Introduction
Prosessen clathrin-mediert endocytose (CME) er avhengig av den uventede ankomsten av de mange komponentene i clathrin-mediert endocytic maskineri for å samle last og manipulere plasmamembranen inn i vesiklene 1-3. CME er initiert av membran deformeres og last-adapter proteiner som kommer sammen på begynnende områder av endocytose en. Disse proteinene rekruttere pelsen protein clathrin, som samler inn et bur-lignende struktur som danner clathrin-belagt pit (CCP) 4. Når KKP er riktig satt sammen til en sfærisk form, membran scission, primært gjennom handling av den store GTPase, dynamin, genererer frie clathrin-belagt vesikler (CCVs) 5,6. Denne internalisering utløser hurtig demontering av clathrin belegge, slik at komponentene som skal gjenbrukes etter flere runder av CME.
Oppdagelsen og karakterisering av proteiner involvert i CME har vært forankret i tradisjonell Biochemical, genetiske og mikroskopi teknikker 4-6,8. Disse analysene har belyst roller og interaksjonspunkter disse endocytiske komponenter. Selv om svært nyttig for å definere essensielle komponenter for menneskehandel maskiner, blir disse analysene svært begrenset i å fange den dynamiske oppførselen til CME komponenter eller konsentrasjon last. Dette er en kritisk begrensning, siden CME er drevet av koreografert montering av sett av protein moduler i definerte trinn, og fordi små endringer i dynamikken i endocytiske enkelte arrangementer kan ha store konsekvenser for kumulative endocytose. Videre viser nyere data at enkelt CCP kan variere både i sammensetning og i oppførsel, noe som tyder på at den fysiologiske reguleringen av denne prosessen er svært romlig og tidsmessig begrenset 9-14. Visualisere individuelle endocytiske hendelser, derfor er viktig å forstå hvorfor det er flere overflødige proteiner involvert i CME og hvordan disse proteinene kan kontrolleres by fysiologiske signaler å regulere last intern.
Her beskriver vi bruken av Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) å observere CME på nivået av dynamikken i enkelte CCP i levende celler. TIRFM er avhengig av forskjellen i brytningsindeks mellom glass dekkglass, og fluidmiljøet av celler 15,16. Ved magnetisering lys rettes mot cellene på mer enn den kritiske vinkel, det internt reflektert, og skaper en flyktig bølge som opprettholder et tynt felt av lys som strekker seg omtrent 100 nm over dekkglass. Dette sikrer at bare de fluorescerende molekyler innenfor dette smale feltet er spent. I praksis lar dette eksitasjon av fluorescerende molekyler på eller i nærheten av plasmamembranen, og minimerer fluorescens fra de indre deler av cellen. Dette gir en vesentlig høyere signal-til-støy-forhold, og z-aksen oppløsning for å visualisere hendelser på plasmamembranen, compared til mer brukte moduser som konvensjonell epifluorescence eller confocal fluorescens mikroskopi. Vi beskriver også, på et innledende og praktiske plan, til bruk av en vanlig bildeanalyse plattform analysere og kvantifisere enkle morfologiske egenskaper og dynamikken i individuelle cargo endocytiske arrangementer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Uttrykk av fluorescensmerket Tagged CME-komponenter i dyrkede celler
HEK293 celler er nyttig modell celler som har blitt brukt mye til å studere GPCR biologi og endocytose, og derfor brukes som modeller i denne protokollen. Bruk noen transfeksjon protokollen gir enhetlig uttrykk uten overekspresjon og lav cytotoksisitet.
- Håndtere alle cellekultur i et sterilt laminær hette. Fyll fire brønnene til en 12-brønns plate med 1 ml av Dulbeccos Modified Essential Media (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS). Fra en konfluent T25 kolbe HEK293 celler fortynnet 1:50, 1:25, 1:16, 1:10 henholdsvis i hver av de 4 brønnene.
- Alternativt frø cellene til en multi-brønn plate av ønsket størrelse, i henhold til produsentens instruksjoner. Seed 0,4 til 2 x 10 4 celler i en 12-brønns plate. Dyrke cellene over natten i et sterilt 37 ° C med 5% CO2 og 95% fuktighet.
MERK: Tatt i betraktning at veksten rates variere, avhengig av betingelsene og cellelinjer, kan det være å foretrekke å frø av flere brønner for å sikre ideell konfluens for transfeksjon neste dag eller muligheten for å utføre transfections i duplikat.
- Alternativt frø cellene til en multi-brønn plate av ønsket størrelse, i henhold til produsentens instruksjoner. Seed 0,4 til 2 x 10 4 celler i en 12-brønns plate. Dyrke cellene over natten i et sterilt 37 ° C med 5% CO2 og 95% fuktighet.
- Den neste morgen, velger en brønn som er ~ 70% sammenflytende etter transfeksjon (se figur 1B). Hvis ingen vel har nådd denne tilstanden, må du vente en annen dag.
MERK: 70% konfluens er ideell for HEK293 celler. Transfeksjon av celler som er mer sparsom resulterer i celledød og toksisitet. Transfeksjon over-konfluente celler resulterer i dårlig uttrykk. - Legg 60 pl buffer EC (fra transfeksjon kit), 400 ng av plasmider som koder for merket GPCR og / eller komponenter av clathrin maskiner, og 2,4 ul av Enhancer inn i 1,5 ml mikrosentrifuge-rør, som beskrevet i produsentens protokoll. Vortex i 2 sekunder for å sikre tilstrekkelig blanding, og spinne i en mikrosentrifuge ved 2000 xg i 2 sekunder for å samle opp væsken ved bunnen.
- Legg6 mL Effectene som beskrevet i produsentens protokoll. Vortex i 2 sek, og sentrifugering ved 2000 xg i 2 sekunder i en mikrofuge for å samle opp væsken ved bunnen. Vent i 20 minutter for å tillate dannelse av transfeksjon sammensatte miceller.
- Aspirer media fra brønnen for å bli tilført. Tilsett 0,8 ml DMEM med 10% FBS for å transfeksjon reagens blandingen og bland ved å pipettere opp og ned sakte for å redusere bryte micellene. Legg media og transfeksjon blandingen til brønnen meget langsomt fra siden. Legg eventuelle gjenværende transfeksjon blandingen fra mikrosentrifugerør til brønnen ved hjelp av en mikropipette.
MERK: Hvis du vil, legge til en ekstra 0,5 ml DMEM med 10% FBS til transfektert godt å gi cellene ekstra næring som resulterer i mildere transfeksjon og lavere forbigående uttrykk. - Retur cellene til 37 ° C inkubator i 5 timer.
- Aspirer medier som inneholder transfeksjon blanding. Skift ut med 1 ml DMEM med 10% FBS. Tillatcellene å vokse over natten.
- Den neste dagen, passere cellene til ubestrøket Dekk forhånd sterilisert ved autoklavering.
- Tilsett 0,5 ml av fosfatbufret saltvann (PBS) med 1 mM EDTA til hver brønn. Alternativt kan du bruke 0,5 ml 0,05% Trypsin-EDTA. La i kuvøse i 1 min.
- Plasser 3. runde, sterile 25 mm dekkglass i egne brønner på en seks-brønns plate. Fyll hver brønn med 2 ml av media. Skyv dekkglass ned til bunnen av brønnen for å forhindre celler fra å vokse på undersiden av dekkglasset.
- Manuelt agitere brønnen for å løfte av cellene fra bunnen av brønnen. Tilsett 1 ml DMEM med 10% FBS for å resuspendere. Fordel løftet celler fra en brønn i en 12-brønns plate jevnt blant de tre dekkglass. Alternativt Plate celler på 3 glassbunn retter.
- Tillater cellene å vokse på dekkglass i minst 48 timer før avbilding. Sørg for at cellene er spredt ut og flat.
2.Imaging CCP og Cargo Dynamics Bruke TIRFM
- Konjugatvaksine M1 Anti-Flag antistoffer med Alexa fargestoffer ved hjelp av Alexa Fluor Protein Merking sett i henhold til fabrikantens protokollen. Alternativt kan pre-konjugerte antistoffer som skal kjøpes.
- Pre-inkubere celler med antistoffer ved en 1: 1000 fortynning i 1 ml forvarmet Leibovitz medium med 10% FBS, eller i Opti-MEM med 50 mM HEPES pH 7,4 og 10% FBS i 10 minutter ved 37 ° C (avbildning medium), å merke FLAG-merket GPCR på celleoverflaten. Hoppe over disse trinnene hvis genetisk kodet fluorescerende proteiner, slik som GFP, blir brukt som koder (se diskusjon for detaljer).
- Overfør dekkglass til en live-cell imaging kammeret. Alternativt, for glass-bunn retter, aspirer antistoff-merking media og tilsett 700 mL av forvarmet bildebehandling medium.
- Bruk en pinsett og bøyes tuppen av en 25 gauge nål i en krok.
- Hold en pinsett i den dominerende hånden. Hold bøyd nål i otheh. Snu nålen helt kroken kurver ned mot glasset. Dra forsiktig nålen, krok side ned, over bunnen av en 6-brønns plate før den låses fast dekkglass. Vær nøye med å ikke lage riper i overflaten av dekkglass, som det vil løsne cellene. Løft forsiktig dekkglass opp fra bunnen av brønnen. Balansere dekk mot veggen i brønnen for støtte.
- Bruk pinsett til å gripe nær kanten av dekkglass og flytte dekk celle siden opp til bildekammeret, og montere kammeret. Legg 700 mL (eller passende mengde) av forvarmet bildebehandling medium. Håndter Dekk forsiktig uten press for å hindre cracking eller bryte.
- Overfør kammeret på mikroskopet og holde temperaturen av cellene ved 37 ° C ved hjelp av en fase-ovn eller en lukket kuvøse.
- Ta med celler i fokus med en 100X eller 60x TIRF olje-immersion objektiv (1,45 NA eller nyere). Bilde cellene i konvensjonell epifluorescence eller confokale måter belysning (dvs. ikke TIRFM) for å identifisere celler som uttrykker de aktuelle konstruksjoner. Ut-av-fokus-celler er nesten usynlig i den tynne dybden av TIRF belysning gjør det vanskelig å finne fokalplanet og celler.
MERK: Noen systemer bruker de samme lasere for TIRFM til bildet i konvensjonelle epifluorescence, ved å bevege innfallsvinkelen av laseren over den kritiske vinkel. Som en viktig sikkerhetsforanstaltning, alltid være klar over vinkelen på laserstrålen, og alltid lede det bort fra observatøren. - Fokus ned til den nederste overflaten av en celle som uttrykker inntil omrisset av plasmamembranen rundt cellen forsvinner og sentrum av cellen vises. Dette er mest tydelig med en plasma-membran lokalisert last protein slik som μ-opioid-reseptor (se figur 2A).
- Bytt til TIRF imaging.
- Ved anvendelse av de samme lasere for avbildning i konvensjonell epifluorescence, øker innfallsvinkelen avlaser til ut-av-fokus fluorescens i det indre av cellen forsvinner, og ingen omrisset av plasmamembran rundt cellen er sett. (Sammenlign figur 2C til figurene 2A og 2B)
MERK: I TIRFM, beveger fokalplanet bevirker at bildet for å gå helt ut av fokus og / eller svak, og de samlede fluorescens nivåene avtar på grunn av den mindre dybde av belysning. Derfor, til en alternativ metode for å bytte til TIRFM belysning er først å fokusere på midten av cellen i konfokal / konvensjonell epifluorescence, og deretter øker innfallsvinkelen til du taper det meste av fluorescens, og fokus ned til plasmamembranen deretter. - En gang i TIRFM, sikre eksitasjon laser reflekterer tilbake gjennom objektiv og er ikke synlig over mål. Bekreft dette ved å sjekke om laserpunktet er synlig.
MERK: I konvensjonelle epifluorescence eller konfokale moduser, er laser belysning synlig over mål,for eksempel på taket. - Avgrense fokus for å få et skarpt bilde. De viktigste komponentene i endocytic maskiner, slik som clathrin, vil være synlig i puncta. Juster fokus på fine, så puncta er så runde som mulig.
MERK: For membran lokalisert last, justere fin fokus til filopodia vises tydelig. - Bruk en anskaffelsesprogram for å lagre alle bildeparametre som speil og TIRF vinkel. Gjør dette for alle nødvendige bølgelengder.
- Ved anvendelse av de samme lasere for avbildning i konvensjonell epifluorescence, øker innfallsvinkelen avlaser til ut-av-fokus fluorescens i det indre av cellen forsvinner, og ingen omrisset av plasmamembran rundt cellen er sett. (Sammenlign figur 2C til figurene 2A og 2B)
- Scan rundt dekkglass for å finne celler som uttrykker alle ønskede endocytiske markører: den μ-opioid-reseptoren og adapter β-arrestin i eksempelet vist i figur 3A. Velg celler som uttrykker, men ikke over-uttrykke. Se diskusjonen for detaljer.
- Når cellene er identifisert, hente bilder hver 3 sek i 10 min. Dette er tilstrekkelig til å fange levetiden til en CCP, siden den gjennomsnittlige levetiden for en CCP i HEK293 celler fotografert under disse forholdene er around 40 sek 10-11. Dette gjør at om 12-14 rammer for å observere KKP. For eksempel se Movie 1. Gjenta alle skritt for å bilde flere celler.
3. Analyse av endocytic Dynamics ved manuell verifisering
Selv om en manuell verifisering av CCP liv er sterkt begrenset av antall CCP som kan oppdages, er det fortsatt fortsatt en nøyaktig metode for påvisning uanfektet av globale endringer i bildet og gjenkjenning gjenstander. Se diskusjonen for detaljer.
- Åpne filen i ImageJ. Bildene er lagret som en enkelt stabel av tiff-filer med interfolierte kanaler. Konvertere bilder til hyperstacks. Gå til Image> Hyperstacks> Stack til Hyperstack. Oppgi antall kanaler anskaffet (dvs. hvis bilde β-arrestin og μ-opioid reseptor, skriv 2), inn 1 for Z-stakken (TIRFM er en enkelt plan), og antall bilder fra filmen (dvs. en 10 min film på en ramme hver 3 sek is 200) i pop-up vindu.
- Den hyperstack format gir et vindu med to rullefelt. Bruk den øverste linjen for å gå gjennom kanalene og bunnen for å flytte gjennom tiden. Bla til kanalen av proteinet som har levetid vil bli analysert.
- Flytt til ramme 10 eller 15 av filmen for å redusere inkludering av pre-eksisterende CCP som har hele varigheten ikke er synlige. Tegn en ROI-boksen rundt en flekk valgt tilfeldig.
- Tell antall rammer en flekk er synlig.
MERK: Se Figur 3B og 3C for eksempler på tre morfologiske kategorier av endocytiske hendelser 10,11,16-19.
4. Analyse av endocytic Dynamics av Objective Recognition
Mål gjenkjenning kan deteksjon av praktisk talt alle de avbildes CCP i en celle, men kan være utsatt for feil på grunn av falsk deteksjon av feilaktige strukturer. Se diskusjonen for detaljer som veier fordeler og ulemper ved each metode. Flere programmer, blant annet spesialbygde algoritmer, kan brukes til å objektivt påvise CCP. Denne protokollen beskriver objektiv anerkjennelse av CCP bruker Imaris, et bilde-analyse programvare (se Materialer).
- Til å begynne, åpner Raw-bildefil i bildeanalyse programvare. Som standard vises et fusjonert fargebilde. Bruk "Display Justering" vinduet for å justere lysstyrken på en kanal. Klikk på navnet til en kanal for å endre den viste fargen. Fjern merkingen ved siden av kanalen for å hindre det som vises (se figur 4A).
- Lag "Spots" ved å klikke på ikonet med oransje flekker. Se figur 4B. Velg et område av interesse (ROI) rundt cellen. Se figur 4C. Bruk en ROI å ekskludere områder som feilaktig vil oppdage lyse kanter og plaketter. Analysere flere celler med forskjellige uttrykk nivåer separat.
- Mål diameteren på en Spot til provide første estimatene for algoritmen. Bytte til "Slice"-modus, og klikk på polare endene av et sted å måle diameter. Se figur 4E. Gjøre dette for 4 eller 5 runde flekker som ser indikasjon på en CCP på høyden av dets stabilitet, etter dannelse og før spalting. Bruk disse målinger for å beregne gjennomsnittlig diameter ned til nærmeste tiendedels mikron.
- Oppdage Spots. Gå tilbake til "overgå" modus. Velg riktig kanal for deteksjon. Oppgi gjennomsnittlig målte diameter, vanligvis 0,3 eller 0,4 mikrometer. Klikk på den blå pil frem for å kvantifisere Spots. Se figur 4E. Hvis diameteren av flekker er undervurdert, vil falske punkter av fluorescens bli identifisert som flekker. Hvis diameteren er for stor, vil det sanne Spots bli ignorert. Når usikker, anslår litt lavere, og filtrere ut de uriktige påvisninger senere.
- Filtrere Spots av kvalitet. Juster filter å fange så mange flekker som mulig uten ryggbakken. Kvalitets filter er valgt som standard 20. Se figur 4F.
- Bruk "Kvalitet" kurve som en guide for å sette en passende terskel. Flytt bunnen terskelen av filteret med venstre museknapp på denne første dukkert i kurven. Dette er et godt utgangspunkt for filteret, som denne stillingen foredler vanligvis gjenkjenning for å bare synlige flekker. Se figur 4F.
- Oppdaget flekker på filmen som kuler eller senter piksler. Bruke "Colors" fanen, justere fargen på Spots til en kontrastfarge for å gjøre det lettere å se dem. Bla gjennom filmen for å gjennomgå Spots i hver ramme. Målet er å oppdage så mange flekker som mulig for helheten av deres levetid.
- Eliminer dimmer Spots eller manuelt koble dem inn i kontinuerlige spor senere, da de ikke blir oppdaget godt gjennom i løpet av sin levetid.
- Fjern lyse plaketter med en "intensitet" filter, om nødvendig. Klikk på det grønne plusstegnet for å legge til et nytt filter. Se figur 4F. Lag en Intensitet filter for å filtrere inn eller ut Flekker av en gitt fluorescens signaler. Bruk det genererte Intensitet kurve, (analogt til Quality Curve diskutert i 4.5) for å sette terskelen. Bruk venstre museknapp for å fjerne den ekstreme venstre enden av kurven som representerer de lyseste Spots.
MERK: Store plakett strukturer er vanligvis blant de skarpeste elementene i cellen, og de er lett ekskludert med dette filteret. - Bla gjennom filmen for å sikre at CCP oppdages så Spots og de skarp plaketter er ikke lenger registreres. Figur 3D viser en celle hvor påvisning av CCP (merket med hvite kuler) ble optimalisert med kvaliteten filter og plaketter ble ekskludert med kvaliteten filter.
- Reduser lyse celle kantene med kvaliteten filteret. Lyse objekter kan fortsatt må fjernes manuelt, på neste trinn. Fortsett med det blåarrow.
- Fjern avvikende flekker i Rediger Spots skjermen. Bytte til "Select"-modus. Klikk på stedet. Det blir gul. Klikk "Slett". Klikk på den blå pilen for å fortsette å bygge algoritmen. Se Figur 4G.
- Mål spor. Sett spor til "Brownske bevegelser." KKP bør ikke viser noen rettet bevegelse, bare minimal drivende over plasmamembranen. Denne algoritmen er mest hensiktsmessig for at bevegelse. Se figur 4H.
- Sett Maks distanse til en liten verdi, for eksempel 0,7 mikrometer. Se figur 4H.
MERK: Å sette en liten avstand minimerer tilkobling av tilstøtende Spots og fortsatt gjør for fortsatt sporing av en celle stedet gjennom CCP eller celle bevegelse. - Sett Max Gap Størrelse til 1. Dette gir et spor for å fortsette hvis det bare er ett bilde mangler på rad. Klikk på den blå pilen for å beregne spor. Se figur 4H.
MERK: Gap størrelser av mer enn tre årsaker ulike spor for å være feil knyttet sammen. - Pensen visning til "Dragon Tail." Bla gjennom filmen observere påvisning kvalitet. Hvis tilstøtende Spots blir tilkoblet, redusere Maks distanse under 0,7 mikrometer. Hvis Spots blir brutt opp altfor lett, øke Max Gap størrelse. Klikk på den blå pilen for å lage spor. Dette fører til filter spor skjermen. Se figur 4H.
- Sett Maks distanse til en liten verdi, for eksempel 0,7 mikrometer. Se figur 4H.
- Filtrer Tracks og eksportere data. Bruk en "Intensitet" filter for å fjerne flere lyse plakk. Bruk en "Displacement" filter for å fjerne endosomes som kommer inn i TIRF feltet. Vær forsiktig, som lengre Spots vil ha lengre forskyvninger i tillegg. Klikk på den grønne dobbeltpilen for å fullføre protokollen. Se figur 4I.
- Bruk kategorien Rediger Tracks, med blyantikonet, å fjerne falske positive påvisninger låter som ikke kunne fjernes av filtre. Sjekk for discontinuities eller falske tilkoblinger. Slik kobler du to spor, velg dem ved hjelp av Ctrl-venstre-klikk, klikk deretter på "Koble til" i redigerings Tracks boksen. Slik kobler spor i separate flekker, velge et spor og trykk "Disconnect". Velge flere flekker med Ctrl + Venstre-klikk og klikk "Connect" for å opprette et nytt spor. Fremgangsmåten er den samme for redigering flekker, som er beskrevet i 4.5.7. Se figur 4J.
- Å eksportere data, gå til fanen statistikk. Klikk på én diskett ikonet for å eksportere den valgte statistikken. Klikk på ikonet som ser ut som en serie av disketter å eksportere alle statistikk. Den "Track Varighet" statistikk inneholder lengden av de endocytiske spor. Se figur 4K.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av levende celler TIRF Mikros vi har spilt de endocytiske dynamikken i μ-opioid-reseptoren (MOR), en G-protein koblet reseptor (GPCR) og dens endocytic adapter protein β-arrestin. Den β-arrestin konstrukt ble forbigående transfektert inn i et stabilt uttrykte MOR cellelinje ved bruk av protokollen som er beskrevet i figur 1, og avbildes 96 timer senere. Den MOR i stabil cellelinje som er N-terminalt merket med et pH-følsomt GFP. Det fluorescerende protein bare fluorescerer i nøytral ekstracellulær væske. Også bare MOR endocytoses når aktivert av en agonist, og forblir på annen måte jevnt fordelt over plasmamembranen. Med fokus på den heft plasma membranen som sitter på cover-glass i konfokale modus resultater i en celle som er fylt på med en dim fluorescens. Dette er forskjellig fra et fokus på midten av cellen, hvor den plasma-membranen er bare sees på som en ring av fluorescens rundt cellen. Sammenligne venstreog høyre panel i figur 2A. Bytte til konvensjonell epifluorescence eller TIRF med en ukorrekt vinkel fører ut av fokus fluorescens å bli tydelig i de samme celler som vist i Figur 2B. Når TIRF vinkelen er riktig plasmamembranen er svært skarp, klar og lyssterk og ut av fokus fluorescens ikke lenger forstyrrer bildet. Sammenlign figur 2C til figurene 2A og 2B.
Bildet er klart og skarpt fordi MOR er på den vedheftende plasmamembranen, som er stort sett innenfor TIRF feltet. I motsetning til dette forblir β-arrestin i en cytosoliske bassenget når ennå ikke er rekruttert til endocytic puncta, og synes tåkete og ute av fokus, fordi det ikke er i TIRF feltet. Når MOR aktiveres av en agonist, blir β-arrestin rekruttert til plasmamembranen, og begge β-arrestin og reseptoren redistribuere til CCP (figur 3A og en film , Er β-arrestin i grønt, MOR i rødt, overlay gul).
De levetid av disse klynger kan kvantifiseres manuelt ved hjelp av de tre parametre for fullført endocytose som vist i figur 3B. Flekkene betegner CCP kan enten forsvinne helt (se også figur 3C), "blinke" på og av eller "knipe av" en større struktur. De to sistnevnte forholdene representerer hendelser som er romlig altfor tett sammen for å løses som separate hendelser. Den Sted algoritme Imaris er også nyttig for å kvantifisere CCP, som skissert i figur 4. Figur 3D betegner CCP detektert ved hjelp Imaris, etter filtrering for å fjerne ikke-dynamiske plakkdannende strukturer. Kledde hvite kuler betegne oppdaget flekker. Dimmer flekker som ikke kunne påvises for hele sin levetid ble også ekskludert med "Kvalitet" filter.
">
Figur 1: Flytdiagram av Transfection Prosedyre. (A) For det første frø forskjellige fortynninger (1:50, 1:25, 1:16, 1:10) på en 12-brønns plate. Tillate celler til å vokse over natten. Neste dag, se etter en brønn som er ca 70% konfluent, og jevnt fordelt, som avbildet. Dette er vel som vil bli transfektert. (B) til 60 ul av EC-buffer og 400 ng av DNA i et mikrosentrifugerør. Vortex i 10 sek, og spinne væsken til bunnen av røret. Legg 2,4 mL av Enhancer. Vortex i 2 sekunder og spinne væsken til bunnen av røret. Inkuber ved romtemperatur i 3 min. Legg 6 mL av Effectene. Vortex i 2 sekunder og spinne væsken til bunnen av røret. Inkuber ved romtemperatur i 20 min. (C) sakte bland 0,8 ml DMEM med 10% FBS med transfeksjon. Legg til celler i tidligere valgt godt. Inkuber cellene i 5 t ved 37 ° C. Erstatt med friskDMEM med 10% FBS.
Figur 2: Finne TIRFM feltet. (A) Den plasmamembranen avbildes i konfokal. Det venstre panelet viser celler i konfokal med fokus på midten av cellen. Plasmamembranen kun ses på som en "ring" rundt cellen. Fokusering ned til basal plasmamembranen, ved siden av dekk bevirker at cellen som skal fylles ut med en svak fluorescens. Plasmamembranen "ring" bør ikke være synlig i tynnere TIRF feltet. (B) Den basal plasma membran med en grunnere TIRF vinkel produsere konvensjonell epifluorescence belysning gjennom prøven. Dette belyser hele cellen, og mye ute av fokus fluorescens fra toppen av cellen er tilstede. (C) Den plasmamembranen i TIRF. Med fokus på filopodia bidrar til å finne dette flyet. Legg merke til at den eren jevn enkelt plan. Scale barer er 10 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Visualisering og kvantifisere endocytic hendelser i TIRF. (A) En celle som uttrykker μ-opioid-reseptor (MOR) og β-arrestin før og etter tilsetning av en agonist som induserer endocytose. Den agonist fører omfordeling av både proteiner til endocytic puncta. Scale bar er 10 mikrometer. (B) Tre typer endocytiske hendelser, sett ved å visualisere arrestin dynamikk, i samsvar med tidligere beskrevet morfologi. "Steady", en stødig signal som raskt forsvinner. Dette er den viktigste typen, noe som indikerer at KKP har blomstret og forlot TIRF feltet. "Blink", et signal som blinker til et lavere signal og dukker opp igjen på samme sted på grunn av monteringen av et sekund CCP på samme sted. "Knip av", en rørformet projeksjon kommer av et sted, når to CCP er for nær hverandre for å bli løst så distinkte flekker, og en er gjennom endocytose. Boksen er 2 x 2 mikrometer. (C) Visualisering clathrin endocytose av MOR ved enkelthendelse oppløsning. To eksempler som representerer de store brøkdel av MOR endocytiske hendelser vises. Rammer er hver 3 sek. Boksen er 2 x 2 mikrometer. (D) Påvisning av individuelle endocytiske hendelser ved hjelp Imaris. Hvite kuler betegne CCP oppdaget som Spots. Spot deteksjon ble optimalisert ved hjelp av en "Kvalitet" filter. Dimmer flekker som ikke kunne påvises for helheten av sin levetid ble også ekskludert med kvaliteten filter. Store plaque strukturer som er vist som å være ubemerket ble utelatt ved bruk av en "intensitet"-filter.ig3large.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Mål Anerkjennelse av dynamikken i endocytic hendelser ved hjelp Imaris. (A) Skjermjusteringsvinduet, brukes til å justere visningen av bildet som beskrevet i trinn 4.1. (B) Åpne "Spots" algoritme byggmester. Byggherre vises i vinduet under. (C) Det første trinnet i Spots algoritmen byggmester. Sjekk "Track Spots (over tid)." Check "Segment bare et område av interesse," hvis nødvendig. (D) ROI valgskjermen. Se trinn 4.2 for detaljer. (E) De mange vinduene for å definere diameteren på en målt Spot. Paneler representerer: bytte fra overgå til Slice modus ved hjelp av Navisøkelsen Bar på toppen, klikke på de polare endene av et sted, hvor den målte diameter vises, vanligvis på høyre side, hvor du skal legge inn den målte diameter. Se trinn 04.03 til 04.04. (F) Spot Kvalitet filteret beskrevet i 4.5-4.5.3. (G) Edit flekker vindus beskrevet i 4.5.7. (H) Mål spor og Se spor vinduer, som er beskrevet i 4.6. (I) Filtrer Tracks vindu beskrevet i 4.7. (J) Edit sporer vindu beskrevet i 4.7.1. (K) Lagre data skjermen beskrevet i 4.7.2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Movie 1 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi bruken av TIRFM å visualisere clathrin-mediert endocytose (CME) på nivået av individuelle CCP i levende celler i sanntid. CME er en rask og svært dynamisk hendelse mediert av den kumulative effekten av mange romlig og tidsmessig atskilte enkelthendelser. De fleste analyser som for tiden brukes, for eksempel biokjemiske målinger av internalisering ved bruk av overflate biotinylering eller ligand-bindende, flow-cytometri eller faste celler forsøk som måler mengden av internaliserte proteiner, eller elektron-mikroskopisk lokalisering av proteiner, ensemble overvåke endringer i protein lokalisering til fastsatte tidspunkter . Disse eksisterende metoder har vært svært nyttig for å identifisere proteiner som er nødvendige for CME, men mangler romlig og tidsmessig oppløsning som matcher de fysiologiske skalaer av CME eller andre dynamiske membran trafficking prosesser. Dette er viktig, ettersom nyere bevis tyder på at CCP er heterogen i sin protein sammensetning og dynamikk 9-12, og som CME er sannsynlig hurtig reguleres på en romlig atskilt måte. Levende celle TIRFM gir evnen til å analysere CME på nivået av romlig separert enkelt CCP, i sanntid, i levende celler.
Vellykket anvendelse av denne kraftige analysen er avhengig av to hovedfaktorer: god helse av cellene og grundig analyse av parameterne for CME. For den tidligere, riktig uttrykk for tagget proteiner og mikroskopi teknikker minimere fototoksisitet er kritiske. Cellelinjer stabilt-uttrykke proteiner av interesse er ideelt, da uttrykket nivåer kan måles pålitelig. Vi tagge reseptorer med enten N-terminal Flag epitop eller SPH koder 21-25. Selv om ikke strengt nødvendig, både merkeordninger rette TIRFM av CME fordi reseptorer selektivt kan oppdages på plasmamembranen ved starten av forsøket. De ønskede endocytiske ytterligere komponenter kan også være forbigående transfektert inn i disse stabile cellelinjer. Den transfection protokollen bemerket her er optimalisert for bildebehandling CME hjelp TIRFM. Først er det tilpasset for selv og moderate nivåer av ekspresjon. Dårlig uttrykk nødvendiggjør høyere laser makt for deteksjon og øker risikoen for både fototoksisitet og fotobleking. Videre, siden denne analysen registrerer forsvinningen av puncta som internalisert CCP, lave signaler og fotobleking er skadelig også til analyse. Vi foreslår at under disse omstendigheter, er den totale varighet og / eller frekvensen for avbildning reduseres. For det andre, kort inkubasjon av transfeksjon reagenser på cellene, intervallet mellom transfeksjon og eksperimentet, og den friske passasje av transfekterte celler til dekk før avbildning, alt sørge for at de avbildes cellene er i optimal helse. Tredje, sikrer dette at flertallet av clathrin strukturer er CCP, og ikke flate ark med clathrin eller clathrin plakk. Fjerde, minimerer denne protokollen overuttrykk av transfekterte CME komponenter, som har vært showetn å endre CME dynamikk 20,26.
For avbildning med lav fototoksisitet, er det viktig å optimere avbildningssystem for optimal oppløsning og maksimal følsomhet. Forstørrelsen av objektiv og detektoren størrelse kameraet bør matches for å minimere under-eller oversampling og tom forstørrelse. En høy numerisk apertur (1.45 eller nyere) TIRF objektiv bør brukes til å samle maksimal lys mulig. Vi hente bilder med et elektron-multiplisere charge coupled device kamera for høy quantum effektivitet, tider lave eksponerings og rask avlesning hastigheter. I tillegg, for å sikre helsen av cellene, blir de avbildes i Leibovitz medier, som er bufret uavhengig av CO2, og er supplert med 10% FBS, i en fullt lukket kammer satt til 37 ° C. Fordi TIRFM er svært følsom og de høye numerisk apertur målene brukes kan oppdage selv minimal lys ambient, er det avgjørende å skape et lukket bildebehandlingsmiljøet gratisfra eksternt lys og vibrasjoner som kan forstyrre den fine fokusplanet.
Det er viktig å merke seg at de absolutte levetid og dynamikken i de fleste komponenter av CME variere sterkt avhengig av celletyper, uttrykk nivåer av proteiner, temperatur, dager etter plettering, og andre variasjoner i dyrkningsbetingelser 7,10,14,17,20, 25,27. Dette gjenspeiles i de enorme variasjoner i tidsbruken og fordelinger observeres mellom ulike grupper som bruker denne teknikken, en klar begrensning av denne analysen. Videre er det mulig at CCP på den nederste overflaten av cellen, avbildes i TIRFM, oppfører seg forskjellig fra toppoverflaten 23,25. Mens det er diskutabelt om hvilken overflaten nøyaktig representerer en "typiske" celle omgitt av ekstracellulære matrise komponenter i en vev, tolkninger av KKP dynamikk sett av denne teknikken må vurdere dette potensialforskjell. Den virkelige styrke av analysen, ligger derfor i å sammenligne endringer i dynamics av CCP, i de samme cellene under identiske kultur forhold, etter akutte manipulasjoner, inkludert gruppering av laste molekyler som GPCRs i respons på aktivering. Denne sammenlikning tillater normalisering av de forandringer i den samme celle, for derved å kontrollere for alle parametrene som er nevnt ovenfor som kan fremkalle variasjoner i CCP oppførsel.
Vi bruker vanligvis både manuelle og automatiserte analyser, som er beskrevet ovenfor, for å analysere varigheten av endocytiske hendelser: manuell verifisering og objektiv anerkjennelse bruker Imaris bildeanalyse programvare. Manuell verifisering er arbeids-og tidskrevende, da det er begrenset av antall CCP en bruker kan telle, men det er uten tvil den mest nøyaktige teknikk tilgjengelig. En trenet menneskelige øye kan lett fortsette å spore en CCP gjennom celle bevegelse, og endringer i form eller fokus, nøyaktig unntatt plaketter og defekte piksler. Den kan også detektere morfologiske endringer i KKP indikasjon på fullført events, som er vist figur 3B og 3C. Det er absolutt nødvendig, men at analysen forblir objektiv som mulig innenfor disse begrensninger. Dette krever definisjonen av spesifikke kriterier som brukes konsekvent på tvers av alle datasett. I tillegg har vi vanligvis analysere bilder i en dobbel-blind måte, hvor de bilde yr.no er kryptert slik at forholdene fortsatt ukjent for personen å analysere bildene. Automatisert deteksjon, f.eks ved hjelp av "flekker" og "Track Varighet" algoritmer i Imaris, kan brukes til å påvise de fleste av de endocytiske flekker i en gitt film, å generere et høyt prøvenummer. Mens mange alternativer, inkludert svært komplekse skreddersydde algoritmer 3,14,23,26,27, blir generert, til påliteligheten av disse metodene detektere riktig endocytiske hendelser samtidig unngå falsk deteksjon er fortsatt den største bekymringen. For eksempel, i Imaris, celle bevegelse skape lyse forkanter, plaques, og ut avfokusrammer kan lett kaste av spot-algoritme, som det har en tendens til å oppdage lyse strukturer som blir komponert helt av flekker. For å hindre at disse flekker fra å bli koblet inn i et spor, må de alle skal fjernes. Enkeltavvikende flekker som ikke er i store strukturer som plakk kan fjernes med Rediger Spots kategorien, mens Spots koblet kan fjernes senere ved hjelp av fanen Rediger Tracks. De avvikende flekker kan også fjernes med egendefinerte filtre. For eksempel, figur 3D viser et intensitets filter som brukes til å begrense unngå å inkludere plakk i CCP deteksjon. Kvalitets filter er en annen svært nyttig filter for å slette feilaktige flekker. "Quality" er en kumulativ måling av lysstyrke og formen funnet ved å ta fluorescens intensiteten av flekken og gaussisk filtrering etter ¾ av lengden av radius 20.. Quality Kurven er funnet under de valgte filtre. Den avbilder antall flekker (y) detektertNår kvaliteten er en viss verdi (x). Jo lavere kvalitet, jo flere flekker detekteres. Hvis kvaliteten filteret er for lav, vil flekker detekteres, hvor det ikke er noen synlig fluorescens omvendt, hvis kvaliteten filteret er for høy, bare de lyseste stedene vil bli oppdaget. Følg langs kurven mot større verdier (x); antall plasser oppdaget (y) vil typisk falle dramatisk. Beveg bunnterskelen til dette punktet. Dette er det laveste punkt for å plassere den nederste terskelverdi. Andre store bidragsytere til falske flekker i TIRF feltet er endosomes som flytter til periferien av cellen og inn i TIRF feltet. En robust kriterium for fjerning av disse er mobiliteten av flekker, dvs. forskyvningen av flekker over tid. CCP bevege seg svært lite, med mindre som en del av bevegelsen av hele cellen, mens endosomer oppviser hurtig brownsk eller rettet bevegelse. Nyere algoritmer, mens betydelig forbedret, fortsatt blir raffinert og optimalisert 3,14,23,26,27. Som disse møttehods blitt mer sofistikerte og pålitelig, kan vi analysere hundrevis eller tusenvis av flekker, uten å kontrollere dem manuelt ved hvert punkt. Foreløpig er imidlertid, foreslår vi at disse to analysene brukes sammen for å utfylle hverandre for nøyaktighet.
Protokollen vi har beskrevet kan enkelt tilpasses til å svare på mange spørsmål angående last endocytose. Den kan brukes til å utføre enkle co-lokalisering av last med CME-komponenter, og som brukes til å vise forandringer på bestemte komponenter av endocytic maskiner på grunn av spesielle stimuli. Målingen kan også lett tilpasses til en hvilken som helst endocytic prosessen, for eksempel caveolae 28, som viser diskrete konsentrasjoner av last og belegge komponentene, og til studiet av disse grunnleggende prosesser i spesialiserte celletyper. I fremtiden, som genom redigering blir mer mainstream 20,29,30, forventer vi at det vil bli den foretrukne metoden for merking av komponenter, og at dynamikk og atferd of ulike komponenter blir forbedret ytterligere. Tatt i betraktning at vår forståelse av cellulære prosesser stor grad har vært drevet av identifisering av gener, protein modifikasjoner og interactomes, analysen vi beskrevet her representerer en av de neste grensene av henvendelsen, nemlig. definisjonen av tid og rom dynamikken i disse prosesser og mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/High Glucose with L-glutamine and sodium pyruvate | Fisher Scientific | SH3024301 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco, by Life Technologies | 21600-010 | |
| EDTA Free Acid | Amresco | 0322-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, by Life Technologies | 10437-028 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco, by Life Technologies | 21083-027 | |
| Opti-MEM | Gibco, by Life Technologies | ||
| HEPES | CellPURE by Fisher Scientific | BP2937-100 | |
| Effectene | Qiagen | 301425 | Transfection reagent |
| 25 mm coverglass | Fisher Scientific | 12-545-86 | |
| Corning cell culture treated flasks, 25 cm2 | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| Cell culture 6-well plate | Greiner Bio-One, by VWR | 82050-896 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M1 | Sigma Aldrich | F3040-5MG | |
| [D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO) | Sigma Aldrich | E7384-5MG | |
| Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit | Life Technologies | A20173 | |
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Imaris Image analysis software | BitPLane | http://www.bitplane.com/imaris/imaris, for automated analysis | |
| Nikon Eclipse Ti inverted microscope and required accessories including filter cubes and filters | Nikon | ||
| Nikon TIRF arm with required adapters for Nikon Eclipse Ti | Nikon | For adjusting angle of incidence | |
| iXon+ EMCCD camera and adapters | Andor |
References
- McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A Modular Design for the Clathrin- and Actin-Mediated Endocytosis Machinery. Cell. 123 (2), (2005).
- Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biology. 9 (3), (2011).
- Ungewickell, E., Branton, D.
- Bliek, A. M., Meyerowrtz, E. M. Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic. Nature. 351 (6325), (1991).
- Hinshaw, J. E., Schmid, S. L. Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding. Nature. 374 (6518), (1995).
- Merrifield, C. J., Perrais, D., Zenisek, D. Coupling between Clathrin-Coated-Pit Invagination, Cortactin Recruitment, and Membrane Scission Observed in Live Cells. Cell. 121 (4), 593-606 (2005).
- Grabs, D., Slepnev, V. I., et al. The SH3 domain of amphiphysin binds the proline-rich domain of dynamin at a single site that defines a new SH3 binding consensus sequence. The Journal of biological chemistry. 272 (20), 13419-13425 (1997).
- Tosoni, D., Puri, C., et al. TTP Specifically Regulates the Internalization of the Transferrin Receptor. Cell. 123 (5), 875-888 (2005).
- Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Cargo Regulates Clathrin-Coated Pit Dynamics. Cell. 127 (1), 113-124 (2006).
- Soohoo, A. L., Puthenveedu, M. A. Divergent modes for cargo-mediated control of clathrin-coated pit dynamics. Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1725-1734 (2013).
- Posor, Y., Eichhorn-Gruenig, M., et al. Spatiotemporal control of endocytosis by phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate. Nature. 10, (2013).
- Mettlen, M., Stoeber, M., Loerke, D., Antonescu, C. N., Danuser, G., Schmid, S. L. Endocytic accessory proteins are functionally distinguished by their differential effects on the maturation of clathrin-coated pits. Molecular Biology of the Cell. 20 (14), 3251-3260 (2009).
- Loerke, D., Mettlen, M., et al. Cargo and dynamin regulate clathrin-coated pit maturation. PLoS Biology. 7 (3), (2009).
- Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. The Journal of Cell Biology. 89 (1), 141-145 (1981).
- Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nature Cell Biology. 4 (9), 691-698 (2002).
- Ehrlich, M., Boll, W., et al. Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits. Cell. 118 (5), 591-605 (2004).
- Yarar, D., Waterman-Storer, C. M., Schmid, S. L. A dynamic actin cytoskeleton functions at multiple stages of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 16 (2), 964-975 (2005).
- Rappoport, J. Z., Kemal, S., Benmerah, A., Simon, S. M. Dynamics of clathrin and adaptor proteins during endocytosis. American journal of physiology. Cell physiology. 291 (5), (2006).
- Doyon, J. B., Zeitler, B., et al. Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells. Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).
- Hopp, T. P., Prickett, K. S., et al. A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification. Bio/Technology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Saffarian, S., Cocucci, E., Kirchhausen, T. Distinct Dynamics of Endocytic Clathrin-Coated Pits and Coated Plaques. PLoS Biology. 7 (9), (2009).
- Yudowski, G., Puthenveedu, M., Henry, A., von Zastrow, M. Cargo-Mediated Regulation of a Rapid Rab4-Dependent Recycling Pathway. Molecular Biology of the Cell. 1, 1-11 (2009).
- Batchelder, E. M., Yarar, D. Differential Requirements for Clathrin-dependent Endocytosis at Sites of Cell-Substrate Adhesion. Molecular Biology of the Cell. 21 (17), 3070-3079 (2010).
- Mattheyses, A. L., Atkinson, C. E., Simon, S. M. Imaging Single Endocytic Events Reveals Diversity in Clathrin, Dynamin and Vesicle Dynamics. Traffic. 12 (10), 1394-1406 (2011).
- Aguet, F., Antonescu, C. N., Mettlen, M., Schmid, S. L., Danuser, G. Advances in analysis of low signal-to-noise images link dynamin and AP2 to the functions of an endocytic checkpoint. Dev Cell. 26 (3), 279-291 (2013).
- Boucrot, E., Howes, M. T., Kirchhausen, T., Parton, R. G.
- Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics. 45, 273-297 (2011).
- Boch, J., Scholze, H., et al. Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type. III Effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).
