Introduction
Reukzin is de primaire sensorische modaliteit in knaagdieren, zonder welke zij niet in staat zou zijn om succesvol te navigeren of te overleven in hun omgeving. Het is vooral van belang voor neonatale pups, die niet kan zien of horen tijdens de eerste postnatale week, om reuk gebruiken om hun moeder lokaliseren te voeden 1. Hierdoor kan neonatale pups ratten worden geconditioneerd om geuren eenvoudige experimentele manipulaties voorkeur. Een verscheidenheid aan stimuli zijn gebruikt als de ongeconditioneerde stimulus (UCS) naar geconditioneerde responsen op nieuwe geuren (geconditioneerde stimulus, CS) bij pasgeborenen, waaronder het nesten milieu 2,3, melk zogen 4-6, aaien of aanrakingen 7- induceren 12, staart knijpen 13, moeders speeksel 13, milde voet shock 14-18, en intracraniële hersenstimulatie 19. Deze studie maakt gebruik van een gevestigde vroege geur voorkeur paradigma waarbij een geur, in dit geval pepermunt, is gecombineerd met tactiele stimulatie om een voorkeur voor pepermunt 24 uur later 10,11,20 produceren. Deze geuren herinneringen zijn afhankelijk van intacte olfactorische circuits, voornamelijk met inbegrip van de olfactorische bollen (OB) 21-23 en de voorste piriformis cortex (APC) 24,25.
Experimenteel onderzoek van de vroege geur voorkeur leren hebben verdiept en verbreed ons begrip van de moleculaire en fysiologische onderbouwing van een zoogdier geheugen. Dit zoogdiermodel heeft verschillende voordelen bestuderen geheugenmechanismen. Ten eerste hebben de neurale bronnen van de UCS signaal geïdentificeerd. Verscheidene stimuli zoals hierboven vermeld stimuleren locus coeruleus noradrenaline afgifte 26, die op zijn beurt activeert meerdere adrenoceptoren in de OB en aPC, waardoor cellulaire en fysiologische effecten die ondersteunen leren 22,27,28. Tweede-geheugen ondersteunen mechanismen vinden plaats in goed gedefinieerde laminaire neurale structuren. Heteenvoud van de olfactorische circuits in neonatale ratten biedt onderzoekers met de ideale kader waarmee de ingewikkelde processen met betrekking tot de synaptische plasticiteit ontdekken. Olfactorische sensorische neuronen (OSN) in het reukepitheel project op mitralisklep / getuft cellen in de OB en deze mitralisklep / getuft cellen op hun beurt project ipsilateraal aan piriformis cortex (PC) via de laterale reukkanaal (LOT), onder andere structuren 29. Zowel de OSN synapsen in de OB 30,31 en de LOT synapsen 24,25 in aPC zijn geïdentificeerd als kritische loci voor synaptische veranderingen die ondersteunen het leren en het geheugen. Ten derde, in een vroege leeftijd bij ratten, olfactorische ingangen kunnen gemakkelijk worden gelateraliseerde. Elke aPC heeft toegang tot bilaterale geur van informatie via het voorste commissuur zodra deze witte stof wordt volledig gevormd op postnatale dag 12 (PD12) 32. Voordat PD 12, kan geur-ingang worden geïsoleerd om OB en APC ipisilateral door enkele naris occlusie 24,25,31,33,34 </ Sup>. Single naris occlusie maakt de geur vorming van het geheugen van de open naris, en voorkomt dat hetzelfde geheugen van de afgesloten naris voor PD 12 33. Geur geheugen is geïsoleerd aan de ipsilaterale hemisfeer met inbegrip van zowel OB en APC. Daarom kan elke pup rat zijn eigen controle voor het leren en de basis vormt fysiologie zijn.
In de huidige studie wordt de gelateraliseerde vroege geur voorkeur leren protocol geïntroduceerd. Deze methode dient als een krachtig instrument voor het bestuderen van de neurale mechanismen die ten grondslag liggen aan de geur leren door middel van een intra-dierlijke controle 24,25,31, waardoor zowel het aantal benodigde dieren en het grote variatie verminderen. Naris occlusie omkeerbaar, dat het vet of neus plug kan worden aangebracht en verwijderd met minimale stress of schade aan het dier. Hier, eerste, gedetailleerde procedures van vroege geur voorkeur training en testen worden beschreven, met een focus op de gelateraliseerde protocol met behulp van enkele naris occlusie met een nose stekker. Vervolgens resultaten worden om de effectiviteit van afzonderlijke Naris occlusie isoleren geur invoer en produceert gelateralizeerde geur geheugen tonen. Tot slot, de mogelijkheden van het gebruik van deze gelateraliseerde leermodel om fysiologische veranderingen in het olfactorische systeem dat zowel het genereren van leren en ondersteuning van het geheugen expressie te bestuderen worden besproken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sprague Dawley ratten (Charles River) pups van beide geslachten worden gebruikt. Nesten worden geruimd om 12 op PD1 (geboorte zijnde PD0). De dammen worden onderhouden op een 12 uur licht / donker cyclus met ad libitum toegang tot voedsel en water. Experimentele procedures zijn goedgekeurd door Institutional Animal Care Committee Memorial University.
1 Nose Plug Bouw
OPMERKING:. Deze procedure werd aangepast en gewijzigd van Cummings et al (1997) 35.
- Verzamelen van polyethyleen-20 buizen en 3-0 zijden hechtdraad.
- Snijd een klein stukje van polyethyleen-20 slang aan op ongeveer 0,8 mm.
- Thread zijden hechtdraad door de bereide buis zodat er draad aan weerszijden van het segment van de buis.
- Aan het ene uiteinde van de draad buiten de stekker, een knoop in de draad.
- Trek het gedeelte van slang naar beneden over de knoop in de draad. De knoop moet indienen in de slang.
- Snijd beide uiteinden van de draad zodat ~ 2 mm draad steekt vanaf een einde van de buis (zie figuur 1A).
2 Naris Occlusie voor Training
- Verwijder pup uit dam en plaats in een beveiligde schotel bedekt met gewone bedden.
- Gebruik watten toepassing plaatselijke verdoving gelei, 2% Xylocaine schar op naris worden afgesloten.
- Laat de pup uit te rusten in de schotel voor ~ 3 min.
- Houd de pup voorzichtig maar stevig in de niet-dominante hand.
- Met behulp van de dominante hand, pak een knijper op de neus en dep de zelfde plaatselijke verdoving gelei rond de punt van waaruit de draad niet uitsteekt. Deze zal fungeren als zowel een verdovingsmiddel voor eventuele kleine pijn geassocieerd met plug inbrengen en zal fungeren als een smeermiddel binnen de naris. OPMERKING: Het effect van Xylocaine begint binnen een paar minuten en duurt 20-30 minuten. Pups in het algemeen op een goede tolerantie voor plug inbrengen na xylocaine jelly applicatie (minimumprijs worstelen en stemgebruik).
- Steek voorzichtig de neus plug door stevig vasthouden van de pup en langzaam draaien van de plug met een zeer zachte duwt totdat de stekker volledig en alleen de 2 mm draad uitsteken van de naris (zie figuur 1B). Er mag geen bloeden van ofwel naris tijdens dit proces. Pups met bloeden tijdens de neus plug inbrengen zijn uitgesloten en keerde terug naar dammen
- Laat het dier tot rust in dit gerecht voor 5 min om wennen aan de stekker.
- Haal de pup uit de gewenning gerecht en beginnen de conditionering paradigma 24.
Figuur 1 Bouw van een knijper op de neus. A) Schema die de stappen van het maken van een neus plug. Een draad wordt getrokken door middel van polyethyleen buis; een knoop wordt gemaakt en pulleidde naar het midden van de buis te blokkeren; twee uiteinden zijn gesneden met een 2 mm residu in het ene uiteinde van de slang. B) Voor-en zijaanzicht van een rat met een knijper op de neus in een naris.
3 Scented Bedding Voorbereiding
- Het dragen van de nieuwe handschoenen en in een zuurkast te geur besmetting te voorkomen, plaatst 500 ml van structuurbehang beddengoed in een plastic zak.
- Gebruik een spuit met het opstellen van 0,3 ml pepermunt extract, en spuit dit over het beddengoed in de plastic zak.
- Bind de zak dicht, schud de zak krachtig, laat de bedden om te rusten in de zak gedurende 5 minuten.
- Plaats de geurende beddengoed in een heldere, ondiepe, acryl opleiding doos (20 x 20 x 5 cm 3, figuur 2A) ontdekt in een zuurkast voor 5 min voor gebruik. Zodra het beddengoed wordt bereid, gooi deze handschoenen, en niet toestaan dat deze handschoenen in contact komen met de dieren.
- Plaats de ongeparfumeerde beddengoed in een identieke doorzichtige plastic doos, en een eigente zorgen dat het niet in contact met de geurende beddengoed of gebruikte handschoen is gekomen.
4 Geur Conditioning Paradigm (zie foto in figuur 2A)
Pups ondergaan ofwel een enkele conditionering sessie, op PD 6 of meerdere proef-sessies (een sessie per dag, PD 3-6).
- Plaats de gewende pup op geurende beddengoed. Voor de controle op geur alleen (O / S -) pups, laat deze jongen op het beddengoed voor 10 minuten, daarna verder met stap 4.5. Voor experimentele geur + beroerte (O / S +) pups, blijven de volgende stappen in dit gedeelte.
- Stroke de pup gedurende 30 seconden met behulp van een klein penseel. Gebruik snelle cirkelvormige bewegingen in de eerste plaats rond de achterpoten regio van de pup.
- Laat de pup te rusten voor 30 sec.
- Herhaal de stappen 4.2 en 4.3 voor een totaal van 10 min (dus 10 paren van strelen + geur).
- Verwijder pup uit de doos conditioning, verwijder de knijper op de neus en de terugkeer van de pup naar de dam.
Testen gebeurt op verschillende tijdstippen (bijvoorbeeld 24 of 48 uur) na de laatste training. Het testen wordt uitgevoerd in een roestvrij stalen testkamer (30 x 20 x 18 cm3), die bovenop twee dozen training (training box wordt beschreven in 3.4), gescheiden door een 2 cm neutrale zone is geplaatst uitgevoerd. Een training doos bevat-pepermunt geurende beddengoed, terwijl de andere doos bevat schoon, ongeparfumeerde beddengoed. De vloer van de testkamer is een metalen rooster, dat vervolgens wordt afgedekt door een verwijderbaar vel van kunststof gaas (Figuur 2B).
- Bereid een pepermunt en een ongeparfumeerde beddengoed als per afdeling 3, en leg elk vak onder weerszijden van de testkamer, 2 cm van elkaar. Plaats de plastic gaas op de metalen-roostervloer van de testkamer.
- Haal de pup uit de dam en leg een stevige schar van geurloos silicone vet op de narisdat wordt afgesloten tijdens de training. Opnieuw toe te passen vet gedurende de eerste testprocedure als dat nodig is. OPMERKING: Random naris occlusie tijdens de training en het testen kan worden overwogen om vertekening te voorkomen.
- Plaats pup in de neutrale zone van de testkamer.
- Laat de pup naar de kamer te verkennen voor 1 min, het opnemen van hoe lang de pup bracht over de twee zijden van de kamer (dat wil zeggen meer dan pepermunt of neutraal geurende beddengoed).
- Laat de pup om te rusten gedurende 1 minuut in een afgedekte plastic houden kamer.
- Herhaal de stappen 5.2 en 5.3 voor een totaal van 10 min (dwz 5 testproeven gescheiden door 5 overige studies) schakelen van de eerste oriëntatie van de pup in de kamer om te controleren om leiding voorkeuren.
- Onmiddellijk na het testen, veeg het vet van de naris.
- Plaats een polyethyleen noseplug in de tegenovergestelde naris, overeenkomstig punt 2 en laat het dier om te rusten gedurende 10 minuten.
- Test de pup weer als in 5.3 -5.6, trek de stekker, en de terugkeer van de pup naar de dam. Verwijder en reinig de plastic gaas van de testkamer met 95% ethanol en laat de vloeistof te laten verdampen. Plaats het gaas terug voor het testen van de volgende pup.
LET OP: Het toepassen van siliconenvet op de eerste naris occlusie tijdens het testen voorkomt de kans op bloeden en stress in verband met de neus plug inbrengen.
Figuur 2 Vroege geur voorkeur training en testen. A) Vroege geur voorkeur training middels geur + strelen paradigma. B) Twee keuze geur voorkeur testen pepermunt beddengoed enerzijds controle ongeparfumeerde beddengoed aan de andere kant. Een 2 cm neutrale zone is geplaatst tussen.
6 Het testen van de effectiviteit van Single Naris Occlusie
nt '> Dit experiment werd uitgevoerd om te bepalen of enige naris occlusie leidt tot gelateralizeerde activatie van het olfactorische systeem.- Voeren eenzijdige naris afsluitingen op PD 6 of 7 pups zoals beschreven in paragraaf 2.
- Na ca. 5 min gewenning, plaatst de pup in een afgedekte plastic container en bloot aan 30 pi pure pepermuntolie gedrenkt in een stukje weefsel voor 10 min.
- Onmiddellijk na de pepermunt geur blootstelling, injecteer de pup intraperitoneaal (ip) met chloralhydraat (400 mg / kg) als een algemene verdoving, of pentobarbitol, (150 mg / kg).
- Eenmaal volledig verdoofd (geeft geen antwoord op de staart of voet knijpen), transcardially perfuseren de pup met ijskoude oplossingen zoutoplossing (0,9%) gedurende ~ 1 min, gevolgd door paraformaldehyde (4%, opgelost in 0,1 M fosfaatbuffer PBS ).
- Na 10 min paraformaldehyde perfusie, verzamel de hersenen en het in paraformaldehyde gedurende de nacht bij 4 ° C, daarna transfer de hersenen een sucrose-oplossing (20% in PBS) gedurende 24 uur.
- Snijd coronale plakjes hersenen bij 30 micrometer dikte met een cryostaat. Verzamel OB en PC plakken en monteren op gelatine gecoate glaasjes, gevolgd door standaard immunohistochemische kleuring voor pCREB antilichaam 21,25,30.
7 Toetsing van de omkeerbaarheid van de Single Naris Occlusie
Dit experiment test of het blokkerende effect is omkeerbaar bij 24 uur na verwijdering van de neus plug.
- Voeren eenzijdige naris afsluitingen op PD 6 of 7 pups zoals beschreven in paragraaf 2.
- Na 15 min (gelijk aan de duur van de naris occlusie tijdens de training - 5 min gewenning + 10 min training), verwijder de knijper op de neus, en de terugkeer van de pup naar de dam.
- 24 uur later, bloot de pup naar de pepermunt geur in een afgedekte plastic container gedurende 10 minuten zoals beschreven in 6.2.
- Volg dezelfde stappen in sekteionen 6,3-6,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier geven we een aantal van de eerder vastgestelde resultaten 24 de doeltreffendheid van de Naris occlusie isoleren geur ingang en leren een halfrond en de reversibiliteit van deze werkwijze tonen.
Single naris occlusie tijdens de vroege geur voorkeur opleiding leidt tot een gelateraliseerde geur geheugen 24. Het geheugen is beperkt tot de gespaarde naris (Figuur 3). Wanneer pups worden getest op geur voorkeur met dezelfde naris afgesloten als tijdens de training, ze tonen voorkeur voor de geconditioneerde geur (bijvoorbeeld pepermunt). Wanneer pups worden getest met het tegenovergestelde naris afgesloten, ze tonen geen voorkeur voor de geconditioneerde geur. Tezamen suggereren deze resultaten dat een geur voorkeur enkel-geheugen wordt gevormd uitgedrukt via gespaard naris dat de geur + aaien associatieve conditionering ondergaan.
Figuur 3 Single naris occlusie induceert gelateraliseerde geur leren. De gedrags-protocol wordt weergegeven in het bovenste paneel. Geur + streelde (O / S +) of geur alleen (O / S -) dieren met enkele naris afgesloten tijdens de training, onderging geur voorkeur testen eerst met dezelfde naris afgesloten dan met de tegenovergestelde naris afgesloten. Het onderste paneel toont het percentage van de tijd besteed aan over-pepermunt geurende beddengoed tussen de verschillende groepen in een twee keuze geur test. * P <0,05. Error bars, gemiddelde ± SEM. Overgenomen van Fontaine et al. J. Neuroscience (2013) met toestemming.
De gelateralizeerde geur trainingresultaten in gelateralizeerde activatie van het olfactorische systeem tijdens geur blootstelling (figuur 4) 24. Single naris occlusie verhindert activering van de OB en de PC van de ipsilaterale hemisfeer during blootstelling geur. Dit wordt aangetoond door het monitoren van CREB fosforylering in de OB, en de PC. Zoals getoond in figuur 4, middels immunohistochemie, gefosforyleerde CREB (pCREB) significant lager in de afgesloten hemisfeer na blootstelling pepermunt geur, vergeleken met de contralaterale hemisfeer gespaard. Nissl-kleuring (figuur 4A) toont vergelijkbare cellichamen in de mitrale cellaag van de OB en in de pyramidale cellaag van de PC of beide hersenhelften. Echter, pCREB aanzienlijk lager in beide cellagen in de ipsilaterale hemisfeer de afgesloten naris (Figuur 4B).
Figuur 4 Single naris occlusie resultaten in gelateraliseerde activering van het olfactorische systeem tijdens blootstelling geur. A) Nissl kleuring van het reukorgaan(OB) en de voorste piriformis cortex (APC). B) PCREB uitdrukkingen in de afgesloten en gespaard hemisferen na blootstelling pepermunt in een enkele naris afgesloten pup. Pijlen geven mitralisklep cellaag in de OB en piramidale cellaag in de APC-. Schaalbalken 500 urn. Overgenomen van Fontaine et al. J. Neuroscience (2013) met toestemming.
Het effect van een enkele proef (15-20 min) naris occlusie voorbijgaand en omkeerbaar en niet leidt tot zichtbare langere termijn neuronale schade die een veranderde geurwaarneming en verminderde neuronale activatie geuren leiden tijdens de test 24. Zoals geïndexeerd door pCREB kleuring in de OB en PC (figuur 5), pCREB uitdrukkingen mitrale cellen van de OB en de pyramidale cellen in de PC blootstelling geur vergelijkbaar tussen de afgesloten en gespaard hemisferen, 24 uur na verwijdering van de neus stekker - hetzelfde tijdstip dat de voorkeur testen geurwordt volgende vroege geur voorkeur training uitgevoerd.
Figuur 5 Beoordeling van neuronale reactiviteit volgende omkeerbare naris occlusie. PCREB kleuring van de OB en de APC, 24 uur na de verwijdering van een knijper op de neus in een pup. Pijlen geven mitralisklep cellaag in de OB en piramidale cellaag in de APC-. MCL, mitralisklep cellaag. PCL, piramidale cellaag. Schaalbalken, 500 urn lagere vergroting en 100 urn hogere vergroting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De gelateraliseerde geur leren en geheugen model in jonge ratten binnen een kritisch tijdsvenster werd voor het eerst vastgesteld door Hall en collega's. In een reeks van studies 33,34,36, ze toonden aan dat een geur voorkeur geheugen kon worden gelateraliseerde door geur + melk paringen om een naris bij PD 6 bij jonge ratten. Voorkeur geheugen was robuust als dezelfde naris was open tijdens de training en het testen, maar niet waargenomen wanneer de verstopte naris was gedeblokkeerd en getest. Echter, op PD 12, wanneer anterior commissural verbindingen van de voorste olfactorische cortex worden functionele 32, de ongeoefende naris alleen kon de expressie van de geur voorkeur verworven PD 6 Letsel van de voorste commissure herstelde de gelateralizeerde geheugen te ondersteunen zodat het niet meer bereikbaar vanaf de ongetrainde naris 33. Dit gelateraliseerde leermodel is succesvol gerepliceerd met een geur + streelde paradigma 24,25,31. Geur + streelde training met enkele naris occlusion op PD 6 leidt tot een gelateraliseerde geheugen op PD 7 31. Herhaalde enkele naris afsluitingen op PD 3-6 leidt tot een langere gelateraliseerde geheugen dat ten minste 48 uur 24 duurt.
De gelateraliseerde geur leren protocol resulteert in "split brain" in individuele dieren. Dit model heeft grote voordelen voor het bestuderen van het gedrag en de onderliggende bio-fysiologische veranderingen. Bijvoorbeeld, het vergelijken van gedrags-uitgangen met een binnen-subject model variaties in tussen-dierlijke ontwerpen voldoende vermindert. Pups in dit vroege leeftijd verschillen aanzienlijk in hun activiteiten en responsiviteit. Intra-dierlijke controle verwijdert de inherente variabiliteit van de prestaties en het reactievermogen evenals intrinsieke verschillen in de biologie van de beoordeling van de moleculaire en fysiologische veranderingen. Daarnaast biedt deze krachtige kind model van gelateraliseerde leren leent ons een kans om de individuele prestaties van het geheugen aan de individuele fysiologie betreffen, en Th beoordelene onderbouwing van herinneringen van verschillende duur 24,25,31. Met dit gelateralizeerde leren model in combinatie met ex vivo experimenten vergelijken de fysiologie van de twee hersenhelften in dezelfde dieren, is onlangs aangetoond dat vroege geur leren induceert synaptische plasticiteit zoals verhoogde AMPA receptor responsen bij synapsen in zowel de OB 31 en APC 24,25. Verbeterde synaptische transmissie volgende vroege geur leren zich vertaalt in een verbeterde productie in olfactorische netwerk vertegenwoordigingen 24.
Toekomstige studies moeten bestuderen de moleculaire onderbouwing van geur-geheugen met behulp van deze gelateraliseerde leermodel. Dit omvat correlationele studies kijken naar eiwitten en genen geactiveerd na het leren, en causale studies naar de effecten van de gain-of-function en verlies-van-functie van eiwitten en genen van bijzonder belang. Een spannende en belangrijke mogelijkheid is om in staat te zijn to betrekking fysiologische en moleculaire veranderingen in de sterkte van gedrags geheugen. Voor elke pup is het mogelijk om eerst leiden voorkeur memory maat voor de open en afgesloten neusgaten. Na ex vivo experimenten op de overeenkomstige getrainde en ongetrainde cortices zou verschaffen correlatieve fysiologische veranderingen. Het is echter mogelijk dat geur re-blootstelling bij voorkeur zelf testen zal synaptische sterkte veranderen, of dat andere hersengebieden bijdragen tot expressie geheugen. In onze huidige studies, worden de fysiologie en het gedrag uitgevoerd op afzonderlijke cohorten. Dit verwijdert de bezorgdheid over gedrags testen beïnvloeden van de zeer interessante parameters.
Een waarschuwing via neus stekker mogelijke neurale weefselbeschadiging die is geassocieerd met plug inbrengen en verwijderen. Om deze reden moet de zorg is genomen in het inbrengen van de knijper op de neus en de pups met bloeden tijdens het inbrengen moeten worden uitgesloten, om eventuele langere termijn ef voorkomenfecten geassocieerd met bloedingen, zoals ontsteking. Langdurige blokkering (uren, dagen tot maanden) van Naris of permanente verwijdering van reukepitheel leidt tot langdurige geur ontbering, zenuwbeschadiging en verminderde neuronale activiteiten in de OB en PC 37-41, hoewel sommige van deze effecten door langdurige naris occlusie volledig omkeerbaar 39,40. Tissue integriteit na acute occlusie naris (~ 15 min) werd bevestigd met immunohistochemie kleuring van pCREB, activiteit-afhankelijke neuronale merker, is aangetoond dat na 5 dagen naris occlusie 39 verlaagd in de PC van jonge volwassen muizen. pCREB niveaus in de ipsilaterale OB en PC van de afgesloten naris waren beduidend minder tijdens de blootstelling pepermunt geur, ter bevestiging van de succesvolle lateralisatie van olfactorische doorvoersnelheid bij jonge ratten tijdens naris occlusie. Echter, 24 uur na verwijdering van de neus plug, bij de geur voorkeur testen, de pCREB niveaus vergelijkbaar in beide hersenhelften, suggereert het effect van acute occlusie volledig reversibel 24. Daarom is het ontbreken van voorkeur om pepermunt getest met de eerder afgesloten naris is door gebrek aan geheugen, maar niet door een verandering of gebrek aan geurwaarneming verbonden weefselbeschadiging tijdens het testen. Bovendien elektrofysiologische opnames controle O / S - dieren (met een naris afgesloten tijdens blootstelling geur zonder strijken) verschilden niet het fEPSPs of het aantal geactiveerde piramidale cellen waargenomen met calcium imaging - ook bevestigd er geen functionele verandering in de piriformis cortex als gevolg van deze korte termijn omkeerbaar naris afsluitingen 24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polythylene 20 tubing | Intramedic | 427406 | Non-radiopaque, Non-toxic |
| 3-0 Silk suture thread | Syneture | Sofsilk | Non-absorbent |
| Silicone grease | Warner Instrument | 64-0378 | Odorless |
| 2% Xylocaine gel | AstraZeneca | Prod. No 061 | Lidocaine hydrochloride jelly, purchased at local pharmacy |
| Paint brush | Dynasty | 206R | Similar size/other brands work too |
| Peppermint extract | Sigma-Aldrich | W284807 | Other brands should be okay too |
| Training box | Custom-made | N/A | Acrylic box (20 x 20 x 5 cm3), see Figure 2A. Parameters and material for the box are not critical and can be modified. Material used should be odorless and does not absorb odors |
| Testing chamber | Custom-made | N/A | Stainless steel (30 x 20 x 18 cm3), see Figure 2B. Parameters and material for the chamber are not critical and can be modified. For example, an acrylic chamber instead of a stainless steel one can be used |
| pCREB antibody | Cell Signaling | 9198 | Ser 133 (87G3) Rabbit mAb |
| Chloral hydrate | Sigma-Aldrich | C8383 | N/A |
| Paraformaldehype | Sigma-Aldrich | P6148 | N/A |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | N/A |
References
- Gregory, E. H., Pfaff, D. W. Development of olfactory-guided behavior in infant rats. Physiol Behav. 6, 573-576 (1971).
- Alberts, J. R., May, B. Nonnutritive, thermotactile induction of filial huddling in rat pups. Dev Psychobiol. 17, 161-181 (1984).
- Galef, B. G., Kaner, H. C. Establishment and maintenance of preference for natural and artificial olfactory stimuli in juvenile rats. J Comp Physiol Psychol. 94, 588-595 (1980).
- Johanson, I. B., Hall, W. G. Appetitive learning in 1-day-old rat pups. Science. 205, 419-421 (1979).
- Johanson, I. B., Hall, W. G. Appetitive conditioning in neonatal rats: conditioned orientation to a novel odor. Dev Psychobiol. 15, 379-397 (1982).
- Johanson, I. B., Teicher, M. H. Classical conditioning of an odor preference in 3-day-old rats. Behav Neural Biol. 29, 132-136 (1980).
- McLean, J. H., Darby-King, A., Sullivan, R. M., King, S. R. Serotonergic influence on olfactory learning in the neonate rat. Behav Neural Biol. 60, 152-162 (1993).
- Moore, C. L., Power, K. L. Variation in maternal care and individual differences in play, exploration, and grooming of juvenile Norway rat offspring. Dev Psychobiol. 25, 165-182 (1992).
- Pedersen, P. E., Williams, C. L., Blass, E. M. Activation and odor conditioning of suckling behavior in 3-day-old albino rats. J Exp Psychol Anim Behav Process. 8, 329-341 (1982).
- Sullivan, R. M., Hall, W. G. Reinforcers in infancy: classical conditioning using stroking or intra-oral infusions of milk as UCS. Dev Psychobiol. 21, 215-223 (1988).
- Sullivan, R. M., Leon, M. Early olfactory learning induces an enhanced olfactory bulb response in young rats. Brain Res. 392, 278-282 (1986).
- Weldon, D. A., Travis, M. L., Kennedy, D. A. Posttraining D1 receptor blockade impairs odor conditioning in neonatal rats. Behav Neurosci. 105, 450-458 (1991).
- Sullivan, R. M., Hofer, M. A., Brake, S. C. Olfactory-guided orientation in neonatal rats is enhanced by a conditioned change in behavioral state. Dev Psychobiol. 19, 615-623 (1986).
- Camp, L. L., Rudy, J. W. Changes in the categorization of appetitive and aversive events during postnatal development of the rat. Dev Psychobiol. 21, 25-42 (1988).
- Moriceau, S., Wilson, D. A., Levine, S., Sullivan, R. M. Dual circuitry for odor-shock conditioning during infancy: corticosterone switches between fear and attraction via amygdala. J Neurosci. 26, 6737-6748 (2006).
- Roth, T. L., Sullivan, R. M. Endogenous opioids and their role in odor preference acquisition and consolidation following odor-shock conditioning in infant rats. Dev Psychobiol. 39, 188-198 (2001).
- Roth, T. L., Sullivan, R. M. Consolidation and expression of a shock-induced odor preference in rat pups is facilitated by opioids. Physiol Behav. 78, 135-142 (2003).
- Sullivan, R. M. Developing a sense of safety: the neurobiology of neonatal attachment. Ann N Y Acad Sci. 1008, 122-131 (2003).
- Wilson, D. A., Sullivan, R. M. Olfactory associative conditioning in infant rats with brain stimulation as reward. I. Neurobehavioral consequences. Brain Res Dev Brain Res. 53, 215-221 (1990).
- Sullivan, R. M., Wilson, D. A., Leon, M. Associative Processes in Early Olfactory Preference Acquisition: Neural and Behavioral Consequences. Psychobiology. , 29-33 (1989).
- McLean, J. H., Harley, C. W., Darby-King, A., Yuan, Q. pCREB in the neonate rat olfactory bulb is selectively and transiently increased by odor preference-conditioned training. Learn Mem. 6, 608-618 (1999).
- Sullivan, R. M., Stackenwalt, G., Nasr, F., Lemon, C., Wilson, D. A. Association of an odor with activation of olfactory bulb noradrenergic beta-receptors or locus coeruleus stimulation is sufficient to produce learned approach responses to that odor in neonatal rats. Behav Neurosci. 114, 957-962 (2000).
- Yuan, Q., Harley, C. W., McLean, J. H. Mitral cell beta1 and 5-HT2A receptor colocalization and cAMP coregulation: a new model of norepinephrine-induced learning in the olfactory bulb. Learn Mem. 10, 5-15 (2003).
- Fontaine, C. J., Harley, C. W., Yuan, Q. Lateralized odor preference training in rat pups reveals an enhanced network response in anterior piriform cortex to olfactory input that parallels extended memory. J Neurosci. 33, 15126-15131 (2013).
- Morrison, G. L., Fontaine, C. J., Harley, C. W., Yuan, Q. A role for the anterior piriform cortex in early odor preference learning: evidence for multiple olfactory learning structures in the rat pup. J Neurophysiol. 110, 141-152 (2013).
- Nakamura, S., Kimura, F., Sakaguchi, T. Postnatal development of electrical activity in the locus ceruleus. J Neurophysiol. 58, 510-524 (1987).
- Harley, C. W., Darby-King, A., McCann, J., McLean, J. H. Beta1-adrenoceptor or alpha1-adrenoceptor activation initiates early odor preference learning in rat pups: support for the mitral cell/cAMP model of odor preference learning. Learn Mem. 13, 8-13 (2006).
- Shakhawat, A. M., Harley, C. W., Yuan, Q. Olfactory bulb alpha2-adrenoceptor activation promotes rat pup odor-preference learning via a cAMP-independent mechanism. Learn Mem. 19, 499-502 (2012).
- Isaacson, J. S. Odor representations in mammalian cortical circuits. Curr Opin Neurobiol. 20, 328-331 (2010).
- Lethbridge, R., Hou, Q., Harley, C. W., Yuan, Q. Olfactory bulb glomerular NMDA receptors mediate olfactory nerve potentiation and odor preference learning in the neonate rat. PLoS One. 7, e35024 (2012).
- Yuan, Q., Harley, C. W. What a nostril knows: olfactory nerve-evoked AMPA responses increase while NMDA responses decrease at 24-h post-training for lateralized odor preference memory in neonate rat. Learn Mem. 19, 50-53 (2012).
- Schwob, J. E., Price, J. L. The development of axonal connections in the central olfactory system of rats. J Comp Neurol. 223, 177-202 (1984).
- Kucharski, D., Hall, W. G. New routes to early memories. Science. 238, 786-788 (1987).
- Kucharski, D., Johanson, I. B., Hall, W. G. Unilateral olfactory conditioning in 6-day-old rat pups. Behav Neural Biol. 46, 472-490 (1986).
- Cummings, D. M., Henning, H. E., Brunjes, P. C. Olfactory bulb recovery after early sensory deprivation. J Neurosci. 17, 7433-7440 (1997).
- Kucharski, D., Hall, W. G. Developmental change in the access to olfactory memories. Behav Neurosci. 102, 340-348 (1988).
- Brunjes, P. C. Unilateral odor deprivation: time course of changes in laminar volume. Brain Res Bull. 14, 233-237 (1985).
- Kass, M. D., Pottackal, J., Turkel, D. J., McGann, J. P. Changes in the neural representation of odorants after olfactory deprivation in the adult mouse olfactory bulb. Chem Senses. 38, 77-89 (2013).
- Kim, H. H., Puche, A. C., Margolis, F. L. Odorant deprivation reversibly modulates transsynaptic changes in the NR2B-mediated CREB pathway in mouse piriform cortex. J Neurosci. 26, 9548-9559 (2006).
- Korol, D. L., Brunjes, P. C. Rapid changes in 2-deoxyglucose uptake and amino acid incorporation following unilateral odor deprivation: a laminar analysis. Brain Res Dev Brain Res. 52, 75-84 (1990).
- Leung, C. H., Wilson, D. A. Trans-neuronal regulation of cortical apoptosis in the adult rat olfactory system. Brain Res. 984, 182-188 (2003).
