Summary
Dit handschrift bevat een eenvoudige, maar krachtige, in vitro methode voor het evalueren van de gladde spieren contractiliteit in reactie op farmacologische middelen of zenuwstimulatie. Belangrijkste toepassingen zijn het testen van geneesmiddelen en begrip weefsel fysiologie, farmacologie en pathologie.
Abstract
We beschrijven een in vitro werkwijze voor gladde blaasspier contractiliteit meten, en het gebruik ervan voor het onderzoeken fysiologische en farmacologische eigenschappen van de gladde spiercellen en veranderingen bij pathologie. Deze methode verschaft belangrijke informatie voor het begrijpen blaasfunctie terwijl overwinnen belangrijke methodologische moeilijkheden in in vivo experimenten, zoals chirurgische en farmacologische manipulaties die stabiliteit en overleving van de preparaten beïnvloeden, het gebruik van menselijke weefsels en / of het gebruik van dure chemicaliën. Het biedt ook een manier om de eigenschappen van elke component blaas (bijvoorbeeld gladde spier, mucosa, zenuwen) bij gezonde en pathologische condities te bestuderen.
De urineblaas wordt verwijderd uit een verdoofde dier, geplaatst in Krebs oplossing en snijd in reepjes. Strips worden geplaatst in een kamer gevuld met warme Krebs oplossing. Het ene uiteinde is een isometrische tensio bevestigdn transducer tot contractie kracht te meten, wordt het andere uiteinde op een vaste stang bevestigd. Weefsel wordt gestimuleerd door het direct toevoegen van verbindingen aan het bad of elektrisch veld stimulatie elektroden zenuwen, vergelijkbaar triggering blaas contracties in vivo te activeren. We demonstreren het gebruik van deze methode om spontane gladde spier samentrekking evalueren tijdens de ontwikkeling en na een experimentele ruggenmergletsel, de aard van neurotransmissie (transmitters en receptoren betrokken), factoren die bij modulatie van gladde spieractiviteit, de rol van individuele componenten blaas, en soorten en orgel responsverschillen farmacologische agentia. Daarnaast kan het worden gebruikt voor het onderzoeken van intracellulaire routes betrokken bij contractie en / of relaxatie van de gladde spieren, drug structuur-activiteitsrelaties en evaluatie van transmitter afgifte.
De in vitro gladde spier samentrekking werkwijze wordt veelvuldig gebruikt for dan 50 jaar, en heeft de gegevens die aanzienlijk bijgedragen aan ons begrip van blaasfunctie en op farmaceutische ontwikkeling van verbindingen die momenteel klinisch gebruikt voor blaas beheer ontvangen.
Introduction
De blaas gladde spieren ontspant urine opslagruimten, en contracten met urine eliminatie ontlokken. Ontspanning wordt gemedieerd door intrinsieke gladde spieren eigenschappen en met tonisch vrijkomen van noradrenaline (NE) van de sympathische zenuwen, die bèta-adrenerge receptoren (β 3 AR in menselijke) in de detrusor activeert. Plassen wordt bereikt door het remmen van de sympathieke input en het activeren van de parasympathische zenuwen die los ACH / ATP om de gladde blaasspier 1 contracteren. Tal van pathologische omstandigheden, met inbegrip van de hersenen en / of het ruggenmerg letsel, neurodegeneratieve ziekten, diabetes, obstructie van de blaas of interstitiële cystitis, kan diepgaand veranderen blaasfunctie, met ernstige gevolgen voor de kwaliteit van het leven 2 van de patiënt. Deze omstandigheden veranderen de contractiliteit van de gladde spieren door het beïnvloeden van een of meer bestanddelen van de blaas: de gladde spier, de afferente of efferente zenuwen en / of demucosa.
Verscheidene in vivo en in vitro methoden blaasfunctie studie ontwikkeld. In vivo, cystometry de primaire meting van blaasfunctie. Hoewel dit een intact preparaat dat het verzamelen van informatie volgens vlakbij fysiologische omstandigheden toelaat, zijn er een aantal gevallen waarin het gebruik van gladde spierstrips voorkeur. Deze omvatten situaties waarin chirurgische en / of farmacologische manipulaties het voortbestaan en de stabiliteit van de in vivo voorbereiding, of gevolgen zou hebben wanneer de studies vereisen het gebruik van menselijk weefsel of dure chemicaliën. Deze werkwijze maakt ook het onderzoek van de effecten van geneesmiddelen, leeftijd en pathologie van elke component van de blaas, dwz gladde spierweefsel, slijmvliezen, afferente en efferente zenuwen.
Blaas strips zijn gebruikt door de jaren heen door vele groepen aan een aantal wetenschappelijke vragen te beantwoorden. Ze werden gebruikt om te evaluate veranderingen in myogene spontane activiteit geïnduceerd door pathologie. Deze activiteit wordt geacht bij te dragen aan de urgentie en frequentie symptomen van overactieve blaas (OAB), en daarom een doelwit voor geneesmiddelen ontwikkeld voor OAB 3-9. Blaas strips werden ook gebruikt om myogene en neuronale factoren die gladdespiertonus moduleren teneinde ontdekken ionkanalen en / of receptoren en / of intracellulaire routes die kunnen worden gericht om ofwel relaxatie of contractie van de gladde spieren induceren onderzoeken 3,10- 13. Andere studies hebben zich geconcentreerd op de aard van neurotransmissie, waaronder zenders en receptoren betrokken en veranderingen bij pathologie 14,15. Bovendien is de methode gebruikt voor vergelijkingen tussen weefsels van verschillende species 16 en 18, tussen organen 19-21 en geneesmiddelresistentie van structuur-activiteitsrelaties 22-24. Een uitbreiding van deze werkwijze is gebruikt om MEASURe het effect van drugs op de zender vrijlating uit efferente zenuwen 25. Verder verscheidene weefsels (blaas, urethra, maagdarmkanaal, GI) geoogst uit dieren of mensen (bij operaties of orgaan donorweefsel goedgekeurd voor onderzoek) en van verschillende dierlijke modellen, waaronder ruggenmergletsel (SCI), obstructie van de blaas (BOO), of interstitiële cystitis (IC) kan worden onderzocht met behulp van deze techniek.
In dit document illustreren wij het gebruik van deze werkwijze, samen met de nodige experimentele protocollen toe verschillende bovengenoemde wetenschappelijke vragen te beantwoorden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures die hier beschreven worden goedgekeurd door de IACUC commissie aan de Universiteit van Pittsburgh.
1 Solutions
- Bereid Krebs oplossing volgens het recept. Samenstelling in mm: 118 NaCl, KCl 4,7, CaCl2 1.9, MgSO4 1.2, NaHCO3 24,9, KH 2 PO 4 1.2, dextrose 11,7.
- Beluchten Krebs met 95% O2, 5% CO2 en plaats deze in een 37 ° C waterbad gedurende het experiment te gebruiken. Plaats opzij ~ 200 ml beluchte Krebs oplossing bij kamertemperatuur te worden gebruikt voor weefsel dissectie.
- Meet pH (~ 7.4) en osmolariteit (~ 300 mOsm) van cellenbeton Krebs.
2 Experimental Set-up (Schematische figuur 1A)
- Vul belucht (95% O 2, 5% CO 2) kamers met 10 ml Krebs.
- Start de circulerende water pomp om de kamers tot 37 ° C te verwarmen; zet de benodigde apparatuur: versterker (s), stimulator (s) en opname software.
- Kalibreren transducers met een 1 g gewicht.
3 Tissue (Figuur 1B)
Verwijder de blaas van een volwassen naïeve vrouwelijke Sprague Dawley ratten (200-250 g; ~ 10-12 weken oud) de volgende stappen:
- Bereid dissectie gebied en de nodige instrumenten: elektrische scheerapparaten, pincet met tanden, scalpel, ontleden schaar, microscissors, twee ontleden verlostang (auteurs liever Dumont pincet 3 #), weefsel clips (of zijden hechtdraad), een Sylgard gecoate dissectie schotel met Krebs en weefsel dissectie pinnen.
- Verdoven van het dier met isofluraan inhalatie (4% in O 2) in de inductie kamer. Gebruik veterinaire zalf op de ogen tot droog te voorkomen terwijl ze onder narcose. Permanent toezicht op de mate van anesthesie door het observeren van de ademhaling, reactie op externe stimuli, en het verlies van de achterste ledematen reflex trekken.
- Wanneer het dier wordt verdoofd scheren de onderbuik eenrea. Expose de bekkenorganen via een middellijn incisie in de buik. Identificeer de blaas en plasbuis. Verwijder de blaas door te snijden op de blaashals nabij proximale urethra. Plaats weefsel direct in de Sylgard gecoate schotel gevuld met belucht Krebs oplossing.
- Verwijder zo nodig extra weefsel op dit moment: urethra, stukken van gastrointestinale (GI) kanaal en / of prostaatkanker, etc.
- Offeren van het dier met behulp van IACUC goedgekeurde methoden (bijvoorbeeld verdoving overdosis of CO 2 stikken, gevolgd door een tweede methode).
- Plaats weefsel kunnen ontleden door de blaas koepel, hals en ureters, de weefsel voor verdere dissectie stabiliseren. Laat het weefsel niet te rekken. Verwijder vet, bindweefsel, proximale urethra en ureters indien aanwezig.
- Open de blaas van de basis dome een vlakke plaat te maken, serosa omlaag / luminale omhoog (figuur 1B). Plaats ontleden pinnen op elke hoek van het weefsel. Verwijder blaas dome en nek weefsel.
- Indien het doel van het experiment is de bijdrage van de mucosa (urotheel en lamina propria - zie diagram figuur 1C) bepalen de gladde spiercontractie, vergelijk eigenschappen van detrusor strips met en zonder het slijmvlies gehecht. Voor deze, voorafgaand aan het snijden van het weefsel in reepjes, verwijder voorzichtig de mucosale laag met behulp van iris lente schaar en fijn pincet onder een stereomicroscoop. Na afloop van het experiment, bevestig de strips voor H & E kleuring om volledige verwijdering van de mucosa bevestigen. Merk op dat deze procedure gemakkelijker muis blaas dan in rat blaas.
- Snijd het weefsel in de lengte van de basis tot de koepel in reepjes van ca. 2 x 8 mm (Figuur 1B). Bind of bevestig een tissue clip aan beide uiteinden van elke strip.
OPMERKING: Een rat blaas kan meestal in 4 stroken worden gesneden, maar het aantal stroken kunnen toenemen of afnemen afhankelijk van de dier / blaasgrootte. - Breng de strips aan de experimental kamers. Bevestig een uiteinde van elke strook een krachtopnemer, waarbij de weefselsamentrekking meet, en de andere een vast glas / metaal staaf.
OPMERKING: Tissue kamers variëren in grootte (0,2 ml tot 20 ml of groter). Typische kamers voor knaagdieren blazen zijn 5-20 ml, hetgeen voldoende hoogte voor de strips volledig worden ondergedompeld in een oplossing te voorzien. Sommige kamers zijn uitgerust met een ingebouwde stimulatie-elektroden, anderen niet. Zorg moeten worden genomen om ervoor te zorgen dat alle aansluitingen van de elektroden in goede staat zijn, anders elektrisch veld stimulatie is niet betrouwbaar. - Breng een bepaalde hoeveelheid kracht om elke strook door voorzichtig rekken het weefsel tot basislijn spanning 1 g (~ 10 min) bereikt. Aanvankelijk weefsel neigt ontspannen welke opgeslagen als een afname van basislijn spanning. Was weefsel ongeveer elke 15 minuten met de warme beluchte Krebs en pas de basislijn spanning 1 g na elke wasbeurt. Laat weefsel equilibreren ~ 1-2 uur of tot basislijn spanning stal (dwz geen verdere ontspanning weefsel).
- Test levensvatbaarheid van weefsel door toevoeging van KCl (80 mM) rechtstreeks aan het bad ~ 5 minuten of totdat een plateau respons bereikt. Reacties op hoge concentraties KCl kan worden herhaald tijdens het experiment en aan het einde van het experiment en gebruikt voor het normaliseren reageren op andere geneesmiddelen of tussen stroken (zie normalisatie onder gegevensanalyse sectie).
- Was weefsel meerdere keren (3-5x) met de warme beluchte Krebs zodat het weefsel terugkeren naar pre-behandelingsomstandigheden.
4 Stimulatie protocollen
- Om de effecten van pathologie spontaan myogene activiteit of gladde spieren te onderzoeken, gebruiken gladde spier strips van verschillende diermodellen zoals SCI, BOO of neonaten. Figuur 2 illustreert het gebruik van deze methode om veranderingen in blaas spontane activiteit tijdens ontwikkeling te onderzoeken en na SCI. Bovendien kunnen farmacologische middelen worden gebruikt sp modulerenontaneous activiteit. Figuur 3 illustreert het effect van de KCNQ kanaal modulatoren, flupirtine en XE991, spontane activiteit en gladde spiertonus.
- Voor farmacologische gladde spierstimulatie constructie concentratie respons curven door het toevoegen van stoffen uit geconcentreerde voorraad oplossingen direct aan het bad met vaste tussenpozen. Drugsgebruik en voertuig in evenwijdige stroken om rekening te houden met het voertuig en de time effecten.
- Maak voorraadoplossingen van gewenste testverbindingen bij 1000x de uiteindelijke werkconcentratie. Voor carbachol (CCH), een muscarine receptor agonist, bereiden volgende aandelen: 10 -5 M, 3 x 10 -5 M, 10 -4 M, 3 x 10 -4 M, 10 -3 M, 3 x 10 -3 M , 10 -2 M. Eindconcentraties in het bad 10 -8 M tot 10 -5 M (figuren 4C, D). Voor neuromedine B (NMB), een bombesin receptor subtype 1 agonist, bereiden volgende aandelen: 10 -8 M, 10 -7M, 10 -6 M, 10 -5 M, 10 -4 M, 10 -3 M en de uiteindelijke concentraties in het bad zijn 10 -11 M tot 10 -6 M. Zowel Cch en NMB verwachting weefsel contractiliteit te verhogen.
- Voor een 10 ml weefselbad, voeg 10 ul van elk CCH voorraadoplossing als de respons een plateau (Figuur 4C, D) bereikt. In evenwijdige stroken commentaar gelijke hoeveelheden van het voertuig (water). Evenzo, voeg 10 ul van elk neuromedin B voorraadoplossing om ~ 5 min.
NB: Let op de prikkelende effect van NMB en CCH op gladde spieren in stroken van verschillende soorten in figuur 4. - Onderzoek de ontspanning eigenschappen van de gladde spieren in de pre-gecontracteerd weefsel met een prikkelende stof, meestal CCH of KCl.
- Een agonist respons blokkeren, voorbehandelen weefsel gedurende 10-20 min met de antagonist weefselpenetratie vóór stimulatie met agonist mogelijk.
- Voor neurale stimlatie van de gladde spieren, ook wel elektrisch veld stimulatie (EFS), volg de stappen 1 tot 3.13 en verder zoals hieronder beschreven. EFS beoogt selectief activeren zenuwen of gladde spier. Parameters voor stimulatie moet zorgvuldig worden gekozen om direct gladde spierstimulatie voorkomen.
- Vast stimulatieparameters: type stimulus (enkelvoudige pulsen of treinen), duur (pulsduur en treinduur), de frequentie en intensiteit, zoals beschreven in de onderstaande stappen en weergegeven in figuren 5A, B.
- Voor enkele puls stimulatie, set pulsduur, inter-stimulus interval en het aantal stimuli gewenst. Gebruikelijke stimulatie duur parameters zijn enkel pulsen van 0,05-0,3 msec duur afgeleverd op de gewenste tijdstippen (Figuur 5A). Volg stap 4.3.1.4 voor stimulus intensiteit.
- Voor trein stimulatie, stel de trein duur en onder de trein interval. Typische waarden voor blaasweefsel worden 3-10 sec afgeleverd ten minste 1 min elkaar (figuur 5B). Als weefsel vermoeidheid optreedt (EFS weeën afnemen tijdens controleperiode), verhoging van de inter trein interval.
- Bepaal de frequentie van trein stimuli (aantal pulsen in een reeks - Figuur 5B). Voer een frequentie response curve variërend 0,5-50 Hz. Typische frequenties voor blaas 10-20 Hz, die reproduceerbaar en stabiel contracties gemedieerd door ATP en ACh geven. Neem de frequentieafhankelijke respons op stimulatie in EFS muis blaas stroken in figuur 5 tonen hoe deze methode kan worden gebruikt om de bijdrage van cholinerge mechanismen en purinerge neurotransmissie beoordelen.
- Vast intensiteit van de stimulus: systematisch de intensiteit (spanning) van de stimulus tot de amplitude van de contractie een plateau bereikt (bij gebruik van treinen houdt de frequentie constant).
- Stel de intensiteit van de stimulus afhankelijkdoel van het experiment. Wil men het neuraal opgewekte contracties verhogen, dan submaximale intensiteit zodanig dat de amplitude van de contractie ~ 50% van de maximale contractie. Als het doel is om de neuraal opgewekte contracties verminderen, stel de intensiteit tot ~ 80% van de maximale amplitude om weefsel vermoeidheid te voorkomen.
- Zodra stimulatie parameters (duur, frequentie en intensiteit) zijn gevestigd, zodat ~ 20-30 min voor EFS- opgewekte contracties gestabiliseerd drugstests.
OPMERKING: (; 0,5-1 uM TTX) Om de selectiviteit van EFS voor neurale transmissie, blok neurale transmissie met de Na +-kanaal blocker, tetrodotoxin verifiëren. Voer deze stap aan het begin van het experiment zoals TTX wast relatief eenvoudig. Voer in het eind van het experiment (zie stap 4.3.5 hieronder.). - Bereid voorraad oplossingen tegen 1000x de laatste werkende concentraties voor: alfa, bèta-methyleen ATP (ABMA, een purinergische receptor activatoren desensibilisator) 10 -2 M, atropine (een muscarine receptor antagonist) 10 -3 M (figuur 5C). Observeer andere voorbeelden in figuur 6. De 5HT4 receptor agonist, cisapride (3 x 10 -6 M, 10 -6 M, 3 x 10 -5 M, 10 -5 M, 3 x 10 -4 M, 10 -4 M, 3 x 10 -3 M, 10 -3 M), verhoogt weefsel contractiliteit en SB-203186 (3 x 10 -3 M), een 5HT4 receptor antagonist, keert effecten cisapride's.
- Om de effecten van ABMA en atropine op EFS (figuur 5C) te testen, voeren twee controle frequentieresponscurves. Voeg 10 ul van 10 -2 M ABMA het bad voor een uiteindelijke concentratie van 10 uM. Hierdoor wordt het weefsel samentrekken door directe stimulatie van purinerge receptoren in de gladde spier. Na de reactie keert terug naar de basislijn, herhaal frequentie response curves. Voeg 10 ul van 10 -3 M atropine een definitieve concentration van 1 uM. Na ~ 10 min (nodig voor de atropine aan muscarine receptoren te blokkeren), herhaal frequentie response curves. Parallel strips 10 ul van het voertuig, water, bij elke stap.
OPMERKING: Bij andere voorbeelden in figuur 6, voeg 10 ul van elk cisapride voorraadoplossing met vaste tussenpozen (elke 15 min ~; zie bespreking), gevolgd door 10 ul van SB-203186 voorraadoplossing direct naar bad en monitoring van de gevolgen EFS geïnduceerde contractie. Parallel strips 10 ul van het voertuig, DMSO. Houd rekening met de effecten van cisapride, een 5HT4 receptor agonist, op EFS opgewekte contracties in de menselijke blaas en ileum weefsels in figuur 6. Daarnaast acht het effect van DMSO, het voertuig voor cisapride, on-EFS opgewekte contracties in de menselijke blaas en ileum weefsels . - Aan het einde van de EFS protocol verifiëren de selectiviteit van EFS door blokkering neurale transmissie met de Na + kanaal blokker, tetrodotoxine (TTX; 0,5-1 &# 181; M). Als TTX resistent weeën nog steeds aanwezig zijn, is het raadzaam om de duur en intensiteit van de stimulus in de daaropvolgende experimenten passen.
- Vast stimulatieparameters: type stimulus (enkelvoudige pulsen of treinen), duur (pulsduur en treinduur), de frequentie en intensiteit, zoals beschreven in de onderstaande stappen en weergegeven in figuren 5A, B.
- Voor het bepalen van de effecten van drugs op pre-of post-synaptische plaatsen (Figuur 7A) volgt u de stappen 1 tot en met 4.3.2. Vestigen reproduceerbare reacties op carbachol en EFS, voeg dan drug X.
- Na afloop van het experiment, wip of los stroken Dep ze voorzichtig op een stuk vloeipapier extra vocht weg en meet het gewicht elke strook met behulp van een balans. Meet ook het weefsel lengte met behulp van een schuifmaat om dwarsdoorsnede te bepalen. Deze informatie wordt gebruikt voor normalisatie van data (zie paragraaf 5.4).
5 Data Analysis
Analyseren van gegevens met behulp van adequate software (bijvoorbeeld WinDaq, LabChart).
- Voor spontane activiteit, selecteer een venster van ten minste 30 seconden, tot het hoogtepunt van het geneesmiddel geïnduceerde respons en measure amplitude en frequentie van myogene activiteit (figuur 3).
- Gebruik snelle Fourier transformatie analyse om de frequentiespectrum bijdragen tot contractiele responsen en vaststellen of er verschillen zijn tussen de verschillende delen van de blaas (bijvoorbeeld dome versus nek) of ontwikkeling, pathologie en drugs 8.
- Voor effecten op gladde spieren selecteer een venster van ten minste 10-30 sec vóór en tijdens de piek van het geneesmiddel geïnduceerde respons en meet de amplitude van de contractie.
- Voor effecten op neuraal opgewekte contracties meten amplitude, duur en gebied onder de kromme van contracties (3 minimum) vóór en tijdens de piek van de geneesmiddel-geïnduceerde reactie.
LET OP: Het is noodzakelijk om zowel de amplitude en de omgeving te meten onder de curve van de EFS-geïnduceerde contracties omdat purinergische en cholinerge componenten hebben verschillende kinetiek. De purinergische component is snel en van voorbijgaande aard (ATP activeert purinergic ionotrope kanalen zoals P2X1 die snelle influx van calcium toe, dan ongevoelig ze), dus meer naar de top amplitude respons en minder op het gebied dragen onder de curve. De cholinerge component is langzamer en aanhoudende (ACh activeert metabotropische muscarinereceptoren, die meer tijd nodig hebben om intracellulaire wegen die uiteindelijk activeren ion kanalen die de gladde spieren depolariseren een contractie induceren activeren). Zo wordt de muscarine component gevangen beter door het meten van de oppervlakte onder de curve. - Normaliseren van de gegevens te kunnen resultaten over strips en farmacologische behandelingen te vergelijken. De gekozen voor normalisatie parameter mag niet worden beïnvloed door de test verbindingen, pathologische aandoening bestudeerde of experimenteel ontwerp. Onder deze parameters gebruikt strip gewicht, dwarsdoorsnede, KCl responsen (figuur 4B),% van de maximale respons (Figuur 7B) of% van de maximale respons op andere contractiele agens(Bijv, CCH) of ontspannen middelen (bv, papaverine).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spontane myogene activiteit
Spontane myogene activiteit is een belangrijk kenmerk van glad spierweefsel dat verandert met de postnatale ontwikkeling 6-9 en pathologie (bijvoorbeeld, SCI, BOO) 3-5 ondergaat. Omdat deze activiteit wordt geacht bij te dragen tot de symptomen van overactieve blaas (OAB) 2, een evaluatie van receptoren, intracellulaire wegen en farmacologische agentia die moduleren, van groot belang voor de ontwikkeling van effectieve behandelingen voor OAB en andere gladde spier disfuncties. De hier gepresenteerde methode gemakkelijk onderzoeken deze vragen Figuur 2 toont verschillende patronen van myogene spontane activiteit tijdens de ontwikkeling in neonatale (i), juveniele (ii) volwassene (iii) en schade aan het ruggenmerg ratten. (SCI, iv). Strips van pasgeboren ratten vertonen grote amplitude, lage frequentie ritmische samentrekkingen (figuur 2AI), terwijl de strips van volwassen rattens vertonen kleine amplitude, hoge frequentie activiteit (figuur 2Aii iii,). Na SCI de neonatale patroon opnieuw naar voren (figuur 2Aiv). Naast het gebruik van strips van diermodellen kunnen verschillende farmacologische middelen worden gebruikt om spontane contracties in banden van naïeve dieren te induceren, met als doel het begrijpen van de onderliggende mechanismen van de spontane contracties. Voorbeelden van geschikte farmacologische middelen omvatten muscarine receptor agonisten (carbachol, CCH). Verbindingen die ACh niveaus (zoals acetylcholine esterase remmers) verhogen, lage concentraties KCl (bijvoorbeeld 20 mM) of andere experimentele drugs Figuren 3A-B illustreren modulatie spontane activiteit van farmacologische middelen die werken op KCNQ kanalen op de gladde spier. De KCNQ channel opener, flupirtine, verlaagt de amplitude en frequentie van spontane activiteit in een concentratie-afhankelijke wijze (Figuur 3AI-iii), terwijl deKCNQ kanaal blocker, XE991, vermindert de amplitude, maar verhoogt de frequentie van spontane activiteit (figuur 3BI-iii).
Gladdespiertonus
Gladde spiertonus en contractiliteit eigenschappen zijn belangrijke factoren voor een goede werking van de blaas tijdens opslag en plassen. Deze methode kan eenvoudig screenen van de effecten van farmacologische middelen op gladde spiertonus. Figuren 3Aiv en 3Biv blijkt dat flupirtine afneemt basale toon overeenstemming met gladde spierrelaxatie, terwijl de XE991 verhogingen gladde spiertonus. Figuur 4 toont concentratie-afhankelijke toename in gladdespiertonus door het activeren van receptoren bombesin met neuromedine B (NMB Figuur 4A, B) of muscarinereceptoren met carbachol (CCH; figuren 4C, D). Bovendien kunnen intracellulaire routes mediëren deze gladde spier responsen onderzocht uzing specifieke modulatoren (gegevens niet getoond).
Neuraal-gemedieerde reacties en Modulatie van Neurotransmission
Blaascontractie wordt bereikt door het vrijkomen van ACh / ATP van het parasympathische efferente zenuwen. De bijdrage van muscarine en purinerge systemen blaascontractie varieert tussen soorten en pathologische condities met overheersende toename purinerge bijdrage pathologieën zoals interstitiële cystitis, gedeeltelijke obstructie en overactieve blaas 26. Figuur 5C toont het gebruik van deze methode voor het bepalen bijdrage muscarine en purinerge componenten neurotransmissie in blaas stroken van de muis. De bijdrage van de cholinerge component werd beoordeeld met behulp van de muscarine receptor antagonist, atropine. De bijdrage van het purinerge systeem werd beoordeeld met behulp van de purinerge receptor activator en desensibilisator, alfa, beta-methylene ATP (ABMA). Daarnaast is de frequentieafhankelijke bijdrage van elke component werd bepaald door het variëren van de stimulatiefrequentie van lage tot hoge frequenties (2-50 Hz).
De sterkte van de blaascontractie speelt een belangrijke rol bij het efficiënt plassen. Met behulp van deze methode kunnen receptoren en routes die neurale transmissie moduleren worden onderzocht als drug targets voor plassen disfuncties. De 5HT4 receptoren zijn pre-junctioneel uitgedrukt in parasympathische neuronen en hun activering neemt ACh niveaus 27. Figuur 6 illustreert de prikkelende werking van de 5HT4 receptor agonist, cisapride, in menselijke blaas en ileum strips.
Verschillende experimentele protocollen kunnen worden gebruikt om de plaats van werking van een testverbinding te bepalen. Diagram in Figuur 7A illustreert een protocol dat wordt gebruikt om pre-versus post-junctional websites beoordelen. Als drug X vermindert (of verhogingen) de EFS reactie, maar heeft geen effect de CCH respons, de meest waarschijnlijke plaats van werking is pre-junctional. Als geneesmiddel X verandert zowel EFS en CCH respons, dan kan het werken op receptoren na junctioneel of zowel vóór als na-junctioneel.
Rol van elk onderdeel: gladde spieren, slijmvliezen, en neuronale
Verschillende pathologische omstandigheden beïnvloeden verschillende componenten van de blaas. Bijvoorbeeld interstitiële cystitis (IC) beïnvloedt voornamelijk het urotheel, terwijl OAB kan resulteren in veranderde gladde spieren contractiliteit. Ook kunnen verschillende receptoren tot expressie worden gebracht in elke blaas component en kon dus specifiek een bepaalde pathologie gericht. In tegenstelling tot in vivo methoden, die een netto-effect van alle blaas kunnen meten, laat deze in vitro werkwijze voor het onderzoeken van bepaalde componenten door een combinatie van chirurgische en farmacologische procedures. Om gladde spiercontractie / relaxatie testen in afwezigheid van neuronaletransmissie, TTX (0,5-1 uM) worden toegevoegd aan het bad. In figuur 4, NMB en CCH werden getest in aanwezigheid van TTX. Om de bijdrage van de mucosa (urotheel en lamina propria) aan de gladde spieren contractiliteit te toetsen zijn strips met en zonder de mucosale laag vergeleken. Figuur 7B toont dat de reacties op CCH worden gereduceerd in de aanwezigheid van de mucosa van het varken 28. Soortgelijke resultaten werden gerapporteerd in menselijke blaas strips 29. Om de rol van zenuwvezels te testen, kunnen verschillende benaderingen worden genomen. Een daarvan is om te activeren of te remmen specifieke vezels met behulp van farmacologische middelen. Bijvoorbeeld, capsaicin activeert een specifieke populatie van afferente zenuwen en veroorzaakt species afhankelijke gladde spiercontractie of relaxatie 17,18. Guanethidine remt de afgifte van norepinefrine uit sympathetische vezels, zodat het niet langer de bijdrage van deze vezels. Een andere benadering is ongevoelig / elimineren vezels die in vivovoorafgaand aan het experiment. Bijvoorbeeld, systemische behandeling van het dier met capsaïcine ongevoelig capsaicin gevoelige afferente zenuwen. Overige blaas componenten die kunnen worden bestudeerd in dit preparaat zijn interstitiële cellen of gap junctions door het activeren of te blokkeren specifieke middelen.
Soort Verschillen
Terwijl de meeste geneesmiddelenontwikkeling is bestemd voor de behandeling van menselijke aandoeningen, is fundamenteel onderzoek voornamelijk uitgevoerd in dierlijk weefsel. Species verschillen in een aantal receptoren. Bijvoorbeeld, 5HT4 receptor agonisten versterken neuraal opgewekte contracties in de menselijke blaas, maar niet in de rat blaas 19,30, EFS geïnduceerde contracties vrijwel uitsluitend atropine-gevoelige humane en oude wereld aap detrusor van stabiel blazen 31 maar wordt gedeeltelijk atropine-resistente in menselijke detrusor van patiënten met een onstabiele blaas aandoeningen (bijvoorbeeld neurogene, obstructed blazen) 15,32,33, capsaïcine lokt een prikkelende reactie bij ratten en menselijke blaas strips, geen reactie in varkensblaas strips en remmende respons bij cavia blaas strips 17,18. Figuur 4 laat zien dat de receptor agonisten bombesine hebben prikkelende effecten op rat blaas en geen effecten op de muis en varkensblaas strips 16. Deze informatie is cruciaal voor de geschikte diermodel voor het bestuderen van een specifieke receptor.
Vergelijking van de gevoeligheid over Orgels
Geneesmiddelen bedoeld voor de behandeling van blaas aandoeningen kan ook invloed gladde spieren van andere organen, zoals het maagdarmkanaal, urethra, galblaas, etc. Deze werkwijze maakt schatting van organen selectiviteit en gevoeligheid voor een farmacologisch middel van het vergelijken van verschillende weefsels naast elkaar. Zoals geïllustreerd in figuur 6, de 5HT4 receptor agonist, cisapride, heeft afwijkenent werkzaamheid en kracht in menselijke blaas tegen ileum weefsel.
Figuur 1 Experimentele opzet en blaas strip voorbereiding. A) Schematische voorstelling van de experimentele opstelling. Blaas strips worden ondergedompeld in weefselkamers gevuld met belucht Krebs oplossing gehouden op 37 ° C via een circulatiewaterpomp. Een uiteinde van de strip is een isometrische kracht transducer aan weefsel contractiliteit meten, de andere een vaste staaf. De krachtopnemer is verbonden met een versterker en computer voor gegevensregistratie. Elektrisch veld stimulatie-elektroden verbonden met een stimulator worden in de kamer gebracht en voor het oproepen neuraal-gemedieerde blaascontracties. B) Bereiding van weefsel strips. De blaas wordt vastgepind in een schotel en de volgende procedures worden uitgevoerd: # 1 verticale snede stedoorgedreven ventrale helft van de blaas van de plasbuis naar koepel om de blaas te openen in een vlakke plaat. # 2 horizontale bezuinigingen verwijderen van de koepel en de basis van de blaas / proximale urethra. . Nr.3 verticale sneden midden blaas verdelen in gelijke stroken (4 strips uit een rat blaas) C) Schematische strookvormige elementen: gladde spieren en slijmvliezen, bevattende zowel afferente (blauw) en efferente (groen) zenuwen. Slijmvlies bestaat uit de urothelium en lamina propria. Lamina propria bevat bloedvaten [1], interstitiële cellen [2], en muscularis mucosa [3]. Gestippelde lijn gelabeld # 2b geeft de procedure voor het verwijderen van slijmvlies laag. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2 Myogene spontane activiteit tijdens de ontwikkeling en napathologie. A) Voorbeelden van spontane activiteit in neonatale (i), juveniele (ii), spinale intacte volwassen (iii) en schade aan het ruggenmerg (SCI) volwassene (iv) rat blaas strips. Het SCI ratten werd 4 weken na de operatie. B, C) Samenvatting van amplitude (B) en frequentie (C) van spontane contracties in de vier groepen onderzocht. (Overgenomen met toestemming van Artim DE, Kullmann FA, Daugherty SL, Bupp E, Edwards CL, de Grutten WC Neurourol Urodyn 2011 Nov; 30 (8):.. 1666-74.) Klik hier om een grotere versie van deze foto figuur.
Figuur 3 Modulatie van myogene spontane activiteit en gladde spiertonus. A) Het effect van de KCNQ kanaal opener, flupirtine, op spontane activiteit en de baseline toon in volwassen rat blaas strips. (I) Flupirtine werd toegevoegd in toenemende concentraties (cumulatief) op de door pijlen keer. De uitbreidingen onder het spoor tonen 4 min van de strip activiteit tijdens de controle en na toepassing van 10 uM en 50 uM flupirtine. (Ii-iv) Samenvatting van de effecten van flupirtine (7 stroken van 4 ratten) de amplitude (ii) en frequentie (iii) van spontane activiteit en basislijn toon (iv), uitgedrukt als% verandering ten opzichte van controle (pre-geneesmiddel) waarden , die werden ingesteld op 100%. B) Het effect van de KCNQ kanaal blocker, XE991, op spontane activiteit en de baseline toon in volwassen rat blaas strips. (I) XE991 werd toegevoegd in toenemende concentraties (cumulatief) op de door pijlen keer. De uitbreidingen onder het spoor tonen 2 min van de strip activiteit tijdens de controle en na toepassing van 10 uM en 50 uM XE991. (Ii-iv) Samenvatting van de effecten van XE991 (9 strips van 4 ratten) op deamplitude (ii) en frequentie (iii) van spontane activiteit en de baseline toon (iv), uitgedrukt als% verandering ten opzichte van controle (pre-geneesmiddel) waarden, die werden ingesteld op 100%. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken .
Figuur 4 Soortverschillen. A) concentratie afhankelijke gladde spiercontracties in reactie op de bombesine-receptor agonist, neuromedine B (NMB), in rat blaas strips. B) Samenvatting van de effecten van NMB op gladde spiercontractie in de rat blaas strips. Gegevens zijn genormaliseerd naar het KCl (80 mM) respons. C, D) Geen reacties op NMB van muis (C) en varkens (D) blaas strips. Carbachol (CCH) ontlokt sterke concentratie-afhankelijke contractie in zowel muis en varken strips, wat aangeeft dat de strips kunnen reageren op prikkels. TTX (0,5 uM) was aanwezig in het bad in alle strips. (Overgenomen met toestemming van Kullmann FA, McKenna D, Wells GI, Thor KB Neuropeptides 2013 okt, 47 (5):.. 305-13) Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5 Elektrisch veld stimulatie. A) Schematische voorstelling van enkele puls stimulatie parameters. Afkortingen: d = duur van de puls, i = intensiteit van de puls, ipi = inter pulsinterval B) Schematische voorstelling van de trein stimulatie parameters.. Afkortingen: td = trein duur, i = intensiteit van de puls, iti = inter trein interval. Inzet is het aantal pulsen in een reeks en het interval tusEEN hen die samen met treinduur bepalen de frequentie van de trein stimulatie. C) Bijdrage van purinegic en cholinerge componenten neuraal-evoked blaascontracties. EFS-FR vertegenwoordigen stimulatiefrequenties, 2, 5, 10, 20, 50 Hz. Drie stimuli afgeleverd elke 90 seconden werden getest voor elke frequentie en elke frequentiereeks werd tweemaal herhaald controle en tweemaal na toevoeging van elke verbinding. Alfa, beta-methyleen ATP, afgekort ABMA (strook 1), werd gebruikt om purinerge receptoren en atropine (strip 2) werd gebruikt om muscarine receptoren blokkeren ongevoelig. Strip 3 diende als controle en behandeld met voertuig water. Pijlen geven het tijdstip wanneer elke verbinding werd toegevoegd aan elke strook. Merk op dat EFS opgewekte contracties sterk verminderd ABMA en atropine, maar niet door het voertuig. TTX werd toegevoegd aan het einde van het experiment terwijl de EFS bij 20 Hz afgeleverd. Merk op dat de resterende contracties waargenomen in de controlegroepstrip 3 werden afgeschaft door TTX, tonen hun neurale aard (dwz geïnitieerd door zender vrijlating uit de intramurale zenuwen). # Geeft gladde spier responsen op ABMA in afwezigheid van EFS. Schaal bars zijn 5 min voor x-as en 2 g voor y-as. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6 Modulatie neuraal opgewekte blaascontracties. A, B) Voorbeelden van de versterking van het neuraal opgewekte contracties van de 5HT4 receptor agonist, cisapride in menselijke blaas (A) en ileum strips (B). Cisapride (zwarte platen) of DMSO (grijze records) werd in een concentratie afhankelijke wijze toegevoegd aan de met pijlen aangegeven tijden. Zwarte balken onder de records in elk paneelvertegenwoordigen EFS, dat bestond uit 10 sec treinen afgeleverd op 20 Hz elke 120 sec. Verticale schaal bars zijn 1 gr voor alle voorbeelden. TTX concentratie 0,5 pM. CF) Samenvatting van de oppervlakte onder de curve (AUC) van EFS opgewekte contracties in respons op cisapride (zwarte staven) of DMSO (grijze balken) in blaas strips (C, D) en ileum strips (E , F). In CF, SB staat voor SB-203186, die een samenvatting van de gegevens verkregen na toevoeging van de 5HT4 receptor antagonist. Gestippelde lijnen op 100% en controle vertegenwoordigt. (Overgenomen met toestemming van Kullmann FA, Kurihara R, Ye L, Wells GI, McKenna DG, Burgard EG, Thor KB Auton Neurosci 2013 Jun; 176 (1-2):... 70-7) Klik hier om een foto grotere versie van deze figuur.
Figuur 7 locaties van de werking van geneesmiddelen en de rol van de verschillende componenten van de blaas. A) Schematische voorstelling van het protocol voor het vaststellen van de plaats van werking van een geneesmiddel. Strips worden gestimuleerd met ESF en carbachol (CCH). In i geneesmiddel X vermindert de EFS reactie, maar niet de CCH respons, wat wijst op een pre-junctional plaats van actie. In ii, drug X verandert beide reacties, een actie aan post-junctionele of zowel voor en na junctional receptoren. B) Invloed van mucosa op gladde spiercontractie. Effecten van carbachol afnemen bij stroken met het slijmvlies aanwezig (intact) in vergelijking met stroken met het slijmvlies verwijderd (ontdaan). (B is overgenomen met toestemming van Hawthorn MH, Chapple CR, Cock M, Chess-Williams R. Br J Pharmacol 2000 februari; 129 (3):. 416-9). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel beschrijven we een eenvoudige in vitro gladde spier samentrekking methode die kan worden gebruikt om een aantal belangrijke wetenschappelijke vragen blaas fysiologie en pathologie, en helpen de ontdekking van nieuwe geneesmiddelen voor de behandeling van blaas dysfuncties pakken. We hebben het gebruik van deze methode geïllustreerd voor de beoordeling van ontwikkelings-, pathologische en farmacologische eigenschappen van de gladde blaasspier contractiliteit (figuren 2-4), neurotransmissie modulatie (figuren 5-7A), verschillen tussen soorten (Figuur 4), orgel verschillen (zie figuur 6) en relevantie van specifieke blaas componenten (bijvoorbeeld, slijmvlies, figuur 7B). Extra applicaties hier niet afgebeeld omvatten evaluatie van intracellulaire wegen met farmacologische middelen 3,10,11, structuur-activiteit relatie van verschillende drugs 22-24, of de evaluatie / kwantificering van zender release na neurale stimulatie 25.
Terwijl blaasfunctie uiteindelijk worden beoordeeld in vivo, deze in vitro werkwijze overwint vele situaties die problematisch in vivo. Deze omvatten situaties waarin chirurgische en farmacologische manipulaties de levensvatbaarheid en / of overleving van het orgaan of het dier, het gebruik van menselijk weefsel zou verminderen, de noodzaak te identificeren en karakteriseren antwoorden van specifieke componenten (bijvoorbeeld, gladde spier versus epitheel tegen zenuwen ) of het gebruik van dure chemicaliën. De werkwijze maakt systematisch onderzoek naar de effecten van verschillende farmacologische middelen en pathologie van contracties van de gladde spier en in een goed gecontroleerde wijze en omgeving.
De methode biedt een overvloed aan informatie; echter, moet men voorzichtig zijn bij het interpreteren en het extrapoleren van deze gegevens. Dit is een in vitro werkwijze verlaagde preparaat, disverbonden van zijn normale omgeving en neurale controle. De experimentele omstandigheden zijn niet fysiologische, waardoor de gegevens niet volledig overeen met in vivo fysiologische situaties. Bijvoorbeeld kan de werkwijze niet moet veranderingen in bloedstroom, hormonen, humorale stoffen, externe mechanische krachten, of extrinsieke neuronale controle. Weefsel wordt acuut gedecentraliseerd, waardoor letsel en ischemie-gerelateerde reacties moeten worden geëvalueerd en in aanmerking genomen. Pathologische veranderingen in de hersenen of het ruggenmerg kan worden getest met behulp van deze methode, tenzij zij reeds veranderd afferente, gladde spier, mucosa of intramurale zenuwen (bijvoorbeeld cellulaire plasticiteit). Elektrisch veld stimulering (EFS) maakt de evaluatie van neuraal gemedieerde responsen. Echter, windt lukraak alle zenuwen in de strip (bijvoorbeeld sympathische, parasympathische, afferenten), in tegenstelling tot in vivo situatie waarin de mictie reflex activeert alleen bepaalde pathwegen. Een manier om deze situatie kan EFS gecombineerd met specifieke antagonisten die verschillende wegen selectief blokkeren. Bijvoorbeeld zou guanethidine worden norepinefrine afgifte blokkeren bij het bestuderen contractie eigenschappen of atropine kan worden gebruikt om muscarine receptoren blokkeren om blaascontracties voorkomen bij het bestuderen relaxatie eigenschappen. Tenslotte wordt de levensvatbaarheid van het weefsel beperkt tot een bepaald aantal uren. In het algemeen hebben de meeste componenten van blaasweefsel levensvatbaar en stabiel (dat wil zeggen reageren EFS zonder verslechtering reacties) gedurende een periode van 6-8 uur of langer. Echter, andere weefsels gevoeliger zijn (bijvoorbeeld ileum duurt ~ 6 uur of minder; persoonlijke ervaring auteur).
Hoewel de methode is technisch haalbaar en met een goede reproduceerbaarheid, zijn er verschillende kritische stappen die nodig zijn om een succes te maken. Ten eerste moet weefselbereiding zorgvuldig worden uitgevoerd om levensvatbaarheid van de nodige wijzigingende dissectie procedure (vermijd strekken het weefsel wanneer het de stroken) en / of dragers indien nodig voor verschillende weefseltypes of soorten. Een andere belangrijke stap is het opzetten van neuronale stimulatie parameters, zodanig dat plafond effecten worden vermeden. Zoals beschreven in de sectie methode hangt af van de aard van de uitgevoerde experimenten en verwachte werkingsmechanisme van de testverbinding. Bijvoorbeeld, voor het testen van effecten van cisapride, een 5HT4 receptor agonist, op blaas strips (figuur 6), zetten we de amplitude van EFS opgewekte contractie ~ 50% van de maximale. Dit was gebaseerd op de bekende werkingsmechanisme van 5HT4 receptor agonisten, namelijk het verbeteren ACh afgifte van het pre-junctionele parasympathische zenuwen 27, die op zijn beurt wordt naar EFS opgewekte contracties verhogen. Stimulatie van spieren tegen zenuwen worden getest met TTX, die neurale transmissie remt en dus moeten EFS opgewekte contracties inhiberen. Adequate controles voor voertuigen en time moeten worden uitgevoerd tijdens de dopingcontrole om rekening te houden met een verslechtering van het weefsel met de tijd en voor de eventuele gevolgen van het voertuig. Zo zijn vele geneesmiddelen opgelost in DMSO of ethanol. Onze gegevens (figuur 6) blijkt dat DMSO (0,1% en hoger) kan verhogen neuraal opgewekte contracties, een effect dat moet worden afgetrokken van het effect van het te testen geneesmiddel. Evenzo ethanol (1%) vermindert de spontane contracties van gladde spieren, maar heeft geen effect op neuraal opgewekte contracties 34,35. Als het gebruik van genetisch gemanipuleerde dieren of chirurgische modellen (bijvoorbeeld een dwarslaesie of ovariëctomie), moeten controles omvatten weefsel van de juiste achtergrond muis stam of sham geopereerde dieren, respectievelijk. Bovendien hebben sommige weefsels, zoals menselijke, muizen en cavia blazen bevatten intramurale ganglia. Bij het werken met deze weefsels, moet het protocol selectie en interpretatie van de gegevens rekening houden met effecten van drugs of EFS op intramurale neurons dat verdere stimulering van de gladde spieren.
Het ontwerpen van de experimentele protocol, het kiezen van de juiste parameters (voor EFS, voor drug stimulatie) en concentraties te testen zijn van cruciaal belang om zinvolle gegevens te waarborgen. Terwijl de parameters moeten worden aangepast voor de individuele weefsels en drugs, algemene beginselen / richtsnoeren hieronder beschreven zijn van toepassing. Cumulatieve concentratie respons curven wenselijk, maar dit is niet voor alle verbindingen. Medicijnen die receptoren die ongevoelig, zoals purineric ionotrope receptoren (P2X), of geneesmiddelen die snel gemetaboliseerd in het weefsel (voorbeeld ACh), niet betrouwbaar worden getest met cumulatieve concentratie respons curven in hetzelfde weefsel. In deze gevallen worden interne concentraties getest in verschillende groepen weefsel. Voor desensibilisatie evalueren, wordt aanbevolen vergelijken de mate van respons opgewekt door een hoogste concentratie aan die welke op het einde van een cumulatieve concentratierespons curve.
Voor nauwkeurige montage van de verkregen concentratie respons curven gegevens wenselijk om half log concentraties (bijvoorbeeld CCH in figuur 6) getest. Echter, log concentraties (bijvoorbeeld NMB in figuur 4A) zijn aanvaardbaar wanneer de levensvatbaarheid van het weefsel kan worden beperkt of andere beperkingen kunnen worden in de plaats.
Een concentratiebereik voor een nieuwe verbinding te selecteren, in voorlopige experimenten, is het nuttig om de bindingsaffiniteit van de verbinding en moeten twee kracht van 10 boven en onder die concentratie verhelpen. In volgende experimenten wordt het protocol verfijnd om een beginpunt waarbij geen effect van het geneesmiddel wordt waargenomen en een eindpunt waarbij ofwel de maximale respons of de geteste concentratie niet meer specifiek voor het beoogde doel bepaald.
Het tijdsinterval voor het aanbrengen van een geneesmiddel moet worden gekozen rekening houdend met verschillende factoren: a) Tijd voor eengeneesmiddel af te werpen. In het algemeen geneesmiddelen gericht membraan receptoren hebben een relatief snelle reactie (seconden tot minuten), terwijl de drugs voor intracellulaire targets (bv forskolin en andere enzymremmers 36, botulinum toxine 37) vereisen extra incubatietijd (30 min - 3 uur). Bovendien kan weefseldikte een rol spelen. b) Duur en werkingsmechanisme van het geneesmiddel. Voor gevallen waarin de geneesmiddelwerking een plateau dat is ontstaan, zoals NMB in figuur 4A en cisapride in figuur 6 bereikt, tijdsinterval van 5-15 min tussen drugtoepassingen geschikt zijn voor het verzamelen van voldoende gegevens. Dit is niet mogelijk met geneesmiddelen met een veel kortere werkingsduur of ander werkingsmechanisme (ATP, CCH). Bijvoorbeeld het effect van CCH in figuur 4C en 4D, bereikte een plateau snel maar het weefsel spanning neigt terug naar de basislijn. In dit geval moet de tijdsintervallen te worden aangepastly, gewoonlijk voegen de volgende concentratie bij de eerste reactie een maximum bereikt.
Gegevensanalyse bijzonder normalisatie van gegevens om vergelijkingen tussen stroken mogelijk is een zeer belangrijke stap. Verschillende studies gebruiken verschillende parameters voor normalisatie, waaronder strippen gewicht 38, strip doorsnede 39, KCl respons 12% van de maximale respons of 28% van de maximale respons op andere contractiele middel (bijvoorbeeld CCH 38). De parameter normalisatie moet worden gekozen afhankelijk van het doel van het experiment, zodat de parameter niet wordt beïnvloed door de testverbindingen, pathologie of experimenteel ontwerp. Bijvoorbeeld, normalisatie naar KCl reactie elimineert het gewicht en andere dimensies van de stroken, en dus kunnen worden gebruikt om responsen te vergelijken in weefsels waar pathologische toestand het gewicht van de stroken (bijvoorbeeld diabetes verhoogt blaas massa) kan toenemen. Bovendien is de rereactie op KCl wordt niet beïnvloed door de verwijdering van de mucosa / urotheel 29 aldus kunnen worden gebruikt in proeven evalueren verschillende componenten van de blaas (bijvoorbeeld mucosa tegen gladde spieren).
Kortom, dit contractiliteit methode een snelle, gemakkelijke en zeer krachtige benadering blaas (en andere organen) fysiologie en farmacologie beoordelen. Mits goed gebruikt, het biedt de mogelijkheid om weefsel te manipuleren in een verminderde en goed gecontroleerde omgeving. In het onderzoek van de urineblaas functie, was deze werkwijze instrumenteel in het ontdekken en testen van verbindingen die momenteel worden gebruikt voor OAB beheer, zoals de antimuscarinica en nieuw ontwikkelde β 3 AR agonisten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door NIH R37 DK54824 en R01 DK57284 subsidies aan LB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Tissue Bath System with Reservoir | Radnoti, LLC | 159920 | isolated tissue baths |
| Warm water recirculator pump | Kent Scientific Corporation | TPZ-749 | to keep tissue baths to 37 °C |
| Computer | |||
| Data Acquisiton System | DataQ Instruments | DI-710-UH | To view, record and analyze data |
| Transbridge Transducer Amplifier | World Precision Instruments | SYS-TBM4M | Transducer amplifier |
| Grass stimulator | Grass Technologies | Model S88 | Stimulator |
| Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | ACV-1205S | To anesthetesize the animal |
| Anesthetizing Box | Harvard Apparatus | 500116 | To anesthetesize the animal |
| Anesthesia Masks | Kent Scientific Corporation | AC-09508 | To anesthetesize the animal |
| Materials and Surgical Instruments | |||
| Sylgard | Dow Corning Corp | 184 SIL ELAST KIT | To pin, dissect, & cut tissue |
| Petri Dish | Corning | 3160-152 | To dissect/cut tissue |
| Insect Pins | ENTOMORAVIA Austerlitz Insect Pins | Size 5 | To pin tissue |
| Bench Pad | VWR International | 56617-014 | Absorbent bench underpads |
| Rat surgical Kit | Kent Scientific Corporation | INSRATKIT | To remove and dissect tissue |
| 2 Dumont #3 Forceps | Kent Scientific Corporation | INS500064 | To remove and dissect tissue |
| Tissue Forceps | Kent Scientific Corporation | INS500092 | To remove and dissect tissue |
| Scalpel | Kent Scientific Corporation | INS500236 | To remove and dissect tissue |
| Scalpel blade | Kent Scientific Corporation | INS500239 | To remove and dissect tissue |
| Professional Clipper | Braintree Scientific, Inc. | CLP-223 45 | To remove fur |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Tie tissue |
| Tissue Clips | Radnoti, LLC | 158802 | Attach tissue to rod/transducer |
| 1 g weight | Mettler Toledo | 11119525 | For transducer calibration |
| Chemicals | |||
| Krebs Solution: Sodium chloride Potassium chloride Monobasic potassium phosphate Magnesium sulfate Dextrose Sodium bicarbonate Calcium chloride Magnesium chloride |
Sigma Fisher Fisher Fisher Fisher Sigma EMD Baker |
S7653 P217-500 P285-3 M65-500 D16-500 S5761 CX0130-2 2444 |
To prepare Krebs solution |
| Isoflurane | Henry Schein | 029405 | To anesthetesize the animal |
| Oxygen tank | Matheson Tri Gas | ox251 | To use with anesthesia system |
| Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide) | Matheson Tri Gas | Moxn00hn36D | To aerate Krebs solutions |
References
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C.
- Andersson, K. E. Detrusor myocyte activity and afferent signaling. Neurourol Urodyn. 29, 97-106 (2010).
- Artim, D. E., et al. Developmental and spinal cord injury-induced changes in nitric oxide-mediated inhibition in rat urinary bladder. Neurourology and urodynamics. 30, 1666-1674 (2011).
- Kita, M., et al. Effects of bladder outlet obstruction on properties of Ca2+-activated K+ channels in rat bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 298, 1310-1319 (2010).
- Barendrecht, M. M., et al. The effect of bladder outlet obstruction on alpha1- and beta-adrenoceptor expression and function. Neurourol Urodyn. 28, 349-355 (2009).
- Maggi, C. A., Santicioli, P., Meli, A. Postnatal development of myogenic contractile activity and excitatory innervation of rat urinary bladder. The American journal of physiology. 247, 972-978 (1984).
- Ng, Y. K., de Groat, W. C., Wu, H. Y. Smooth muscle and neural mechanisms contributing to the downregulation of neonatal rat spontaneous bladder contractions during postnatal development. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 292, 2100-2112 (2007).
- Szell, E. A., Somogyi, G. T., de Groat, W. C., Szigeti, G. P. Developmental changes in spontaneous smooth muscle activity in the neonatal rat urinary bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 285, 809-816 (2003).
- Szigeti, G. P., Somogyi, G. T., Csernoch, L., Szell, E. A. Age-dependence of the spontaneous activity of the rat urinary bladder. J Muscle Res Cell Motil. 26, 23-29 (2005).
- Frazier, E. P., Braverman, A. S., Peters, S. L., Michel, M. C., Ruggieri, M. R. Does phospholipase C mediate muscarinic receptor-induced rat urinary bladder contraction. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 322, 998-1002 (2007).
- Xin, W., Soder, R. P., Cheng, Q., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Selective inhibition of phosphodiesterase 1 relaxes urinary bladder smooth muscle: role for ryanodine receptor-mediated BK channel activation. American journal of physiology. Cell physiology. 303, 1079-1089 (2012).
- Frazier, E. P., Peters, S. L., Braverman, A. S., Ruggieri, M. R., Michel, M. C. Signal transduction underlying the control of urinary bladder smooth muscle tone by muscarinic receptors and beta-adrenoceptors. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology. 377, 449-462 (2008).
- Svalo, J., et al. The novel beta3-adrenoceptor agonist mirabegron reduces carbachol-induced contractile activity in detrusor tissue from patients with bladder outflow obstruction with or without detrusor overactivity. European journal of pharmacology. 699, 101-105 (2013).
- Yokota, T., Yamaguchi, O. Changes in cholinergic and purinergic neurotransmission in pathologic bladder of chronic spinal rabbit. J Urol. 156, 1862-1866 (1996).
- Bayliss, M., Wu, C., Newgreen, D., Mundy, A. R., Fry, C. H. A quantitative study of atropine-resistant contractile responses in human detrusor smooth muscle, from stable, unstable and obstructed bladders. J Urol. 162, 1833-1839 (1999).
- Kullmann, F. A., McKenna, D., Wells, G. I., Thor, K. B. Functional bombesin receptors in urinary tract of rats and human but not of pigs and mice, an in vitro study. Neuropeptides. 47, 305-313 (2013).
- Sadananda, P., Kao, F. C., Liu, L., Mansfield, K. J., Burcher, E. Acid and stretch, but not capsaicin, are effective stimuli for ATP release in the porcine bladder mucosa: Are ASIC and TRPV1 receptors involved. European journal of pharmacology. 683, 252-259 (2012).
- Maggi, C. A., et al. Species-related variations in the effects of capsaicin on urinary bladder functions: relation to bladder content of substance P-like immunoreactivity. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology. 336, 546-555 (1987).
- Kullmann, F. A., et al. Effects of the 5-HT4 receptor agonist, cisapride, on neuronally evoked responses in human bladder, urethra, and ileum. Autonomic neuroscience : basic & clinical. 176, 70-77 (2013).
- Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Human tachykinin NK2 receptor: a comparative study of the colon and urinary bladder. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30, 632-639 (2003).
- Zoubek, J., Somogyi, G. T., De Groat, W. C. A comparison of inhibitory effects of neuropeptide Y on rat urinary bladder, urethra, and vas deferens. The American journal of physiology. 265, 537-543 (1993).
- Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationship of neurokinin A(4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the effect of amino acid substitutions on receptor affinity and function. Biochem Pharmacol. 63, 2181-2186 (2002).
- Warner, F. J., Mack, P., Comis, A., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationships of neurokinin A (4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the role of natural residues and their chirality. Biochem Pharmacol. 61, 55-60 (2001).
- Dion, S., et al. Structure-activity study of neurokinins: antagonists for the neurokinin-2 receptor. Pharmacology. 41, 184-194 (1990).
- Somogyi, G. T., Zernova, G. V., Yoshiyama, M., Yamamoto, T., de Groat, W. C. Frequency dependence of muscarinic facilitation of transmitter release in urinary bladder strips from neurally intact or chronic spinal cord transected rats. British journal of pharmacology. 125, 241-246 (1998).
- Andersson, K. E., Wein, A. J. Pharmacology of the lower urinary tract: basis for current and future treatments of urinary incontinence. Pharmacological reviews. 56, 581-631 (2004).
- D’Agostino, G., Condino, A. M., Gallinari, P., Franceschetti, G. P., Tonini, M. Characterization of prejunctional serotonin receptors modulating [3H]acetylcholine release in the human detrusor. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 316, 129-135 (2006).
- Hawthorn, M. H., Chapple, C. R., Cock, M., Chess-Williams, R. Urothelium-derived inhibitory factor(s) influences on detrusor muscle contractility in vitro. British journal of pharmacology. 129, 416-419 (2000).
- Chaiyaprasithi, B., Mang, C. F., Kilbinger, H., Hohenfellner, M. Inhibition of human detrusor contraction by a urothelium derived factor. J Urol. 170, 1897-1900 (2003).
- Testa, R., et al. Effect of different 5-hydroxytryptamine receptor subtype antagonists on the micturition reflex in rats. BJU international. 87, 256-264 (2001).
- Craggs, M. D., Rushton, D. N., Stephenson, J. D. A putative non-cholinergic mechanism in urinary bladders of New but not Old World primates. J Urol. 136, 1348-1350 (1986).
- Fry, C. H., Bayliss, M., Young, J. S., Hussain, M. Influence of age and bladder dysfunction on the contractile properties of isolated human detrusor smooth muscle. BJU international. 108, 91-96 (2011).
- Kennedy, C., Tasker, P. N., Gallacher, G., Westfall, T. D. Identification of atropine- and P2X1 receptor antagonist-resistant, neurogenic contractions of the urinary bladder. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 845-851 (2007).
- Levin, R. M., Danek, M., Whitbeck, C., Haugaard, N. Effect of ethanol on the response of the rat urinary bladder to in vitro ischemia: protective effect of alpha-lipoic acid. Molecular and cellular biochemistry. 271, 133-138 (2005).
- Malysz, J., Afeli, S. A., Provence, A., Petkov, G. V. Ethanol-mediated relaxation of guinea pig urinary bladder smooth muscle: Involvement of BK and L-type Ca2+ channels. American journal of physiology. Cell physiology. 306, 45-58 (2013).
- Longhurst, P. A., Briscoe, J. A., Rosenberg, D. J., Leggett, R. E. The role of cyclic nucleotides in guinea-pig bladder contractility. British journal of pharmacology. 121, 1665-1672 (1997).
- Takahashi, R., Yunoki, T., Naito, S., Yoshimura, N. Differential effects of botulinum neurotoxin A on bladder contractile responses to activation of efferent nerves, smooth muscles and afferent nerves in rats. J Urol. 188, 1993-1999 (2012).
- Sadananda, P., Chess-Williams, R., Burcher, E. Contractile properties of the pig bladder mucosa in response to neurokinin A: a role for myofibroblasts. British journal of pharmacology. 153, 1465-1473 (2008).
- Liu, G., Daneshgari, F. Alterations in neurogenically mediated contractile responses of urinary bladder in rats with diabetes. American journal of physiology. Renal physiology. 288, 1220-1226 (2005).
