clathrin-coated pit maturation. PLoS Biology. 7 (3), (2009).
- Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. The Journal of Cell Biology. 89 (1), 141-145 (1981).
- Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nature Cell Biology. 4 (9), 691-698 (2002).
- Ehrlich, M., Boll, W., et al. Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits. Cell. 118 (5), 591-605 (2004).
- Yarar, D., Waterman-Storer, C. M., Schmid, S. L. A dynamic actin cytoskeleton functions at multiple stages of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 16 (2), 964-975 (2005).
- Rappoport, J. Z., Kemal, S., Benmerah, A., Simon, S. M. Dynamics of clathrin and adaptor proteins during endocytosis. American journal of physiology. Cell physiology. 291 (5), (2006).
- Doyon, J. B., Zeitler, B., et al. Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells. Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).
- Hopp, T. P., Prickett, K. S., et al. A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification. Bio/Technology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Saffarian, S., Cocucci, E., Kirchhausen, T. Distinct Dynamics of Endocytic Clathrin-Coated Pits and Coated Plaques. PLoS Biology. 7 (9), (2009).
- Yudowski, G., Puthenveedu, M., Henry, A., von Zastrow, M. Cargo-Mediated Regulation of a Rapid Rab4-Dependent Recycling Pathway. Molecular Biology of the Cell. 1, 1-11 (2009).
- Batchelder, E. M., Yarar, D. Differential Requirements for Clathrin-dependent Endocytosis at Sites of Cell-Substrate Adhesion. Molecular Biology of the Cell. 21 (17), 3070-3079 (2010).
- Mattheyses, A. L., Atkinson, C. E., Simon, S. M. Imaging Single Endocytic Events Reveals Diversity in Clathrin, Dynamin and Vesicle Dynamics. Traffic. 12 (10), 1394-1406 (2011).
- Aguet, F., Antonescu, C. N., Mettlen, M., Schmid, S. L., Danuser, G. Advances in analysis of low signal-to-noise images link dynamin and AP2 to the functions of an endocytic checkpoint. Dev Cell. 26 (3), 279-291 (2013).
- Boucrot, E., Howes, M. T., Kirchhausen, T., Parton, R. G.
- Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics. 45, 273-297 (2011).
- Boch, J., Scholze, H., et al. Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type. III Effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).
